Summary
Det här protokollet beskriver den dissektion och immunfärgning av vuxen Drosophila melanogaster hjärnans vävnader. Specifikt, belyser detta protokoll användningen av Drosophila svamp kropp och ljusmätare nervceller som exempel neuronala delmängder som exakt kan användas till att avslöja de allmänna principerna för många aspekter av neuronal utveckling.
Abstract
Nervsystemet utveckling innebär en sekventiell serie händelser som samordnas av flera signalvägar och regleringsnät. Många av proteinerna som är involverade i dessa vägar är evolutionärt bevarade mellan däggdjur och andra Eukaryoter, såsom bananflugan Drosophila melanogaster, vilket tyder på att liknande organiserande principer finns under utvecklingen av dessa organismer. Ännu viktigare, har Drosophila använts i stor utsträckning att identifiera cellulära och molekylära mekanismer som reglerar processer som krävs i däggdjur inklusive neurogenes, differentiering, axonal vägledning och synaptogenes. Flugor har även använts framgångsrikt att modellera en mängd mänskliga nervsystemets sjukdomar. Här beskriver vi ett protokoll för den stegvisa lokalt, fixering och Immunofluorescerande lokalisering av proteiner inom den vuxna Drosophila -hjärnan. Detta protokoll fokuserar på två exempel neuronala populationer, svamp kroppens nervceller och näthinnans fotoreceptorer och innehåller valfria steg för att spåra enskilda svamp organ nervceller med hjälp av Mosaic analys med en Repressible Cell markör (MARCM)-teknik. Exempeldata från både vildtyp och muterade hjärnor visas tillsammans med en kort beskrivning av en poängkriterier för axonal vägledning defekter. Medan detta protokoll belyser två väletablerade antikroppar för att utreda morfologi av svamp kropp och ljusmätare nervceller, andra Drosophila hjärnregioner och lokalisering av proteiner inom andra områden i hjärnan kan också vara undersökt använder detta protokoll.
Introduction
Även om Drosophila nervsystemet är mindre än hos människa och gnagare, ger dess komplexitet en kraftfull, lättillgänglig modell för att bättre förstå dess ryggradsdjur motsvarigheter. I många fall koda genomen hos ryggradsdjur och flyger mycket liknande proteiner som dikterar mekanismerna i nervsystemet utveckling. I själva verket krävs många av generna som för neuronal utveckling hos ryggradsdjur har orthologs i flugor, inklusive de inblandade i signalvägar som kontroll mallning, neurogenes och axonal vägledning1,2,3 ,4,5. Netrin är exempelvis en ligand som krävs för axonal vägledning hos däggdjur och D. melanogaster6,7,8. Medan netrin isolerades ursprungligen från embryonala chick hjärnans vävnad6, har efterföljande studier visat att netrin en roll bevarade under utvecklingen av embryonala centrala nervsystemet (CNS) i Drosophila8. Andra studier har använt genetiska skärmar i den embryonala Drosophila CNS för att identifiera bevarade ligander och receptorer som krävs för pathfinding i både Drosophila och ryggradsdjur9.
Medan embryonala flugan CNS har använts flitigt i förflutnan för att identifiera ligander, receptorer och Intracellulär signalering proteiner krävs för axonal vägledning8,9, har senaste arbete undersökt sätt på vilket många av dessa proteiner styr också pathfinding beslut under senare stadier av utveckling. Specifikt, har utredning av svamp kropp (MB) och retinal ljusmätare neuron utveckling (figur 1) gett insikt om mekanismerna som kontroll pathfinding, synaps bildas, axon beskärning och flera andra aspekter av neuronala utveckling10,11,12,13,14,15,16,17. Ljusmätare nervceller ansluta flyga näthinnan till regioner i den vuxna hjärnan kallas lamina och medulla och är kritiska för återutläggning visuell information till hjärnan (Recenserad av18,19), medan svamp kropp nervceller är centralt beläget i flyga hjärnan och krävs för inlärning och minne20,21. Både ljusmätare nervceller och de inneboende nervcellerna svamp organ, kallas Kenyon celler, utnyttja evolutionärt bevarade diffusible och kontakt-beroende axonal vägledning mekanismer för att hitta sina efter synaptic mål. Förutom att vara synliga i vuxna flugor, kan ljusmätare och MB nervceller också direkt visualiseras i larver och puppor med antikroppar eller reporter gener22,23,24,25. Möjligheten att enkelt visualisera dessa två uppsättningar av nervceller vid olika utvecklande tidpunkter har främjat deras användning som fantastiskt modeller för många aspekter av neuronal utveckling.
Förutom som används som en modell för att förstå mekanismerna bakom normala nervsystemet utveckling, har nyligen genomförda studier visat att flugor kan också fungera som korrekta modeller av en mängd olika sjukdomar, inklusive bräckliga X syndrom (FXS)26 , Intellektuella funktionshinder (ID)27,28,29,30,31, och andra32. Exempelvis för att studera den molekylära funktionen av ZC3H14, en gen som nyligen kopplade till människors intellektuella funktionshinder, vi skapade en flyga modell av ID med en null-allelen av flugan ZC3H14 ortholog, kallas Nab230. Flugor som saknar Nab2 har svår minne nedskrivningar och utökade poly(A) svansar, går igenom vad observeras hos patienter eller patienten härrör cell linjer33,34. Ännu viktigare, Visa flugor som saknar Nab2 också svår hjärnans morfologi defekter i deras vuxna svamp organ34, liknar vad som observerats i flugor som saknar genen syndrom FXS, FMR135. Flugor kan således tjäna som ett viktigt modellerar organism att studera både hjärnans normala utveckling och sjukdomar som stör den.
Slutligen, tillgängligheten till hög genomströmning metoder för att övervaka beteendet, kombinerat med det stora utbud av tillgängliga genetiska verktyg, se Drosophila modellorganism i valet för att identifiera de områden i hjärnan som styr komplexa beteenden, såsom lärande och minne, sömn, uppvaktning, törst och andra36,37,38,39. Ett särskilt användbart verktyg som är i mitten av en flyga genetikers ”verktygslåda” är GAL4/UAS systemet (figur 2). Detta system40,41 använder vävnad specifika uttryck för Gal4 transkriptionell aktivator för att öka uttrycket av gener eller transgener nedströms av en uppströms aktivera sekvens (UAS). Ändringar av detta system har gjort det möjligt för forskare att, till exempel kontrollera exakt retbarhet av specifika nervceller42,43, overexpress eller knock-down specifika gener av intresse44, 45, analysera i realtid kalcium dynamics i vivo46och express reporter gener att markera neuronala härstamningar41. Kombinationen av GAL4/UAS systemet med mitotisk rekombination också möjliggjorde skapandet av mosaik analysen med en Repressible Cell markör (MARCM) systemet12,47. MARCM har använts flitigt i enda neuron spårning för att identifiera de cellulära signalering komponenter som krävs för axonal vägledning12,47. Även om dessa och andra tekniker har lämnat ett antal värdefulla insikter om de cellulära mekanismer som krävs för nervsystemets funktion, kräver de flesta att Drosophila hjärnan först vara dissekeras; noggrann borttagning av hjärnan krävs att behålla rätt hjärnans morfologi och anslutning mönster mellan regioner i hjärnan. Följande protokoll använder svamp kropp och ljusmätare nervceller somexempel neuronala populationer som guidar dig genom dissektion och Immunofluorescerande färgning av vuxen Drosophila brains.
Protocol
1. drosophila melanogaster genetik och tillval värme chock förfaranden
- En gång flugor har korsats och F1-avkomman har kläckts, få honor eller hanar av lämpliga genotyp. Beroende på hjärnregionen utreds, flugor bör samlas dagligen och åtskilda av kön så att åldersberoende eller könsdimorfisk mönster hjärnan anslutningsmöjligheter lättare kan urskiljas.
Obs: Tillval: om flugor som används för Mosaic analys med en Repressible Cell markör (MARCM) analys 12 , 47, embryon, larver eller puppor bör vara värme chockad vid 37 ° C i 30-45 min till inducera mitotisk rekombination. För att rikta specifika regioner svamp organ för MARCM analys, ska värme chock tajmas enligt schema fastställt 12 och beskrivs i figur 5 B. Om du använder MARCM för att undersöka hjärnregioner än svamp organ, bör pilotförsök utföras för att bestämma den optimala scenen vara värme-chockad. Medan stegen nedan skrivs med avseende på eclosed flugor, pharate vuxna kan också vara dissekeras med dessa steg när Pupp fallet har tagits.
2. Dissektion Station förberedelse
- Position den stereomikroskopet och ljus källa med ansluten fiber optic goosenecks på en stor bänkmonterade. Att främja stadig handrörelser och minska hand " skaka " medan dissekera, är det viktigt att det finns adekvat hand och arm resten utrymme runt mikroskopet. Säkerställa att det finns ungefär 8-10 tum på vardera sidan av Mikroskop och 4-6 inches mellan basen av Mikroskop och kanten av bänken.
- Fyllning 2 eller 3 brunnar i ett glas 9-väl eller 3-brunn skålen med 1,0 mL av PTN buffert (0.1 M natrium fosfatbuffert pH 7,2, 0,1% icke-jonaktivt ytaktivt ämne, se material tabell för komplett buffert komponenter) och placera bredvid dissekera stationen på is. Nyligen dissekerade hjärnor kommer att överföras till denna maträtt och lagras tills steget fixering.
- Obs: om levande imaging krävs, dissektion bufferten bör vara 1 x fosfat buffrad saltlösning (PBS) eller HL3 buffert 48. Om det krävs intracellulära protein lokalisering, kan PBS också användas som en alternativ buffert för dissektion och fixering. Efter fixering, permeabilisering av cellmembran bör då utföras med PTN tvättar som innehåller 0,1% eller 0,3% Nonjonaktivt rengöringsmedel.
- Om PBS används för dissektioner och fixering, pipettspetsar bör sköljas minst en gång med ett tvättmedel som innehåller buffert (såsom PTN) att förhindra hjärnor fastnar i plast pipettspetsar under överföring till mikrocentrifugrör.
- Med hjälp av en tom 35 mm glas eller plast petriskål, bygga en dissektion maträtt som innehåller en silikonelastomer. Kort, blanda elastomer komponenterna enligt tillverkaren ' s riktningar, häll i 35 mm rätter, och låt det polymerisera över natten på en plan yta. Elastomer som innehåller dissektion rätter bör användas för att skydda fina tips av dissekera pincetten, som kan lätt skadas om kontakt sker mellan Tången och en hårdare yta, till exempel en glasskål. Vi köper också regelbundet kommersiellt tillgängliga silikon belagda rätter från återförsäljare online. För att öka kontrast under dissektioner, silikon elastomer dissektion rätter som innehåller inaktiverade träkol (och således färgade svart) är särskilt användbara.
3. Vuxna hjärnan dissektion förfarande
- Anesthetize 3-5 dagars gamla vuxna D. melanogaster med CO 2 eller med is. Om du använder is, flyger plats injektionsflaskan med flugor uppochner (sätt änden ner) i en ishink för ~ 5 min. Placera injektionsflaskan i is uppochner förhindrar från att bli ingavs i maten. När flugorna har varit sövd, placera flugorna på en kall metall pad eller petriskål sittande i is eller på en CO 2 avger flyga pad. Om dissekera hjärnor för att analysera neurodegeneration, äldre flugor kan också användas.
- Placera en liten mängd (150-200 µL) av PTN i mitten av dissektion skålen med överföring pipett eller p200 pipett för att skapa en " bubbla " av PTN. Placera dissektion skålen under stereomikroskopet och justera belysningen och fokusera så att bubbla av PTN fyller synfältet och är jämnt upplyst.
- Manipulera flugor så att de är " mage upp " (dvs, ventrala sida upp) liggande på metallen eller CO 2 pad.
- Med ett par #5 pincett, ta tag i buken av en fluga att vara dissekeras och, att hålla tag i i farten, helt dränka det i PTN på dissektion skålen.
Obs: För återstoden av protokollet, alla åtgärder ska utföras medan huvudet är nedsänkt i PTN. - Använder ett par #5 pincett, ta tag basen av den flyga Snabel och dra de två par av tången isär för att lösgöra flyga huvudet från kroppen. Kassera buk och thorax. Under detta steg är det viktigt att huvudet inte är släppt och tillåtet att flyta på ytan av PTN. När huvudet är flytande, det kan vara mycket svårt att förstå igen utan att krossa hjärnan.
Obs: Med den här metoden, undertrckande anslutningar mellan hjärnan och ventrala nerv sladd. Om intakt anslutningar mellan dessa regioner av CNS krävs bör en alternativ dissektion protokoll, till exempel 49 , 50, följas. Om snabel lossnar från chefen fly innan huvudet tas bort, blir det ett hål där snabel var. I detta fall förstå flyga huvudet vid kanten av hålet nära ena ögat. Ta sedan bort huvudet med en måttlig mängd kraft samtidigt som du drar två parar av tången från varandra. Ibland när huvudet avlägsnas från kroppen, tarm och/eller ventrala nerv sladd resterna bifogas huvudet och bör tas bort innan du fortsätter dissektion. - Medan ett par pincett griper snabel, det andra paret bör förstå mediala kanten av just flyga ögat. Dra långsamt, tången från varandra. Detta steg bör utföras med en liten mängd stadig sidokraft. När tången långsamt flyttar från varandra, bör snabel dra bort från huvudet och skapa ett centralt hål i huvudet nagelbanden. Kassera snabel med det första paret tången utan att släppa den mediala delen av höger öga från det andra paret.
Obs: Vuxen D. melanogaster hjärnan är i den kaudala (dvs bakre/bakre) regionen av flyga huvudet. Således, greppa regionen av huvudet bör undvikas. Helst, bara den rostralt (dvs, front) del av huvudet nära mediala näthinnan bör röras direkt av tången. Hjärnan och associerade luftstrupen ska nu synas genom centrala hålet i nagelbanden. Vid denna tid, några vita trådiga trådar av luftstrupen sticker ut från hålet kan tas bort och kasseras. - Med det andra paret av tången, greppa den mediala kanten av vänster näthinnan (på kanten av den centrala hål i huvudet nagelbanden). Ta bort de näthinnor och associerade nagelband, långsamt dra tången ligger bredvid varandra i 180 ° vinkel. Som näthinnan dissocierar från den underliggande optic loben, bör du känna en liten minskning av spänningar. Gå långsamt att förhindra riva den optic loben.
Obs: Separera tången för snabbt under detta steg kan resultera i avrivningen av the optic LOB eller störningar av svamp kroppens strukturer. Ibland, fjällskiktet tas bort men bitar av näthinnan kommer att sitta kvar på optic LOB. Om imaging svamp organ, är det inte helt nödvändigt att ta bort hela näthinnan. Analys av andra regioner i hjärnan (t.ex. retinala neuron innervation av fiberoptiska hjärnan loberna) kan dock kräva näthinnan tas bort helt som beskrivs av 48 , 51.
Obs: Näthinnan är långsamt skild från den underliggande optic loben av hjärnan, den optiska loben bör vara observerbara som en ogenomskinlig vit struktur täckt med vit, trådiga luftstrupen. När en näthinnan har tagits bort, kan det kastas. När man analyserar pathfinding av retinala nervceller, försiktig särskilt under detta steg att förhindra skador på synnerven LOB. Ett tilläggsprotokoll fokuserade på dissektion och levande avbildning av ljusmätare nervceller är också tillgängliga 48. - Nu, ta försiktigt bort så mycket av synliga luftstrupen som möjligt. Luftstrupen kan redan innehålla eller senare fylla med luft, orsakar hjärnor att flyta och, eventuellt, förloras under senare immunfärgning steg. Ta bort luftstrupen, plocka bort hjärnan använder en mycket vass par #5 pincett.
- Ta bort återstående näthinnan och omgivande nagelbanden med båda paren av pincett för att förstå mediala regionen av vänster flyga näthinnan. Försiktigt riva näthinnan i hälften för att ta bort bitar av näthinnan och nagelband. I vissa fall bevisar ta bort återstående nagelbanden utan att krossa hjärnan särskilt utmanande. I dessa fall har vi funnit att de återstående delarna av den ventrala nerv sladden istället kan gripas av en par pincett medan den andra par pincett används för att ta försiktigt bort sist av nagelbanden.
- Med pipett p200 flytta dissekerade hjärnor till en brunn av 9 - eller 3-bra maträtt som innehåller PTN. Hjärnor av samma genotyp bör vara poolade tillsammans i samma väl och hållas på is. Hjärnvävnaden bör fastställas inom en timme av dissektion. Hjärnor kan fastställas i små partier och poolade krävs ett större antal hjärnor. I de flesta fall kan en erfaren forskare oftast dissekera en hjärna och överföra det till glas samling skålen i cirka 3-5 min.
4. Fixering och Immunofluorescerande färgning förfarande
- med p200 pipett överföra dissekerade hjärnor från 9-väl skålen till en 0,5 mL mikrocentrifug rör fyllda med 0,5 mL 4% PARAFORMALDEHYD utspätt i PTN. Minst 10-15 hjärnor av samma genotyp kan kombineras i en mikrocentrifug rör. Alla återstående steg (tills montering av hjärnor på diabilder) färdigställs i 0,5 ml mikrocentrifugrör.
FÖRSIKTIGHET: PARAFORMALDEHYD (PFA) bör hanteras i dragskåp. PFA avfall bör sparas och kasseras på rätt sätt. 20% PARAFORMALDEHYD köpt i glas ampuller kan vara aliquoted i mikrocentrifugrör och lagras vid-20 ° C tills behövs. - Inuti ett dragskåp, inkubera hjärnor i 4% PARAFORMALDEHYD i 20 min med långsam hastighet gunga i rumstemperatur.
- Efter fixering, tillåta hjärnor sedimentera till botten av röret mikrocentrifug självtryck.
Obs: Ibland hjärnor kan fastna vid sidan av mikrocentrifug röret. Om detta inträffar är det oftast bra till sido rotera röret mellan pekfingret och tummen eller mycket försiktigt tryck röret på bänken att främja förlisningen av hjärnor. - Ta bort fixativ använder en p1000 pipett och utför två " snabb " tvättar med 500 µL av PTN, vilket gör att hjärnan sedimentera till botten av mikrocentrifug röret mellan tvättarna. Under dessa snabb tvättar, när alla hjärnor har fast självtryck längst ned i mikrocentrifug röret, kan PTN omedelbart bytas mot färsk buffert; ingen ytterligare tvätt tid krävs.
Obs: Lämna extra buffert i röret är vanligtvis att föredra att riskera hjärnan borttagning. Noggrann undersökning av pipettspetsen krävs ofta för att säkerställa att ingen hjärna har tagits bort av misstag från röret. Om hjärnor har misstag pipetteras i spetsen, fördela dem tillbaka i mikrocentrifug röret, vänta för hjärnor sedimentera och fortsätt sedan att ta bort eventuella extra PTN som förblir. - Efter den sista snabba tvättningen, använda p1000 pipett för att utföra tre " lång " tvättar: Tillsätt 500 µL av PTN och tvätt för 20 min i rumstemperatur på en rocker/nutator. Alla framtida " lång " tvättar bör vara i 20 minuter.
Obs: Efter dessa tvättar, fast hjärnor kan komma att lagras över natten vid 4 ° C i PTN. - Ta bort den sista tvättningen med p1000 pipett och inkubera hjärnor på en rocker eller nutator vid rumstemperatur i 0,5 mL blockerar lösning [PTN + 5% normala get serum (NGS)] för minst 30 min i rumstemperatur.
- Get sekundära antikroppar kommer att användas i efterföljande protokollstegen. Om sekundära antikroppar från en annan art kommer att användas, normala serum från det arter (snarare än NGS) bör användas för blockering och antikropp lösningarna.
- Med p1000 pipett bort blockerande lösning och lägga till den primära antikroppen utspätt i PTN (PTN + 5% NGS + utspädda primär antikropp). När du använder en primär antikropp för första gången, optimal utspädning av att antikroppar bör bestämmas empiriskt.
Obs: För att visualisera svamp kroppens nervceller, antikroppar erkänner Fas2 vanligtvis används. Dessa antikroppar är tillgängliga från den utvecklande studier Hybridomteknik Bank (DSHB) som antikropp 1 d 4 och bör vara utspädd 1:20 i PTN + 5% NGS.
Obs: För att visualisera ljusmätare nervceller, antikroppar erkänner chaoptin används normalt. Chaoptin antikroppar är tillgängliga från DSHB som antikropp 24B10 och bör vara utspädd 1:20 i PTN + 5% NGS.
Obs: Fixering processen vanligtvis eliminerar fluorescens från fluorescerande protein såsom grönt fluorescerande protein (GFP). Därför, när du använder MARCM för att analysera axonal vägledning av enskilda MB nervceller, använda en antikropp erkänner GFP. - Inkubera hjärnor i primär antikropp lösning på en rocker/nutator 2-3 nätter på 4 ° C.
- Efter inkubation med primära antikroppar, tillåta hjärnor att bosätta sig i mikrocentrifug rörets botten och sedan ta bort primär antikropp lösningen.
- Med pipett p1000 utföra 2 " snabb " tvättar och 3 " lång " 20 min tvättar med 0,5 mL av PTN som beskrivs ovan i steg 4.4 och 4.5, noggrant så att brains för att kvitta självtryck längst ned i mikrocentrifug röret mellan varje wash.
- Inkubera hjärnor för 3 h vid rumstemperatur med lämpligt fluorescently-märkt sekundära antikroppar. Sekundära antikroppar är oftast utspädd i 0,5 mL PTN + 5% NGS vid en koncentration på 1: 200.
Obs: När fluorescerande sekundära antikroppar har lagts till, hjärnor bör hållas i mörkret för återstoden av experimentet.
Obs: I fallet kvarstående god Jordbrukarsed fluorescens förblir, när du utför MARCM analys det är tillrådligt att använda en sekundär antikropp märkt med en fluorophore med liknande excitation/utsläpp våglängder som GFP (t.ex., Fluoroscein isothyocyanate (FITC) eller Alexa488). - Efter sekundär antikropp inkubation, tillåta hjärnor att bosätta sig i mikrocentrifug rörets botten och ta bort sekundär antikropp lösningen.
- Utför 2 " snabb " tvättar och 3 " lång " 20 min tvättar med 0,5 mL av PTN som beskrivs ovan i steg 4.4 och 4.5, noggrant så att brains för att kvitta längst ned i mikrocentrifug röret mellan varje wash.
- Efter tredje " lång " 20 min tvätt, användning p200 pipett ta bort så mycket buffert som möjligt.
- Lägga till 75 µL av fluorescerande anti fade monteringsmedium till hjärnan. Pipett hjärnor och monteringsmedium i pipettspetsen en gång att blanda. Inte Invertera röret eftersom hjärnor kan fastna på cap eller sidor av röret mikrocentrifug.
Obs: Efter upphävande av hjärnor i monteringsmedium, rör kan vara insvept i aluminiumfolie att sakta fluorophore snabbkylning och lagras vid 4 ° C över natten. Om nödvändigt, hjärnor kan förvaras i flera dagar vid 4 ° C, men bör helst monteras på bilder så snart som möjligt.
5. Montering vuxen D. melanogaster hjärnor på mikroskopet glider och Imaging
- bygga en " bro " bild. Placera två " bas " coverslips ungefär 1 cm mellanrum på en positivt laddad bild. Se till att den positivt laddade sidan av bilden är vänd uppåt. Följa coverslips till bild med nagel polska som visas i figur 3 A. Det är oftast bra att försegla varje bas täckglas med nagel polska att säkerställa montering media inte veken under dessa bas täckglas tre yttre kanter. Låt Nagel polska torka ordentligt (10-15 min) innan du fortsätter.
- Placera bilden under stereomikroskopet och Pipettera montering media lösningen innehållande dissekerade hjärnor i mellanrummet mellan de två coverslips. För att ge mer kontrast, det är användbart att manövrera svanhals lamporna så att de är parallella med arbetsbänk.
- Ta bort extra montering media från bilden med pipett, vara noga med att inte Pipettera hjärnor utanför bilden.
- Wick bort extra montering media. Detta gör att hjärnan kan placeras närmare under nästa steg.
- Med hjälp av ett par pincett och stereomikroskopet, placera hjärnor på bilden i ett rutmönster med antennal lober inför uppfostras
- Placera ett täckglas (den " bron ") över hjärnor ( figur 3 A). Använd Nagel polska för att täta sidorna av bron cover slip där de kontakta den " bas " täckglas.
- Med pipett p200 sakta fylla center hålrummet under bron med färska montering media ( figur 3 B). Placera en droppe i taget på den öppna kanten av det center täckglaset och tillåta montering media att veken under det center bridge täckglaset. Fortsätt tills hela hålrummet fylls med montering media, och sedan försegla toppen och botten med tydlig Nagel polska.
- När den Nagel polskt är torr, bild bilder omedelbart eller förvara i en ljustäta snäva bild låda vid -20 ° C.
- Inom en vecka, bild hjärnor med laserskanning confocal Mikroskop med excitation lasrar och filtrera kuber lämpligt att de valda fluorescerande sekundära antikropparna. Z-stack bilder av svamp kropp nervceller erhålls vanligtvis använder 20 X eller 40 X mål. Avbildning av retinal ljusmätare nervceller kan kräva högre förstoring.
Representative Results
Den ovan beskrivna metoden möjliggör tillförlitliga och reproducerbara visualisering av valfri region av hjärnan som vuxen Drosophila . Här har vi fokuserat på svamp organ och ljusmätare nervceller, men andra studier har använt liknande metoder för att visualisera hjärnregioner som pars intercerebralis52, klocka nervceller53,54, och antennal LOB projektion nervceller55, bland många andra. Ännu viktigare, kan denna teknik användas för att visualisera hela hjärnstrukturer såväl som enskilda nervceller inom dessa strukturer med hjälp av tekniker såsom MARCM12,47. Figur 4och figur 5 figur 6 visar flera olika typer av data från svamp organ och ljusmätare nervceller i vuxna hjärnor som kan genereras med hjälp av denna dissektion och immunfärgning teknik.
Först, den ovan beskrivna metoden kan användas för att direkt visualisera svamp kropp morfologi med antingen antikroppar som känner igen Fasciculin 2 (Fas2) eller reporter gener uttrycks i svamp kropp nervceller34. Som visas i figur 4A och figur 4B, Fas2 antikroppar kan användas för att visualisera α, β, och (i mindre utsträckning) γ lober i svamp kroppar i vuxen Drosophila brains. Fas2 är ett cell-cell adhesion protein krävs för neuron fasciculation och uttrycks på höga nivåer i α och β lober23,56,57, vilket gör det en tillförlitlig och väletablerade markör för dessa svamp kroppens nervceller. Särskilt, kan runda ellipsoid kroppen ligger i de centrala delarna av den vuxna hjärnan också visualiseras med hjälp av denna antikropp (figur 4A).
Defekter i axonal vägledning proteiner orsakar ofta ofullständigt penetrant svamp kropp mutant fenotyper15,34,35. Därför, i de flesta fall, flera dussin hjärnor bör avbildas och analyseras. Exempelvis cross svamp kropp β LOB axoner av Nab2 null flugor olämpligt hjärnan mittlinjen. Denna ”crossing over” eller β LOB ”fusion” fenotyp är vanligtvis observeras i ~ 80% av vuxen Nab2 null flugor men är främst frånvarande från vildtyp kontroller och kan klassificeras som liten, måttlig eller slutföra fusion34. ”Fusion” av β lober över mittlinjen resultat från felaktiga kontralaterala projektionen av axoner i den motsatta hjärnhalvan. Som visas i figur 4C och detaljerad i34,35, refererar liten fusion till β lober ansluten av en ”tunn hårslinga Fas2-positiv fibrer”, medan måttlig fusion avser mer väsentligt anslutna β lober som visar en något minskad LOB tjocklek vid mittlinjen. Komplett (eller ”extrema”) fusion refererar till β lober som är helt anslutna och visar ingen minskning LOB tjocklek eller Fas2 färgning vid mittlinjen. Omfattningen av svamp kropp β LOB fusion kan kvantifieras och visas som visat i 34,35 eller som en tabell som visar procentandelen av hjärnor visar varje typ av morfologi defekt.
Förutom färgning med Fas2 antikroppar, kan MARCM teknik12,47,48 också användas att visualisera axon vägledning beslut av enskilda GFP+ nervceller inom svamp kropp loberna. MARCM använder tredjeparts mitotisk rekombination under utveckling för att skapa enskilda nervceller eller närbesläktade grupper av nervceller, märkt med GFP (figur 5A). MARCM ger ett sätt att generera ett litet antal nervceller som helt saknar ett protein inom en annars heterozygot fluga. Som sådan, har denna teknik varit särskilt användbar i att analysera proteiner som är också viktiga för övergripande organismers livskraft12,47axonal vägledning funktioner. Homozygot null nervceller markerade med GFP kan jämföras direkt för att styra nervceller märkta med god Jordbrukarsed i en vildtyp genetiska bakgrund. Dessutom, beroende på när utveckla larver eller puppor är värme-chockad, olika klasser av svamp kropp nervceller kan vara riktade (figur 5B).
Ett exempel på typ av data som genereras med den här tekniken visas i figur 5C, där vildtyp (dvs.kontroll) MARCM kloner genereras som ett exempel. För att generera de enskilda GFP+ svamp kropp nervceller visas i figur 5C, utveckla F1 inkvarterades larver initialt vid 25 ° C. Cirka 5-6 dagar efter larver kläckning (ALH), puppor var värme chockad under 30 minuter vid 37 ° C och återvände sedan till 25 ° C tills eclosion. Efter vuxen kläckning, hjärnor var dissekeras i PTN, fast och samtidigt inkuberas med antikroppar som erkänner Fas2 (1 d 4, utspädd 1:20 i PTN) och god Jordbrukarsed (utspädd 1: 500 i PTN). Hjärnor var sedan inkuberas med sekundära antikroppar och monterad på diabilder som beskrivs ovan. GFP+ celler identifierades och avbildas med laserskanning confocal Mikroskop och maximal intensitet prognoser har skapats med ImageJ. Vilket visas i figur 5C, kontroll GFP+ nervceller genereras i α och β loberna colocalize med Fas2 och avsluta innan du kontaktar mittlinjen som separerar de två hjärnhalvorna Drosophila . En enda axon projekt anteriorly, bifurcates, och sedan projekt både dorsalt och medialt till formen av α och β lober. Flera tidigare studier har använt denna teknik för att undersöka huruvida vissa proteiner är skyldiga att studera celldelning självständigt för många aspekter av axonogenesis, inklusive förlängning, pathfinding, förgrening eller beskärning10, 11,12,13,14,15,16,17,34.
Förutom svamp organ, kan retinal ljusmätare nervceller (R-celler) axonal pathfinding beslut också visualiseras med dissektion metoden som beskrivs ovan (liksom av dissektion metod debeskrivs i referens48). Varje ommatidia inom flyga ögat innehåller 8 ljusmätare nervceller som kan delas in i tre grupper (figur 1): R1-R6 celler, som projektet axoner till den ytliga lamina av hjärnan optic LOB; R7 celler, som projektet axoner i djupare M6-skiktet av medulla; och R8 celler, som projektet axoner i det mellanliggande M3 skiktet av de medulla19,58. Projektion mönstret för varje klass av ljusmätare har studerats ingående och tillsammans dessa nervceller framgångsrikt har använts som en modell för att förstå signalvägar som är inblandade i axon vägledning19,59. Ännu viktigare, alla ljusmätare axoner kan enkelt visualiseras i dissekerade Drosophila hjärnor genom immunfärgning av vuxen, Pupp, eller larvformer vävnader med hjälp av en antikropp som känner igen chaoptin, en cell surface glykoprotein24, 60 , 61. reporter gener uttrycker GFP eller β-galaktosidas i varje R-celltyp (R1-R6 och R7 R8 celler) har också byggts och kan användas för att visualisera varje klass av ljusmätare62. Eftersom varje typ av R-cell avslutas i ett annat lager av utveckla optic LOB, tillåtit dessa reportrar för detaljerade jämförelser av de signalvägar som krävs för varje celltyp korrekt hittar sitt mål. Ett exempel på uttrycksmönster produceras av två av dessa reporter gener i kombination med chaoptin lokalisering (som kan användas som markör för alla ljusmätare neuroner) visas i figur 6. För att visualisera R7 fotoreceptorer, var hjärnor innehållande R7-specifika Rhodopsin4-Lindholm reporter genen dissekeras och färgas med antikroppar mot chaoptin- och β-galaktosidas. Rhodopsin 4 (Rh4) uttrycks specifikt i en delmängd av R7 celler63; Rh4 arrangören kan därför användas för att köra reporter genuttryck i endast dessa celler. Som förväntat, avsluta R7 celler i djupare M6 lagret av medulla (betecknas med en gul streckad linje diagram 6). Likaså hjärnor uttrycker β-galaktosidas från Promotorn Rhodopsin 6 (Rh6), som uttrycks specifikt i R8 fotoreceptorer63, var dissekeras och immunostained med antikroppar som känner igen chaoptin och Β-galaktosidas. I figur 6visas R8 fotoreceptorer avslutas på R3 lagret av denmedulla. Även om inte visas här, kan Rh1-Lindholm också användas att visualisera uppsägning av R1-R6 fotoreceptorer i lamina.
Figur 1: Vuxen Drosophila melanogaster hjärnan består av funktionellt distinkta men sammankopplade regioner. (A), en disposition av den vuxna D. melanogaster hjärnan visas, belyser de centralt belägna svamp organ och perifera retinal ljusmätare nervceller. (B) förstorad diagram över vuxna svamp kroppen axon buntarna (även kallade lober) som är erkända av Fas2 antikroppar. Den inneboende nervceller svamp organ, kallas Kenyon celler, projektets axoner anteriorly från dorsalt ligger cell organ (cell organ utelämnas från detta diagram) och bildar distinkta LOB strukturer. I den vuxna hjärnan, γ lober (visas i rött) form från en enda mediala bunt axoner, medan den dorsala α och mediala β lober (visas i blått) form från en enda axon som bifurcates under processen pathfinding. Α ' / β' nervceller utveckla axonal lober som delvis överlappa dem av α/β nervceller, men inte erkänns av Fas2 antikroppar och utelämnas från detta diagram. (C) retinala nervceller är kritiska i förmedling av visuell information från näthinnan på optic LOB. Axoner projektet från cellen organ ligger i näthinnan (beige) och form anslutningar med efter synaptic målceller i lamina eller medulla. R1-R6 ljusmätare celler (visas i rött) formulär specifika anslutningar med celler i det yttre lagret av optic LOB, kallas lamina. R7 ljusmätare celler (gul) synaps med mål i medulla, M6 lager medan R8 celler (visas i grönt) projektet axoner till M3 något mer ytliga lagret av medulla. Del C anpassas genom tillstånd av Macmillan Publishers Ltd: Nature Neuroscience (referera64, copyright (2011)). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: The GAL4/UAS systemet kan användas för riktade genuttryck. För att få flugor att uttrycka en gen av intresse (”genen X”) i ett specifikt mönster för vävnad, måste flugor innehålla både en transgenens uttrycker proteinet Gal4 transkriptionell aktivator under kontroll av en vävnad specifika förstärkare och en transgene som innehåller Gal4 DNA bindande sekvens (kallas uppströms aktivera sekvens eller UAS) intill genen X. vanligtvis, denna kombination uppnås genom parning föräldrarnas flugor att varje innehålla en transgen och välja för F1 avkomma som innehåller båda. I den resulterande F1 generationen, Gal4 kommer att uttryckas och binder till UAS aktivera transkription av genen X i en vävnad specifika sätt. Ännu viktigare, kan olika UAS-innehållande transgener användas i kombination med den samma GAL4 ”driver”. Exempelvis kan en transgene som uttrycker Gal4 i svamp organ (MBs) kombineras med ett UAS-innehållande transgenens express GFP, en transgene som knackar down uttryck för en gen av intresse med hjälp av RNA-interferens eller ett UAS-transgene som producerar en reporter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Montering av hjärnor som förberedelse för immunofluorescens imaging. (A) hjärnor är monterade på SuperFrost Plus diabilder med en bro täcka att förhindra tillplattning av hjärnor. Två ”base” täckglas följs en Superfrost Plus positivt laddade bild med tydlig Nagel polska och dissekerade hjärnor placeras sedan i bilden dem emellan. En tydlig ”bro” täckglas är placerad ovanför hjärnor och följas i bas täckglas. (B) en gång Nagel lacket har torkat, Vectashield är långsamt pipetteras under bron att bevara fluorescensen av sekundär antikropp. Tydlig Nagel polska används sedan för att försegla toppen och botten av ”bron” cover slip. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Svamp kropp axoner kan visualiseras tydligt med antikroppar som känner igen Fas2. (A) vuxen Drosophila hjärnor var dissekeras, fast och inkuberas med antikroppar som erkänner Fas2. Primära antikroppar kunde identifieras med hjälp av Alexa488-kopplade get-anti-mus sekundära antikroppar och hjärnor var monterade på positivt laddade bilder och avbildas med hjälp av en laser skanning confocal Mikroskop. Bisymmetrically ligger svamp body cell organ utöka axoner anteriorly, dela i två grenar och bilda axon buntar (även kallade lober). Axoner som bildar dorsalt-projicera α lober och medialt utskjutande β lober express Fas2. Kritiskt, avsluta β lober av vildtyp flugor innan hjärnan mittlinjen. Centralt belägna ellipsoid kroppen kan också visualiseras använder 1 d 4 antikropp. (B) den medialt utskjutande γ LOB axoner av vuxen Drosophila svamp kroppen också uttrycka Fas2 och kan visualiseras använder 1 d 4 antikropp. Uttrycket av Fas2 i γ LOB axoner brukar mindre än α och β lober. (C), svamp kroppen axoner av Nab2-null hjärnor (genotyp: Nab2ex3/Nab2ex3) mis projekt contralaterally och saknar ofta lober. Nab2 är null hjärnor var dissekeras, fixeras och färgas med 1 d 4 antikropp att visualisera svamp kropp α, β och γ lober. Maximal intensitet Z-stack prognoser samt som enskilda optiska avsnitt fokuserade på mittlinjen regionen visas. Medan vildtyp svamp kropp β LOB axoner korsar sällan hjärnan mittlinjen, har Nab2-null hjärnor varierande mängder av mis projektion över mittlinjen i den kontralaterala hjärnhalvan, vilket resulterar i ”smält” β lober. Enligt definitionen i referenser34,35, mild fusion refererar till < β lober med endast flera ”delar” av axoner korsar mittlinjen, måttlig fusion avser situationer där Fas2 positiva β LOB nervceller korsar den hjärna mittlinjen men β loben bredd vid mittlinjen är minskade, och komplett fusion avser situationer där det finns ingen minskning av β LOB tjocklek som loberna cross hjärnan mittlinjen. Eftersom ellipsoid kroppen uttrycker också Fas2, optisk sektioner visar mittlinjen är ofta mer användbar visualisera β LOB fusion. Särskilt, observeras också ofta saknas lober (betecknas här med vit asterisk). Data i del C används i kvantifiering av svamp kropp fenotyper från referens34, med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : MARCM kan användas för att visualisera axoner av enstaka nervceller. (A) Mosaic analys med en Repressible Cell markör (MARCM) använder FLP recombinase-medierad mitotisk rekombination vid FRT platser att skapa två distinkta dottercellerna. I det här exemplet innehåller alla celler en svamp kropp-specifika GAL4 protein på en separat kromosom. Efter mitotisk rekombination under celldelningen, en dotter cell (överst) uttrycker GFP (eller membranet bunden CD8-GFP) och innehåller två muterade alleler av en gen av intresse, medan den andra dotter cellen (nederst) ärver två vildtyp (WT) alleler och en transgenens uttrycker proteinet Gal80 använder en tubulin promotor. Gal80 hämmar Gal4, så att alla celler som producerar Gal80 kommer att vara icke-fluorescerande och bör vara antingen heterozygot eller homozygot vildtyp. Endast i de celler som är GFP+ innehåller två kopior av den muterade allelen. Observera att endast en av flera metoder för att generera god Jordbrukarsed+ celler som också innehåller två muterade alleler av en gen av intresse visas; Se12,45,56 för andra exempel. (B) eftersom utvecklingen av svamp kropp nervceller börjar med γ nervceller, sedan α'/ β' nervceller, och slutar med α/β nervceller, varje klass av neuron kan selektivt riktade och visualiseras av värme chockerande vid olika utvecklande tidpunkter. Som beskrivs i 12, en 40 min värme chock vid 37 ° C som uppstår ≤2.5 dagar efter larver kläckning (ALH) vänder sig särskilt γ; nervceller, medan värme chock som inträffar 3,5-4,5 dagar ALH (i den sena larvstadium L3) kommer att rikta α'/ β' nervceller, och en värme chock att o ccurs mellan 5-7 dagar ALH (under Pupp utveckling) kommer att rikta α/β nervceller. (C) enskilda vildtyp axoner var visualiserat med MARCM. Vildtyp ~ 5-6 dag gammal puppor (genotyp: hsFLP, UAS-CD8-GFP; FRT82B, UAS-CD8-GFP/FRT82B, Bubbelbad > Gal80; OK107-GAL4/+) chockades värme vid 37 ° C i 40 min att inducera mitotisk rekombination. Hjärnor var dissekeras, fixeras och färgas med antikroppar som erkänner GFP (1: 500) och Fas2 (1:20). Hjärnor var sedan inkuberas med fluorescently märkta sekundära antikroppar och visualiseras av konfokalmikroskopi. I detta exempeldata från en ”kontroll” genotyp, GFP positiva celler genereras med hjälp av MARCM är vildtyp och i stället för som innehåller två genmut alleler, innehåller två genWT alleler. Svamp kropp β lober (visualiseras med hjälp av antikroppar erkänner Fas2) avsluta innan de når hjärnan mittlinjen; Det finns också α LOB nervceller. Om du vill visa mer detaljerat, visas en zoomad med tanke på en enda hjärnhalvan i den nedersta raden av bilder. Del C anpassades med tillstånd från referens34. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Ljusmätare axoner kan också visualiseras. Vuxen brains uttrycker β-galaktosidas i R7 fotoreceptorer (vänster, använder Rh4-Lindholm) eller R8 fotoreceptorer (höger, använder Rh6-Lindholm) var dissekeras, fast och inkuberas med antikroppar som erkänner β-galaktosidas eller chaoptin. Hjärnor var sedan inkuberas med fluorescently märkta sekundära antikroppar och visualiseras av laserscanning konfokalmikroskopi. Enda optiska avsnitten visas från varje hjärna. Till vänster, kan flera R7 ljusmätare axoner (pilar) ses i djupare M6 lagret av medulla (visas med den gula streckade linjen). På höger avsluta R8 ljusmätare axoner (pilar) i det yttre M3 lagret av medulla (visas med den gröna streckade linjen). Eftersom R7 fotoreceptorer express antingen Rh3 eller Rh4 och R8 fotoreceptorer express antingen Rh5 eller Rh663, kan inte alla R7 eller R8 fotoreceptorer visualiseras med hjälp av en enda Lindholm reporter gen. Skala barer = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Dissektion och visualisering metoden som beskrivs ovan kan användas i en mängd olika immunfärgning och leva bildhanteringsprogram. Vi har skisserat ett allmänt immunfärgning protokoll och har belyst ett sätt där MARCM kan användas för att visualisera axonal morfologi av enskilda svamp organ nervceller. Dessutom, dessa allmänna förfaranden kan också användas för imaging andra regioner i hjärnan i fasta eller nymalen dissekerade vuxen brains48,65. Levande imaging kan ge en effektivare strategi när man analyserar uttrycksmönster enhancer fällor, reporter gener eller härma linjer66, t.ex. Att förhindra att fånga artefakter från celldöd under levande avbildning av GFP i ofixerad vävnad, hjärnor bör dissekeras i 1 x fosfat buffrad saltlösning (PBS) eller HL3 media48, monterad på bron diabilder i 1 x PBS (eller HL3) och avbildas i mindre än 15-20 min. vård bör också tas bort så mycket luft som möjligt från dissekerade hjärnan före imaging, eftersom det kan störa visualisering av GFP fluorescens.
Medan färgning villkor vid bedömningen av morfologi av svamp kropp och ljusmätare nervceller är förhållandevis väletablerade24,61,67, lokalisering av ett specifikt protein av intresse i dessa cell typer kan kräva omfattande felsökning och optimering. I synnerhet bör flera kritiska steg, inklusive antikropp utspädning, blockerande buffert komponent koncentration och fixering, optimeras för att generera de mest reproducerbara och pålitliga resultat. Först, den optimala koncentrationen av primär antikropp bör fastställas. Även om kommersiellt tillgängliga antikroppar har ofta en föreslagna utspädning (och vi startar ofta initialt med att koncentration), är dessa värden sällan utifrån empiriskt Drosophila vävnader. Därför testning av en serie av primär antikropp utspädningar som utbud över och under tillverkarens start förslag ofta resulterar i mer specifik färgning. Medan primär antikropp utspädning kan ha en betydande inverkan på färgning noggrannhet och bör fastställas exakt, tid hjärnor inkuberas i primär antikropp innehållande kan lösningar variera avsevärt med liten effekt på det totala resultatet. Exempelvis har vi observerat liknande resultat när ruvning dissekerade hjärnor med Fas2 antikropp primära antikroppen för två, tre eller ännu fyra dagar vid 4 ° C. Även om vi rekommenderar minst två nätter, har vi också inkuberas hjärnor i primär antikropp lösning för en enda natt och erhålls reproducerbara färgning. Ännu viktigare, att begränsa mängden tid hjärnor inkuberas i den sekundära antikroppen i 3 timmar vid rumstemperatur (eller en natt vid 4 ° C) bidrar till gräns icke-specifik bindning av sekundära antikroppar att hjärnvävnaden.
Andra, kan det vara nödvändigt att använda ytterligare ”blockering” reagenser för att eliminera oönskad bakgrund signal. Alternativ inkluderar öka koncentrationen av NGS ~ 10%, att lägga till 1-10% bovint serumalbumin (BSA) den blockerande och primär/sekundär antikropp lösningar, eller före adsorption av primära antikroppar övernattning på 4 ° C med Drosophila embryon (se referera till68, avsnitt 2.9, steg 3).
Medan vi har skrivit det ovanstående protokoll använder PTN som det föreslagna buffert för alla fixering, kan tvätta, och antikropp inkubationsstegen, vävnad fixering i andra buffertar (såsom PLP och PEM, i Material tabell) leda till djupgående skillnader i signalstyrka. Till exempel har tidigare studier visat att cyklin E är omätbara i larval imaginal skivor när vävnader är i traditionella 4% PARAFORMALDEHYD utspätt i PBS, men syns tydligt när vävnader är i PLP buffert (Ken Moberg, personliga kommunikation och referens69). Förutom förändringar i buffert komponenter, ändring av tid och temperatur för vävnaden fixering kan också påverka Immunofluorescerande färgning och empiriskt kan bestämmas om det behövs. Generellt fixering tid bör vara tillräckligt lång för att möjliggöra tillräcklig crosslinking av cellulära komponenter och långsiktigt underhåll av övergripande cellulära morfologi samtidigt begränsas tillräckligt för att förhindra över-crosslinking och ”begrava” av protein epitoper. Därför när du initialt optimerar färgning villkor för en nyförvärvade primär antikropp, vi brukar begränsa fixering tid till ca 20 min och kommer ofta fixa vävnader vid kallare temperaturer.
Flera kontroller bör ingå i någon immunofluorescens-experiment för att undersöka specificiteten av primära och sekundära antikroppar samt effekten av transgener/genetiska bakgrunden på den observerade fenotypen. För att få klarhet i huruvida den primär antikropp används specifikt känner igen proteinet av intresse bör vävnad från flugor saknar detta protein och/eller vävnad överuttryck av proteinet inkluderas som kontroller. Tillägg av överskjutande renat antigen protein kan också ingå för att avgöra om den primär antikroppen känner igen andra epitoper i flyga hjärnan. Slutligen representerar någon närvarande när primära antikroppar utelämnas fluorescerande signal nivån på icke-specifik bindning av de valda sekundära antikropparna.
Flera viktiga kontroller bör också ingå för att utvärdera bidraget av genetisk bakgrund eller förekomsten av transgener till färgning intensitet eller neuronala morfologi. De flugor som används i MARCM experimentet i figur 5 innehåller exempelvis flera transgener (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, bubbelpool > GAL80 och OK107-GAL4), som alla bör analyseras separat för effekter på svamp kropp morfologi. På ett minimum, svamp kropp morfologi av flugor bör som innehåller både OK107-GAL4 och UAS-CD8-GFP analyseras. Det kan också vara nödvändig för att bedöma effekten av värme chock och Flp recombinase produktion på svamp kropp utveckling genom att analysera flugor som innehåller både hsFLP och FRT82B. Även om MARCM kan ge betydande insikt om ett visst protein autonomt styr axonal vägledning, kan antalet kontroller som krävs för att korrekt göra denna slutsats vara en mindre begränsning av denna teknik. I mindre komplicerade experiment är liknande kontroller också tillämpliga. Ta till exempel ett experiment där GAL4/UAS systemet används i kombination med en RNAi transgenens knockdown uttryck av ett protein av intresse för alla nervceller. I detta experiment, minst två transgener kommer att närvara: en pan-neuronal GAL4 förare, såsom elav-GAL4, och den UAS-RNAi transgenens. Morfologi av svamp kropp nervceller i flugor som innehåller var och en av dessa transgener ensam bör utredas förutom det experimentella villkor där flugor harbor båda transgener i samma fluga.
Slutligen, för att avgöra huruvida proteinet av intresse uttrycks i svamp kropp nervceller är det oftast nödvändigt att samtidig fläcken hjärnor med antikroppar mot Fas2. Alternativt kan fluorescerande proteiner som GFP, RFP eller membranet bunden CD8-GFP också uttryckas med hjälp av GAL4/UAS -systemet och används i kombination med antikroppar som känner igen proteinet av intresse. Eftersom Fas2 erkänner bara fasciculated axoner som bildar svamp kropp α och β loberna, har användning av GAL4-driven, membran-bundna CD8-GFP varit särskilt användbar för märkning svamp kroppens nervceller.
Defekter i axonal vägledning ofta inte är 100% penetrant och även hjärnor av samma genotyp kan visa vissa variabilitet. Därför, när analysera nyligen genererade muterade alleler för defekter i svamp kropp eller ljusmätare pathfinding, en kombination av olika alleler och metoder bör användas. De flesta studier i litteraturen använder flera olika metoder för att undersöka huruvida ett protein har en cell-självständiga roll i kontrollen av axonal vägledning: jag) analys av pathfinding defekter i homozygot null flugor (helst med olika null alleler), ii) analys av pathfinding defekter i flugor som saknar proteinet av intresse endast i nervceller (oftast via RNAi), iii) MARCM analys av pathfinding defekter, och iv) rädda experiment där genen är åter uttryckt i nervceller i homozygot null flugor. Helst bör flera dussin hjärnor per genotyp analyseras för fel i neuronala morfologi.
Även om protokollet beskrivs här främst fokuserar på Immunofluorescerande lokalisering av proteiner inom fasta vävnad, utvecklas flera framtida tillämpningar av denna teknik till bild levande hjärnvävnad. När hjärnan är dissekerade (vanligen i cell kultur media), kan de sedan vara odlade i flera dagar vid 25 ° C. Dessa ex vivo culturing metoder utvecklas för att undersöka en mängd biologiska processer, såsom protein-aktivitet som främjar axon regeneration efter skador70,71, intracellulära signalering dynamics72, och neuronal utveckling73.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Changhui Pak och Alysia Vrailas Mortimer för initialt undervisning SMK hjärnan dissektion tekniken. Vi tackar också medlemmar i Ken Mobergs lab gruppen, särskilt Chris rundor, för att kritiskt läsa manuskriptet. Antikroppar som erkänner Fas2 (1 d 4) och chaoptin (24B10) erhölls från utvecklande studier Hybridomteknik banken. Antikropp 24B10 sattes till DSHB av Seymour Benzer och Nansi Colley24,60,61, antikropp 1 d 4 deponerades till DSHB av Corey Goodman 22,23,56. Flyga bestånd erhölls från Bloomington lager Center. Vi vill också tacka Ohio jordbruksforskning och utveckling Center (OARDC) MCIC Imaging Center för användning av mikroskopet confocal till bild hjärnor i figur 4A och B. SMK stöds av ett bidrag från NICHD (1 R15 HD084241-01A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdissection forceps/tweezers | Ted Pella | 505-NM | |
| Sylgard dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S-BLK | Available from amazon.com |
| Fas2 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 | |
| Chaoptin Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
| GFP Antibody | Aves Lab | GFP-1010 | |
| Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody | ThermoFisher | A-11039 | |
| Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody | ThermoFisher | A-21236 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscope Services | RT15713 | |
| VectaShield | Vector Labs | H-1000 | |
| SuperFrost Plus Slides | ThermoFisher | 99-910-01 | |
| Coverslips | ThermoFisher | 12-553-454 | |
| Na Phosphate Buffer monobasic | Sigma | S3139 | |
| Na phosphate Buffer dibasic | Sigma | S3264 | |
| Triton X 100 | Sigma | X100-100ml | |
| fingernail polish | Electron Microscope Services (EMS) | 72180 | |
| stereomicroscope | Leica S6D with KL300 LED light source | ||
| 9-well dish (spot plate) | VWR | 89090-482 | |
| nutator/rocker | Fisher | 22-363-152 or 88-861-041 | |
| 35mm dish | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Sylgard | Fisher | 50-366-794 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potential Fixation Buffers | |||
| PTN Buffer | 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed | ||
| PLP buffer | 2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O | ||
| PEM buffer | 0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Stocks available from Bloomington | |||
| elav (c155)-GAL4 | BL458 | Pan-neuronal GAL4 driver | |
| w*;;;OK107-GAL4 | BL 854 | GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome) | |
| y(1), w(67c23); c739-GAL4 | BL 7362 | GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome) | |
| y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP | BL 64305 | GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP | |
| w*; 201Y-GAL4 | BL 4440 | GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome) | |
| y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP | BL 64296 | GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP | |
| w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO | BL 5145 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome | |
| w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP | BL5146 | MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome | |
| y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4 | BL 44408 | MARCM stock for flipping 3rd chromosome | |
| y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub>GAL80;OK107-GAL4 | BL44406 | MARCM stock for flipping 2nd chromosome | |
| w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4 | BL 44407 | MARCM stock for flipping X chromosome | |
| y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO | BL 5137 | GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein) | |
| y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP | BL 5139 | MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome | |
| y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO | BL 28832 | MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome | |
| w*; FRTG13, Tub>GAL80 | BL 5140 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome | |
| y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80 | BL 5135 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome |
References
- Reichert, H. Evolutionary conservation of mechanisms for neural regionalization, proliferation and interconnection in brain development. Biol Lett. 5 (1), 112-116 (2009).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat Rev Neurosci. 11 (7), 514-522 (2010).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Oortveld, M. A., et al. Human intellectual disability genes form conserved functional modules in Drosophila. PLoS Genet. 9 (10), 1003911 (2013).
- Sanchez-Soriano, N., Tear, G., Whitington, P., Prokop, A. Drosophila as a genetic and cellular model for studies on axonal growth. Neural Dev. 2, 9 (2007).
- Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Harris, R., Sabatelli, L. M., Seeger, M. A. Guidance cues at the Drosophila CNS midline: identification and characterization of two Drosophila Netrin/UNC-6 homologs. Neuron. 17 (2), 217-228 (1996).
- Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
- Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (3), 001743 (2010).
- Hattori, D., et al. Dscam diversity is essential for neuronal wiring and self-recognition. Nature. 449 (7159), 223-227 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Reynaud, E., et al. Guidance of Drosophila Mushroom Body Axons Depends upon DRL-Wnt Receptor Cleavage in the Brain Dorsomedial Lineage Precursors. Cell Rep. 11 (8), 1293-1304 (2015).
- Reuter, J. E., et al. A mosaic genetic screen for genes necessary for Drosophila mushroom body neuronal morphogenesis. Development. 130 (6), 1203-1213 (2003).
- Ng, J. Wnt/PCP proteins regulate stereotyped axon branch extension in Drosophila. Development. 139 (1), 165-177 (2012).
- Lai, Y. W., et al. Drosophila microRNA-34 Impairs Axon Pruning of Mushroom Body gamma Neurons by Downregulating the Expression of Ecdysone Receptor. Sci Rep. 6, 39141 (2016).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Borst, A., Helmstaedter, M. Common circuit design in fly and mammalian motion vision. Nat Neurosci. 18 (8), 1067-1076 (2015).
- Clandinin, T. R., Zipursky, S. L. Making connections in the fly visual system. Neuron. 35 (5), 827-841 (2002).
- Schurmann, F. W. Fine structure of synaptic sites and circuits in mushroom bodies of insect brains. Arthropod Struct Dev. 45 (5), 399-421 (2016).
- Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
- Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7929-7933 (1982).
- Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes. Cell. 36 (1), 15-26 (1984).
- Wan, L., Dockendorff, T. C., Jongens, T. A., Dreyfuss, G. Characterization of dFMR1, a Drosophila melanogaster homolog of the fragile X mental retardation protein. Mol Cell Biol. 20 (22), 8536-8547 (2000).
- Androschuk, A., Al-Jabri, B., Bolduc, F. V. From Learning to Memory: What Flies Can Tell Us about Intellectual Disability Treatment. Front Psychiatry. 6, 85 (2015).
- Bolduc, F. V., Tully, T. Fruit flies and intellectual disability. Fly (Austin). 3 (1), 91-104 (2009).
- van der Voet, M., Nijhof, B., Oortveld, M. A., Schenck, A. Drosophila models of early onset cognitive disorders and their clinical applications. Neurosci Biobehav Rev. 46, Pt 2 326-342 (2014).
- Pak, C., et al. Mutation of the conserved polyadenosine RNA binding protein, ZC3H14/dNab2, impairs neural function in Drosophila and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12390-12395 (2011).
- Gatto, C. L., Broadie, K. Drosophila modeling of heritable neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 21 (6), 834-841 (2011).
- van Alphen, B., van Swinderen, B. Drosophila strategies to study psychiatric disorders. Brain Res Bull. 92, 1-11 (2013).
- Kelly, S. M., et al. A conserved role for the zinc finger polyadenosine RNA binding protein, ZC3H14, in control of poly(A) tail length. RNA. 20 (5), 681-688 (2014).
- Kelly, S. M., et al. The Drosophila ortholog of the Zc3h14 RNA binding protein acts within neurons to pattern axon projection in the developing brain. Dev Neurobiol. 76 (1), 93-106 (2016).
- Michel, C. I., Kraft, R., Restifo, L. L. Defective neuronal development in the mushroom bodies of Drosophila fragile X mental retardation 1 mutants. J Neurosci. 24 (25), 5798-5809 (2004).
- Yamamoto, D., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat Rev Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Busto, G. U., Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L. Olfactory learning in Drosophila. Physiology (Bethesda). 25 (6), 338-346 (2010).
- Ueno, T., et al. Identification of a dopamine pathway that regulates sleep and arousal in Drosophila. Nat Neurosci. 15 (11), 1516-1523 (2012).
- Vogelstein, J. T., et al. Discovery of brainwide neural-behavioral maps via multiscale unsupervised structure learning. Science. 344 (6182), 386-392 (2014).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Hodge, J. J. Ion channels to inactivate neurons in Drosophila. Front Mol Neurosci. 2, 13 (2009).
- Neumuller, R. A., Perrimon, N. Where gene discovery turns into systems biology: genome-scale RNAi screens in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 471-478 (2011).
- Ni, J. Q., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
- Seelig, J. D., et al. Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior. Nat Methods. 7 (7), 535-540 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), (2011).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (12), 1472-1474 (2011).
- Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
- Liu, Y., Liao, S., Veenstra, J. A., Nassel, D. R. Drosophila insulin-like peptide 1 (DILP1) is transiently expressed during non-feeding stages and reproductive dormancy. Sci Rep. 6, 26620 (2016).
- Shafer, O. T., Helfrich-Forster, C., Renn, S. C., Taghert, P. H. Reevaluation of Drosophila melanogaster's neuronal circadian pacemakers reveals new neuronal classes. J Comp Neurol. 498 (2), 180-193 (2006).
- Rieger, D., Shafer, O. T., Tomioka, K., Helfrich-Forster, C. Functional analysis of circadian pacemaker neurons in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 26 (9), 2531-2543 (2006).
- Hillebrand, J., et al. The Me31B DEAD-Box Helicase Localizes to Postsynaptic Foci and Regulates Expression of a CaMKII Reporter mRNA in Dendrites of Drosophila Olfactory Projection Neurons. Front Neural Circuits. 4, 121 (2010).
- Goodman, C. S., Davis, G. W., Zito, K. The many faces of fasciclin II: Genetic analysis reveals multiple roles for a cell adhesion molecule during the generation of neuronal specificity. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 479-491 (1997).
- Fushima, K., Tsujimura, H. Precise control of fasciclin II expression is required for adult mushroom body development in Drosophila. Dev Growth Differ. 49 (3), 215-227 (2007).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Hadjieconomou, D., Timofeev, K., Salecker, I. A step-by-step guide to visual circuit assembly in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 76-84 (2011).
- Van Vactor, D. Adhesion and signaling in axonal fasciculation. Curr Opin Neurobiol. 8 (1), 80-86 (1998).
- Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human. Cell. 52 (2), 291-301 (1988).
- Tahayato, A., et al. Otd/Crx, a dual regulator for the specification of ommatidia subtypes in the Drosophila retina. Dev Cell. 5 (3), 391-402 (2003).
- Cook, T., Desplan, C. Photoreceptor subtype specification: from flies to humans. Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).
- Hakeda-Suzuki, S., et al. Goal collaborates with Flamingo in conferring synaptic-layer specificity in the visual system. Nat Neurosci. 14 (3), 314-323 (2011).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
- Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
- Crittenden, J. R., Skoulakis, E. M., Han, K. A., Kalderon, D., Davis, R. L. Tripartite mushroom body architecture revealed by antigenic markers. Learn Mem. 5 (1-2), 38-51 (1998).
- Muller, H. A. Immunolabeling of embryos. Methods Mol Biol. 420, 207-218 (2008).
- Baker, N. E., Li, K., Quiquand, M., Ruggiero, R., Wang, L. H. Eye development. Methods. 68 (1), 252-259 (2014).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
- Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 575-597 (2012).
- Tomchik, S. M., Davis, R. L. Dynamics of learning-related cAMP signaling and stimulus integration in the Drosophila olfactory pathway. Neuron. 64 (4), 510-521 (2009).
- Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
