Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Published: November 6, 2017 doi: 10.3791/56174
Automatic Translation
1,2, 3, 2,3
1Program in Neuroscience, The College of Wooster, 2Department of Biology, The College of Wooster, 3Program in Biochemistry, Cellular, and Molecular Biology, The College of Wooster

Summary

Denne protokol beskriver dissektion og immunfarvning af voksen Drosophila melanogaster hjernen væv. Specifikt, fremhæver denne protokol brugen af Drosophila champignon krop og fotoreceptor neuroner som eksempel neuronal delmængder, der præcist kan bruges til at afdække generelle principper ligger til grund for mange aspekter af neuronal udvikling.

Abstract

Nervesystemet udvikling indebærer en Sekventiel serie af begivenheder, der koordineres af flere signaling veje og regulerende net. Mange af de proteiner involveret i disse veje er evolutionært bevaret mellem pattedyr og andre eukaryoter, såsom bananfluen Drosophila melanogaster, tyder på, at lignende organisering principper findes under udviklingen af disse organismer. Vigtigere, har Drosophila været udbredt at identificere cellulære og molekylære mekanismer regulere processer, der kræves i pattedyr, herunder neurogenese, differentiering, cytoskeletale vejledning og synaptogenesis. Fluer har også været anvendt med succes til at modellere en række menneskelige udviklingsforstyrrelser sygdomme. Her beskriver vi en protokol for en trinvis microdissection, fiksering og immunfluorescent lokalisering af proteiner i voksen Drosophila hjernen. Denne protokol fokuserer på to eksempel neuronal populationer, champignon krop neuroner og retinal fotoreceptorer, og indeholder valgfrie trin for at spore individuelle champignon krop neuroner ved hjælp af Mosaic analyse med en teknik, Repressible celle markør (MARCM). Eksempeldata fra både vildtype og mutant hjerner er vist sammen med en kort beskrivelse af en scoring kriterier for cytoskeletale vejledning defekter. Mens denne protokol fremhæver to veletablerede antistoffer for at undersøge morfologi af champignon krop og fotoreceptor neuroner, andre Drosophila hjerneregioner og lokalisering af proteiner inden for andre områder af hjernen kan også være undersøgt ved hjælp af denne protokol.

Introduction

Selvom Drosophila nervesystemet er mindre end mennesker og gnavere, giver dens kompleksitet en kraftfuld, imødekommende model for bedre at forstå dens hvirveldyr modparter. I mange tilfælde indkode genomer af hvirveldyr og fluer meget lignende proteiner, der dikterer mekanismerne af nervesystemet udvikling. I virkeligheden, kræves mange af generne, der for neuronal udvikling i hvirveldyr har orthologs i fluer, herunder dem, der er involveret i signaling veje at kontrol mønstre, neurogenese og cytoskeletale vejledning1,2,3 ,4,5. For eksempel, er netrin en ligand kræves cytoskeletale vejledning i pattedyr og D. melanogaster6,7,8. Mens netrin blev oprindeligt isoleret fra embryonale chick hjernen væv6, har efterfølgende undersøgelser vist, at netrin spiller en bevaret rolle under udviklingen af embryonale centralnervesystemet (CNS) i Drosophila8. Andre undersøgelser har brugt genetiske skærme i den embryonale Drosophila CNS til at identificere bevarede ligander og receptorer kræves for pathfinding i både Drosophila og hvirveldyr9.

Mens den embryonale flyve CNS har været udbredt i fortiden for at identificere ligander, receptorer og intracellulær signalering proteiner kræves for cytoskeletale vejledning8,9, har seneste arbejde undersøgt måder, som mange af disse proteiner også styre pathfinding beslutninger under senere stadier af udvikling. Specielt, har undersøgelsen af champignon krop (MB) og retinal fotoreceptor neuron udvikling (figur 1) givet indblik i mekanismerne at kontrol pathfinding, synapse dannelse, axon beskæring og flere andre aspekter af neuronal udvikling10,11,12,13,14,15,16,17. Fotoreceptor neuroner tilsluttes regioner i den voksne hjerne kaldet lamina flyve nethinden og medulla og er kritisk for genudlægning visuel information til hjernen (anmeldt af18,19), mens champignon krop neuroner er centralt beliggende i flyve hjernen og er nødvendig for indlæring og hukommelse20,21. Både fotoreceptor neuroner og de iboende neuroner champignon organer, kaldet Kenyon celler, udnytte evolutionært bevarede diffusible og kontakt-afhængige cytoskeletale vejledning mekanismer for at finde deres post synaptic mål. Ud over at være synlig i voksne fluer, kan fotoreceptor og MB neuroner også direkte visualiseres i larver og pupper med antistoffer eller reporter gener22,23,24,25. Mulighed for at nemt visualisere disse to sæt af neuroner på forskellige udviklingsmæssige tiden point har fremmet deres brug som fantastiske modeller for mange aspekter af neuronal udvikling.

Ud over bliver brugt som en model til at forstå mekanismerne af normale nervesystem udvikling, har de seneste undersøgelser vist, at fluer kan også fungere som nøjagtige modeller af en bred vifte af sygdomme hos mennesker, herunder skrøbelige X syndrom (FXS)26 , Intellektuelle handicap (ID)27,28,29,30,31, og andre32. For eksempel, for at studere den molekylære funktion af ZC3H14, et gen for nylig forbundet med menneskets intellektuelle handicap, vi skabt en flyve model af ID'ET ved hjælp af en null allel af flue ZC3H14 ortholog, kaldet Nab230. Fluer mangler Nab2 har alvorlige hukommelse funktionshæmninger og udvidet poly(A) haler, recapitulating hvad er observeret i menneskelige patienter eller patienten afledt celle linjer33,34. Vigtigere, vise fluer mangler Nab2 også alvorlige hjerne morfologi defekter i deres voksne champignon organer34, svarende til hvad er observeret i fluer mangler FXS syndrom gen, FMR135. Således kan fluer tjene som en vigtig model organisme at studere både normal hjernens udvikling og sygdomme, der forstyrrer det.

Endelig, tilgængelighed af høj overførselshastighed metoder til at overvåge adfærd, kombineret med det enorme opbud af tilgængelige genetiske værktøjer, gøre Drosophila en model organisme valg for at identificere de områder af hjernen, der styre komplekse opførsel, som indlæring og hukommelse, søvn, frieri, tørst og andre36,37,38,39. En særlig nyttigt værktøj, der er på midten af en flyve genetiker "værktøjskasse" er GAL4/UAS system (figur 2). Dette system40,41 bruger væv specifikt udtryk for Gal4 transcriptional aktivator for at øge udtryk af gener eller transgener nedstrøms af en Upstream aktivering sekvens (UAS). Ændringer af dette system har tilladt forskere at, for eksempel, netop kontrol ophidselse af specifikke neuroner42,43, overexpress eller knock-down specifikke gener af interesse44, 45, analysere real-time calcium dynamics i vivo46, og express reporter gener til at markere neuronal lineages41. Kombinationen af GAL4/UAS system med mitotiske rekombination også tilladt for oprettelsen af mosaik analyse med en Repressible celle markør (MARCM) system12,47. MARCM har været udbredt i enkelt neuron sporing til at identificere de cellulær signalering komponenter, der kræves for cytoskeletale vejledning12,47. Selv om disse og andre teknikker har givet en række værdifulde indsigter om de cellulære mekanismer, der kræves for nervesystemet funktion, kræver de fleste at Drosophila -hjernen først blive dissekeret; omhyggelig fjernelse af hjernen er forpligtet til at opretholde korrekte hjernens morfologi og forbindelsen mønstre mellem hjerneregioner. Følgende protokol bruger champignon krop og fotoreceptor neuroner someksempel neuronal befolkninger som det guider dig gennem dissektion og immunfluorescent farvning af voksen Drosophila brains.

Protocol

1. drosophila melanogaster genetik og valgfri Heat Shock procedurer

  1. Engang fluer har overskredet og F1 afkom er klækket, opnå hunner og/eller mænd med passende genotypen. Afhængigt af det område af hjernen undersøges, fluer bør indsamles dagligt og adskilt af sex, således at aldersbetinget og/eller seksuelt dimorfe mønstre af hjernen connectivity kan skelnes lettere.
    Bemærk: Valgfri: Hvis fluer bliver brugt til mosaik analyse med en Repressible celle markør (MARCM) analyse 12 , 47, embryoner, larver eller pupper bør være varme chokeret ved 37 ° C i 30-45 min til fremkalde mitotiske rekombination. For at målrette specifikke regioner champignon organer for MARCM analyse, bør heat shock blive timet planmæssigt bestemmes af 12 og skitseret i figur 5 B. Hvis du bruger MARCM til at undersøge hjerneregioner end de champignon organer, skal pilot forsøg udføres for at bestemme den optimale fase at være varme-chokeret. Mens nedenstående trin er skrevet med hensyn til eclosed flyver, pharate voksne kan også blive dissekeret ved hjælp af disse trin, når den puppe sag er blevet fjernet.

2. Dissektion Station forberedelse

  1. holdning stereomikroskopet og lys kilde med knyttet fiber optic goosenecks på en stor benchtop. At fremme stabil håndbevægelser og reducere hånd " ryste " mens dissekere, det er vigtigt, at tilstrækkelig plads til resten af hånd og arm er tilgængelige omkring mikroskop. Sikre, at der er ca 8-10 inches på hver side af mikroskopet og 4-6 inches mellem bunden af mikroskop og kanten af bænken.
  2. Fyld 2 eller 3 wells af et glas 9-godt eller 3-godt parabol med 1,0 mL af PTN buffer (0,1 M natriumfosfat Buffer pH 7,2, 0,1% nonionisk overfladeaktivt stof, se materialer tabel for komplet buffer komponenter) og placere den dissekere ligger på is. Nyligt dissekeret hjerner vil blive overført til denne parabol og opbevares indtil trinnet fiksering.
    1. Note: Hvis live imaging er påkrævet, dissektion buffer bør være 1 x phosphat bufferet saltvand (PBS) eller HL3 buffer 48. Hvis intracellulære proteiner lokalisering er påkrævet, kan PBS også bruges som en alternativ buffer for dissektion og fiksering. Efter fiksation, permeabilization af cellemembraner bør derefter udføres ved hjælp af PTN vasker som indeholder 0,1% eller 0,3% nonionisk detergent.
    2. Hvis PBS bruges til dissektioner og fiksering, pipette tips bør skylles mindst én gang med et vaskemiddel, der indeholder buffer (f.eks PTN) at forhindre hjerner klistrer til plast pipette tips under overførslen til microcentrifuge rør.
  3. Ved hjælp af en tomme 35 mm glas eller plastik petriskål, konstruere en dissektion parabol indeholdende en silikoneelastomer. Kort, bland elastomer komponenter ifølge producentens ' s retninger, hæld i 35 mm retter, og lad det polymerisere natten på en flad overflade. Elastomer indeholdende dissektion retter skal bruges til at beskytte de fine tips af dissekere pincet, der kan nemt blive beskadiget, hvis kontaktpersonen er lavet mellem pincet og en hårdere overflade, såsom en glasskål. Vi køber også regelmæssigt kommercielt tilgængelige silikone belagt retter fra online-forhandlere. For at øge kontrasten under dissektioner, silikoneelastomer dissektion retter indeholdende inaktiveret trækul (og dermed farvet sort) er især nyttige.

3. Voksen hjerne dissektion Procedure

  1. Anesthetize 3-5 dages gamle voksen D. melanogaster med CO 2 eller ved hjælp af is. Hvis du bruger is, sted hætteglasset indeholdende flyver op og ned (stik enden ned) i en isspand for ~ 5 min. placere hætteglasset i ice hovedet forhindrer flyver fra at blive indgivet i maden. Når fluer har været bedøvede, placere fluer på en kold metal pad eller petriskål sidder i ice eller på et CO 2 udsender flyve pad. Hvis dissekere hjerner til at analysere neurodegeneration, ældre fluer kan også anvendes.
  2. Placerer en lille mængde (150-200 µL) af PTN i midten af dissektion fadet ved hjælp af en overførsel pipette eller p200 pipette til at oprette en " bubble " af PTN. Placer dissektion fadet under stereomikroskopet og justere belysning og fokusere så at boble af PTN fylder synsfeltet og er ensartet belyst.
  3. Manipulere fluer, så de er " bugen op " (dvs., ventrale side op) mens liggende på metal eller CO 2 pad.
  4. Ved hjælp af et par af #5 pincet, forstå i maven af en flue til at blive dissekeret, og helt at holde fat i flyve, dykke det i PTN på dissektion parabol.
    Bemærk: For den resterende del af protokollen, alle trin skal udføres, mens hovedet er neddykket i PTN.
  5. Bruger et andet par af #5 pincet, tag fat i bunden af den flyve Snabel og træk de to par af pincet fra hinanden til at frigøre flyve hovedet fra kroppen. Kassér maven og brystkassen. Under dette trin er det kritisk at hovedet ikke er udgivet og lov til at flyde på overfladen af PTN. Når hovedet flydende, det kan være meget svært at forstå igen uden knusning hjernen.
    Bemærk: Ved hjælp af denne metode, er forbindelser mellem hjernen og ventrale nerve ledningen afskåret. Hvis intakt forbindelser mellem disse regioner i CNS er påkrævet, bør en alternativ dissektion protokol, som 49 , 50, følges. Hvis Snabel frigøres fra den flyve hoved før hovedet er fjernet, bliver der et hul, hvor Snabel var. I dette tilfælde gribe flyve hovedet på kanten af hullet i nærheden af det ene øje. Derefter fjerne hovedet ved hjælp af en moderat mængde af kraft, mens du trækker de to par af pincet bortset fra hinanden. Lejlighedsvis, når hovedet er fjernet fra kroppen, gut og/eller ventrale nerve ledningen forbliver knyttet til hovedet og skal fjernes, før du fortsætter dissektion.
  6. , Mens et par pincet griber Snabel, det andet par bør forstå den mediale kant af lige flyve øjet. Langsomt, træk pincet bortset fra hinanden. Dette trin skal udføres med en lille mængde af stabil lateral kraft. Som pincet langsomt bevæge sig ud over hinanden, skal Snabel trække væk fra hovedet og oprette et centralt hul i hovedet neglebånd. Kassér Snabel med det første par pincet uden at slippe den mediale del af det højre øje fra det andet par.
    Bemærk: Voksen D. melanogaster hjerne er i den caudale (dvs., bageste/bag) region af flyve hovedet. Således bør gribe denne region af hovedet undgås. Ideelt, kun den rostralt (dvs., front) del af hovedet nær mediale nethinden bør udnyttes direkte af pincet. Hjernen og tilknyttede luftrøret bør nu være synlig gennem den centrale hul i hårstrået. På dette tidspunkt, enhver hvid trævlet tråde af luftrøret stikker frem fra hullet kan fjernes og kasseres.
  7. Med det andet par pincet, forstå den mediale kant af venstre nethinden (på kanten af den centrale hul i hovedet neglebånd). Hvis du vil fjerne nethinder og tilknyttede neglebånd, langsomt trække pincet fra hinanden på en vinkel på 180 °. Som nethinden tager fra den underliggende optik lap, bør du føle et lille fald i spændingen. Gå langsomt til at forhindre, at rive den optiske lap.
    Bemærk: Adskille pincet for hurtigt under dette trin kan resultere i rivning af the optik lap eller afbrydelse af champignon organ strukturer. Lejlighedsvis, neglebånd fjernes men stykker af nethinden forbliver knyttet til den optiske lap. Hvis imaging champignon organer, er det ikke helt nødvendigt for at fjerne hele nethinden. Analyse af andre områder af hjernen (såsom retinal neuron innervation af fiberoptiske hjerne lapper) kan dog kræve nethinden til at blive helt fjernet som beskrevet af 48 , 51.
    Bemærk: Som nethinden er langsomt adskilt fra den underliggende optik lap af hjernen, optik lap bør kan iagttages som en uigennemsigtig hvid struktur dækket med hvide, trævlet luftrøret. Når en nethinden er blevet fjernet, kan det kasseres. Når du analyserer pathfinding retinal neuroner, bør særlig omhu tages under dette trin at undgå at skade den optiske lap. En tillægsprotokol fokuseret på dissektion og live imaging fotoreceptor neuroner er også tilgængelige 48.
  8. Nu, forsigtigt fjerne så meget af den synlige luftrør som muligt. Luftrør kan allerede indeholde eller senere fyldes med luft, forårsager hjernen til at flyde og potentielt, mistes under senere immunfarvning trin. Hvis du vil fjerne luftrøret, vælge det off hjernen ved hjælp af en meget skarp #5 pincet.
  9. Fjerne de resterende nethinden og omkringliggende neglebånd ved hjælp af begge par af pincet til at forstå den mediale region i den venstre flyve nethinden. Forsigtigt rive nethinden i halvdelen til at fjerne stykker af nethinden og neglebånd. I nogle tilfælde, at fjerne de resterende neglebånd uden knusning hjernen viser sig specielt udfordrende. I disse tilfælde, har vi fundet, at de resterende dele af den ventrale nerve ledningen i stedet blive forstået af et par pincet, mens de andre par pincet bruges til fjern forsigtigt sidst af neglebånd.
  10. Ved hjælp af en p200 pipette, flytte dissekeret hjerner til et godt af 9 - eller 3-godt parabol indeholdende PTN. Hjerner af den samme genotype bør samles sammen i den samme godt og opbevares på is. Hjernevæv bør fastsættes inden for en time af dissektion. Hjerner kan fast i små partier og samles om et større antal hjerner er påkrævet. I de fleste tilfælde, en erfaren forsker kan normalt dissekere en hjerne og overføre det til samling glasskål i ca 3-5 min.

4. Fiksering og immunfluorescent farvning Procedure

  1. bruger p200 pipette, overføre dissekeret hjerner fra 9-godt parabol til en 0,5 mL microcentrifuge rør fyldt med 0,5 mL 4% PARAFORMALDEHYD opløses i PTN. Mindst 10-15 hjerner af den samme genotype kan kombineres ind i et microcentrifuge rør. Alle resterende trin (indtil montering af hjerner på dias) udført i 0,5 ml microcentrifuge rør.
    Forsigtig: PARAFORMALDEHYD (PFA) skal håndteres i et stinkskab. PFA affald skal gemmes og bortskaffes korrekt. 20% PARAFORMALDEHYD købt i glas ampuller kan være aliquoted i microcentrifuge rør og opbevares ved-20 ° C indtil behov.
  2. Inde i et stinkskab, inkuberes hjerner i 4% PARAFORMALDEHYD i 20 min. med langsom hastighed vuggende stuetemperatur.
  3. Efter fiksation, tillade hjerner til at bilægge til bunden af microcentrifuge rør ved hjælp af tyngdekraften.
    Bemærk: Lejlighedsvis, hjerner kan holde til siden af microcentrifuge rør. Hvis dette sker, det er normalt nyttigt sideværts rotere rør mellem pegefinger og tommelfinger eller meget forsigtigt tryk røret på bænken til fremme af forliset af hjerner.
  4. Fjern fiksativ ved hjælp af en p1000 afpipetteres og udfører to " hurtig " vasker med 500 µL af PTN, tillader hjerner til at bilægge til bunden af microcentrifuge rør mellem vasker. Under disse hurtig vasker, når alle hjerner har afgjort ved hjælp af tyngdekraften til bunden af microcentrifuge rør, kan PTN omgående veksles til frisk buffer; der kræves ingen ekstra vask tid.
    Bemærk: Typisk, forlader ekstra buffer i røret er at foretrække frem for at risikere hjernen fjernelse. Omhyggelig undersøgelse af pipette tip er ofte nødvendigt at sikre, at ingen hjerner er blevet fejlagtigt fjernet fra røret. Hvis hjerner har været tilfældigt pipetted i spidsen, undvære dem tilbage i microcentrifuge rør, vente på hjerner til at bosætte sig og derefter fortsætte med at fjerne eventuelle ekstra PTN, der forbliver.
  5. Efter den sidste hurtige vask, bruge p1000 pipette til at udføre tre " lange " vasker: tilføje 500 µL af PTN og vask i 20 min. ved stuetemperatur på en rocker/nutator. Alle fremtidige " lange " vasker bør være op til 20 mins.
    Bemærk: Efter disse vasker, fast hjerner kan opbevares natten over ved 4 ° C i PTN.
  6. Fjerne den sidste vask ved hjælp af en p1000 pipette og inkuberes hjerner på en rocker eller nutator ved stuetemperatur i 0,5 mL blokerende løsning [PTN + 5% normal ged serum (NGS)] i mindst 30 min ved stuetemperatur.
    1. Ged sekundære antistoffer vil blive anvendt i efterfølgende protokol trin. Hvis sekundære antistoffer fra en anden art vil blive brugt, normal serum fra at arter (i stedet for NGS) bør anvendes i løsningerne, der blokerer og antistof.
  7. Bruger p1000 pipette, fjerne blokering løsning og tilføje de primære antistof fortyndet i PTN (PTN + 5% NGS + fortyndet primære antistof). Når du bruger en primær antistof for første gang, den optimale fortynding af at antistof bør fastlægges empirisk.
    Bemærk: Til at visualisere champignon krop neuroner, antistoffer anerkende Fas2 er typisk bruges. Disse antistoffer er tilgængelige fra udviklingsmæssige undersøgelser hybridom Bank (DSHB) som antistof 1 d 4 og bør være fortyndet 1:20 i PTN + 5% NGS.
    Bemærk: Til at visualisere fotoreceptor neuroner, antistoffer anerkende chaoptin er typisk bruges. Chaoptin antistoffer er tilgængelige fra DSHB som antistof 24B10 og bør være fortyndet 1:20 i PTN + 5% NGS.
    Bemærk: Fiksering processen typisk eliminerer fluorescens fra fluorescerende proteiner såsom grøn fluorescerende proteiner (NGL). Derfor, når du bruger MARCM til at analysere cytoskeletale vejledning af individuelle MB neuroner, bruge et antistof anerkende NGL.
  8. Inkuberes hjerner i primære antistof løsning på en rocker/nutator i 2-3 nætter på 4 ° C.
  9. Efter inkubation med primære antistoffer, tillade hjerner til at bilægge til bunden af microcentrifuge rør og derefter fjerne den primære antistof løsning.
  10. Ved hjælp af en p1000 pipette, udføre 2 " hurtig " vasker og 3 " lange " 20 min vasker med 0,5 mL af PTN som beskrevet ovenfor i trin 4.4 og 4.5, omhyggeligt at tillade hjerne for at udligne ved hjælp af tyngdekraften til bunden af microcentrifuge rør mellem hver Wash
  11. Incubate hjerner i 3 timer ved stuetemperatur med passende fluorescently mærket sekundære antistoffer. Sekundære antistoffer er normalt fortyndet i 0,5 mL af PTN + 5% NGS på en koncentration af 1:200.
    Bemærk: Når fluorescerende sekundære antistoffer er blevet tilføjet, hjerner bør holdes i mørke i resten af eksperimentet.
    Bemærk: I tilfælde resterende normal god landbrugspraksis fluorescens resterne, når du udfører MARCM analyse er det tilrådeligt at bruge en sekundær antistof mærket med en fluorophore at have lignende excitation/emission bølgelængder som normal god landbrugspraksis (f.eks. Fluoroscein isothyocyanate (FITC) eller Alexa488).
  12. Efter sekundær antistof inkubation, tillade hjerner til at bilægge til bunden af microcentrifuge rør og fjerne sekundær antistof løsning.
  13. Udføre 2 " hurtig " vasker og 3 " lange " 20 min vasker med 0,5 mL af PTN som beskrevet ovenfor i trin 4.4 og 4.5, omhyggeligt at tillade hjerne for at bilægge til bunden af microcentrifuge rør mellem hver Wash
  14. Efter tredje " lange " 20 min vask, brug p200 pipette til at fjerne så meget buffer som muligt.
  15. Tilføje 75 µL af fluorescerende anti-fade montering medium til hjernen. Pipette hjerner og montering medium ind i pipette spidsen en gang at blande. Ikke invertere røret da hjerner kan blive hængende på den fælles landbrugspolitik eller sider af microcentrifuge rør.
    Bemærk: Efter suspensionen af hjerner i montering medium, rør kan være pakket ind i aluminiumsfolie for langsom fluorophore dæmper og opbevares ved 4 ° C natten over. Hvis nødvendigt, hjerner kan opbevares i flere dage ved 4 ° C, men bør ideelt set være monteret på dias snarest.

5. Montering voksen D. melanogaster hjerner på mikroskop Slides og Imaging

  1. bygge en " bro " dias. Placer to " base " coverslips ca 1 cm fra hinanden på en positivt ladede dias. Sikre, at de positivt ladede side af diaset vender opad. Overholde coverslips til dias med Fingernegl polish, som vist i fig. 3 A. Det er normalt nyttigt at forsegle de tre ydre kanter af hvert base dække slip med Fingernegl polish at sikre montering medier ikke væge under disse base dæksel glider. Lad Fingernegl polish tørre helt (10-15 min), før du fortsætter.
  2. Placer slide under stereomikroskopet og afpipetteres montering media løsning indeholdende dissekeret hjerner i rummet mellem de to coverslips. For at give mere kontrast, er det nyttigt at manøvrere svanehals lys, således at de er parallelle med bænk toppen.
  3. Fjern ekstra montering medier fra dias ved hjælp af en pipette, være omhyggelig med ikke at afpipetteres hjerner væk fra diaset.
  4. Vægen væk ekstra montering medier. Dette vil tillade hjerner skal placeres mere præcist i løbet af de næste skridt.
  5. Brug et par pincet og stereomikroskopet, placere hjerner på dias i et gittermønster med antennal fliger vender op
  6. Placer et cover slip (den " bro ") over hjerner ( fig. 3 A). Bruge Fingernegl polish for at forsegle siderne af broen dække slip hvor de kontakte den " base " dække underkjoler.
  7. Ved hjælp af en p200 pipette, langsomt fylde center hulrum under broen med friske montering medier ( fig. 3 B). Anbring en dråbe ad gangen på den åbne kant af center coverslip og tillade montering medierne til at væge under center bro coverslip. Fortsætte, indtil hele hulrummet er fyldt med montering medier, og derefter forsegle top og bund med klare Fingernegl polish.
  8. Når Fingernegl polish er tørt, billede dias umiddelbart eller gemme i en lystæt stram slide boks på -20 ° C.
  9. Inden for en uge, billede hjerner ved hjælp af en laser-scanning Konfokal mikroskop med excitation lasere og filtrere kuber passende til de valgte fluorescerende sekundære antistoffer. Z-stak billeder af champignon krop neuroner er typisk fremstillet ved hjælp af 20 X eller 40 X mål. Billeddannelse af retinale fotoreceptor neuroner kan kræve højere forstørrelse.

Representative Results

Den ovenfor beskrevne metode giver mulighed for pålidelig og reproducerbar visualisering af stort set enhver region i voksen Drosophila hjernen. Her har vi fokuseret på champignon organer og fotoreceptor neuroner, men andre undersøgelser har brugt lignende metoder til at visualisere hjerneregioner som pars intercerebralis52, ur neuroner53,54, og antennal lap projektion neuroner55, blandt mange andre. Vigtigst, kan denne teknik bruges til at visualisere både hele hjernestrukturer samt individuelle neuroner inden for disse strukturer ved hjælp af teknikker som MARCM12,47. Figur 4, figur 5og figur 6 viser flere forskellige typer af data fra champignon organer og fotoreceptor neuroner i voksen hjerner, der kan genereres ved hjælp af dette dissektion og immunfarvning teknik.

Først, den ovenfor beskrevne metode kan bruges til direkte visualisere champignon krop morfologi ved hjælp af enten antistoffer, der genkender Fasciculin 2 (Fas2) eller reporter gener udtrykt i champignon krop neuroner34. Som vist i figur 4A og figur 4B, Fas2 antistoffer kan bruges til at visualisere α, β, og (i mindre grad) γ lapper champignon organer i voksen Drosophila brains. Fas2 er en celle-celle vedhæftning protein kræves til neuron fasciculation og udtrykkes på højt niveau i α og β lapper23,56,57, hvilket gør det til en pålidelig og veletableret markør af disse svampe kroppen neuroner. Navnlig kan cirkulæret-formet ellipsoide kroppen ligger i den centrale region af den voksne hjerne også visualiseres ved hjælp af denne antistof (figur 4A).

Defekter i cytoskeletale vejledning proteiner forårsager ofte utilstrækkeligt penetrant champignon krop mutant fænotyper15,34,35. Derfor, i de fleste tilfælde, flere dusin hjerner bør være afbildet og analyseret. For eksempel, krydse champignon krop β lap axoner af Nab2 null fluer uhensigtsmæssigt hjernen midterlinjen. Denne "crossing over" eller β lap "fusion" fænotype er typisk observeret i ~ 80% af voksen Nab2 null flyver men er hovedsagelig fraværende fra wild-type kontrolelementer og kan klassificeres som let, moderat eller komplet fusion34. "Fusion" af β lapper over midterlinjen skyldes forkert kontralaterale projektionen af axoner i den modsatte hjerne halvkugle. Som vist i figur 4C og detaljeret i34,35, refererer lille fusion til β fligerne er forbundet af en "tynd strand Fas2-positive fibre," mens moderat fusion refererer til mere væsentligt tilsluttede β lapper at vise lidt nedsat lap tykkelse på midterlinjen. Komplet (eller "ekstreme") fusion refererer til β fliger, der er helt tilsluttet og vise noget fald i lap tykkelse eller Fas2 farvning på midterlinjen. Omfanget af champignon krop β lap fusion kan kvantificeres og vises som påvist i 34,35 eller som en tabel, der viser procentdelen af hjerner viser hver type af morfologi defekt.

Foruden farvning med Fas2 antistoffer, kan MARCM teknik12,47,48 også bruges til at visualisere axon vejledning beslutninger af individuelle normal god landbrugspraksis+ neuroner i champignon krop fliger. MARCM udnytter mitotiske rekombination under udvikling for at skabe individuelle neuroner eller alsidighed relaterede grupper af neuroner, der er markeret med normal god landbrugspraksis (figur 5A). MARCM giver en måde at generere et lille antal af neuroner, der fuldstændig mangler et protein i en ellers heterozygous flyve. Som sådan, er denne teknik især nyttige i at analysere de cytoskeletale vejledning funktioner af proteiner, der er også afgørende for samlet kropsligt levedygtighed12,47. Homozygot null neuroner markeret med normal god landbrugspraksis kan sammenlignes direkte for at styre neuroner markeret med normal god landbrugspraksis i wild-type genetiske baggrund. Desuden, afhængigt af Hvornår udvikle larver eller pupper er varme-chokeret, forskellige klasser af champignon krop neuroner kan være målrettet (figur 5B).

Et eksempel på typen data, der genereres ved hjælp af denne teknik er vist i figur 5C, hvor wild-type (dvs.kontrol) MARCM kloner er genereret som eksempel. For at generere de enkelte normal god landbrugspraksis+ champignon krop neuroner vist i figur 5C, udvikle F1 larver var i første omgang til huse på 25 ° C. Ca 5-6 dage efter larve klækning (ALH), pupper blev varme chokeret i 30 minutter ved 37 ° C og vendte derefter tilbage til 25 ° C indtil eclosion. Efter voksen rugeæg, hjerner blev dissekeret i PTN, fast, og samtidig inkuberes med antistoffer anerkende Fas2 (1 d 4, fortyndet 1:20 i PTN) og normal god landbrugspraksis (fortyndet 1: 500 i PTN). Hjerner blev derefter inkuberes med sekundære antistoffer og monteret på dias som beskrevet ovenfor. Normal god landbrugspraksis+ cellerne blev identificeret og afbildet ved hjælp af en laser-scanning Konfokal mikroskop og maksimal intensitet fremskrivninger blev oprettet ved hjælp af ImageJ. Som vist i figur 5C, kontrol normal god landbrugspraksis+ neuroner genereret i α og β, fligerne er colocalize med Fas2 og opsige før du kontakter med midterlinjen, der adskiller de to Drosophila hjernen halvkugle. Et enkelt axon projekter anteriorly, tveger, og derefter projekter både dorsalt og medialt til at danne α og β fliger. Flere tidligere undersøgelser har brugt denne teknik til at undersøge, om visse proteiner er nødvendige at studere celledeling selvstændigt for mange aspekter af axonogenesis, herunder udvidelse, pathfinding, forgrener sig eller beskæring10, 11,12,13,14,15,16,17,34.

Ud over de champignon organer, kan de cytoskeletale pathfinding beslutninger af retinale fotoreceptor neuroner (R-celler) også visualiseres ved hjælp af metoden dissektion beskrevet ovenfor (og af dissektion metode debeskrevet i reference48). Hver ommatidia inden for flyve øjet indeholder 8 fotoreceptor neuroner, der kan inddeles i tre grupper (figur 1): R1-R6 celler, som projektet axoner til den overfladiske lamina af hjernen optik lobe; R7 celler, som projektet axoner til dybere M6 lag af medulla; og R8 celler, som projektet axoner til M3 mellemlag af medulla19,58. Projektion mønster af hver klasse af fotoreceptor er blevet undersøgt udførligt og sammen disse neuroner har held været anvendt som en model til at forstå den signaling veje involveret i axon vejledning19,59. Vigtigere, alle fotoreceptor axoner kan nemt visualiseres i dissekeret Drosophila hjerner ved immunfarvning af de voksne, puppe, eller larver væv ved hjælp af en antistof der genkender chaoptin, en celle overflade glycoprotein24, 60 , 61. reporter gener udtryk for normal god landbrugspraksis eller β-galactosidase i hvert F-celle type (R1-R6, R7 og R8 celler) er også blevet bygget og kan bruges til at visualisere hver klasse af fotoreceptor62. Da hver type R-celle ophører i et andet lag af den tredje optiske lap, har disse journalister tilladt for detaljerede sammenligninger af signaling veje kræves for hver celletype korrekt finde sit mål. Et eksempel på de udtryk mønstre produceret af to af disse reporter gener i kombination med chaoptin lokalisering (som kan bruges som markør af alle fotoreceptor neuroner) er vist i figur 6. For at visualisere R7 fotoreceptorer, var hjerner indeholdende R7-specifikt Rhodopsin4-LacZ reporter gen dissekeret og farves med antistoffer mod chaoptin og β-galactosidase. Rhodopsin 4 (Rh4) er udtrykt netop i en delmængde af R7 celler63; Rh4 promoter kan derfor bruges til at drive reporter gen expression i kun disse celler. Som forventet, opsige R7 celler i de dybere M6 lag af medulla (angivet med en gul punkteret figur 6). Ligeledes hjerner udtrykker β-galactosidase fra Rhodopsin 6 (Rh6) promotor, som er angivet specifikt i R8 fotoreceptorer63, var dissekeret og immunostained ved hjælp af antistoffer erkender chaoptin og Β-galactosidase. Som vist i figur 6, R8 fotoreceptorer afsluttes på R3-laget af denmedulla. Selv om ikke vist her, kan Rh1-LacZ også bruges til at visualisere opsigelse af R1-R6 fotoreceptorer i lamina.

Figure 1
Figur 1: Voksen Drosophila melanogaster hjerne består af funktionelt forskellige men indbyrdes forbundne områder. (A) en oversigt over de voksne D. melanogaster hjerne er vist, fremhæver den centralt beliggende champignon organer og perifere retinale fotoreceptor neuroner. (B) udvidede diagram af voksen champignon krop axon bundter (også kaldet lapper), der er anerkendt af Fas2 antistoffer. De iboende neuroner champignon organer, kaldet Kenyon celler, projekt axoner anteriorly fra dorsalt placeret celle organer (celle organer udeladt fra dette diagram) og udgør særskilte lap strukturer. I den voksne hjerne, formen γ lapper (vist i rød) fra en enkelt mediale bundt af axoner, mens den dorsale α og mediale β lapper (vist i blå) form fra et enkelt axon, tveger under pathfinding proces. Α ' / β' neuroner udvikle cytoskeletale lapper, der delvist overlapper dem af α/β neuroner, men genkendes ikke af Fas2 antistoffer og er udeladt fra dette diagram. (C) Retinal neuroner er kritisk i genudlægning visuel information fra nethinden optik lap. Axoner projekt fra celle organer beliggende i nethinden (beige) og form forbindelser med post synaptic target-cellerne i lamina eller medulla. R1-R6 fotoreceptor celler (vist med rødt) form bestemte forbindelser med celler i de yderste lag af den optiske lap, kaldet lamina. R7 fotoreceptor celler (gule) synapse med mål i M6 lag af medulla, mens R8 celler (vist med grønt) projekt axoner til det lidt mere overfladiske M3 lag af medulla. Del C tilpasset med tilladelse fra Macmillan udgivere Ltd: Nature Neuroscience (reference64, copyright (2011)). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: The GAL4/UAS system kan anvendes til målrettede genekspression. For at opnå fluer udtrykker et gen af interesse ("Gene X") i et bestemt mønster, væv, skal fluer indeholde både en transgen udtrykker Gal4 transcriptional aktivator protein under kontrol af en væv specifikke forstærker og en transgen indeholdende Gal4 DNA bindende sekvens (kaldet en Upstream aktivering sekvens eller UAS) støder op til gen X. typisk, denne kombination er opnået ved parring forældrenes fluer, hver indeholder ét transgen og vælge for F1 afkom, der indeholder begge. I den resulterende F1 generation, Gal4 vil blive udtrykt og vil binde sig til UAS at aktivere omskrivning af genet X på en bestemt måde, væv. Vigtigere, kan forskellige UAS-holdige transgener bruges i kombination med den samme GAL4 "driver". For eksempel, kan en transgen udtryk for Gal4 i champignon organer (MBs) kombineres med en UAS-holdige transgen udtrykkelige normal god landbrugspraksis, en transgen, der slår ned udtryk af et gen af interesse ved hjælp af RNA-interferens eller en UAS-transgene, der producerer en reporter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Montering hjerner som forberedelse til immunofluorescens billeddannelse. (A) hjerner er monteret på SuperFrost Plus dias med en bro dække at forhindre udfladning af hjerner. To "base" cover underkjoler overholdes et Superfrost Plus positivt ladede dias med klare Fingernegl polish og dissekeret hjerner placeres derefter på dias mellem dem. En klar "broen" cover slip er placeret over hjerner og levet op til de base dæksel glider. (B) en gang Fingernegl polish har tørret, Vectashield er langsomt pipetted under broen at bevare fluorescens af sekundær antistof. Klart Fingernegl polish bruges derefter til at forsegle toppen og bunden af "broen" cover slip. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Champignon krop axoner klart kan visualiseres ved hjælp af antistoffer, der genkender Fas2. (A) voksen Drosophila hjerner var dissekeret, fast, og inkuberes med antistoffer anerkende Fas2. Primære antistoffer blev anerkendt ved hjælp af Alexa488-kombineret gede-anti-mus sekundære antistoffer og hjerner blev monteret på positivt ladede dias og afbildet ved hjælp af en laser scanning Konfokal mikroskop. Bisymmetrically beliggende champignon krop celle organer udvide axoner anteriorly, bifurcate og danne axon bundter (også kaldet lapper). Axoner, der danner dorsalt fremspringende α lapper og medialt fremspringende β lapper express Fas2. Kritisk, opsige β lapper i wild-type fluer før hjernen midterlinjen. Det centralt beliggende ellipsoide organ kan også visualiseres ved hjælp af 1 d 4 antistof. (B) medialt fremspringende γ lap axoner af voksen Drosophila champignon kroppen også udtrykke Fas2 og kan visualiseres ved hjælp af 1 d 4 antistof. Typisk er udtryk for Fas2 i γ lap axoner mindre end α og β lapper. (C) champignon kroppen axoner af Nab2-null hjerner (genotype: Nab2ex3/Nab2ex3) mis-projekt contralaterally og mangler ofte lapper. Nab2-null hjerner blev dissekeret, fast og farves med 1 d 4 antistof til at visualisere champignon krop α, β og γ fliger. Maksimale intensitet Z-stakken fremskrivninger såvel som de enkelte optiske dele fokuseret på midterlinjen region er vist. Mens vildtype champignon krop β lap axoner krydse sjældent hjernen midterlinjen, har Nab2-null hjerner varierende mængder af mis projektion på tværs af midterlinjen i de kontralaterale hjernen halvkugle, resulterer i "smeltet" β fliger. Som defineret i referencer34,35, mild fusion refererer til < β lapper med kun flere "strenge" af axoner krydser midterlinjen, moderat fusion refererer til situationer hvor Fas2 positive β lap neuroner krydser den hjerne midterlinje men β lap bredde på midterlinjen er faldet, og komplet fusion henviser til situationer, hvor der ikke er nogen reduktion af β-lap tykkelse som lapper cross hjernen midterlinjen. Da ellipsoide kroppen udtrykker også Fas2, optiske dele viser midterlinjen ofte er mere nyttigt i at visualisere β lap fusion. Navnlig er mangler fliger også observeres ofte (angivet her med den hvide stjerne). Data i del C bruges i kvantificering af champignon krop fænotyper fra reference34, med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : MARCM kan bruges til at visualisere axoner af enkelt neuroner. (A) mosaik analyse med en Repressible celle markør (MARCM) bruger FLP recombinase-medieret mitotiske rekombination på FRT websteder til at oprette to forskellige datterceller. I dette eksempel er indeholder alle celler en champignon organ-specifikke GAL4 protein på en separat kromosom. Efter mitotiske rekombination under celledeling, én datter celle (top) udtrykker normal god landbrugspraksis (eller membranen bundet CD8-normal god landbrugspraksis) og indeholder to muterede alleler i et gen af interesse, mens anden datter cellen (nederst) arver to wild-type (WT) alleler og en Transgenets udtrykker Gal80 protein ved hjælp af en tubulin promotor. Gal80 hæmmer Gal4, så eventuelle celler, der producerer Gal80 bliver ikke-fluorescerende og bør være enten heterozygous eller homozygot vildtype. Kun de celler, der er normal god landbrugspraksis+ vil indeholde to kopier af den mutante allel. Bemærk, at kun en af flere metoder til at generere normal god landbrugspraksis+ celler, der også indeholder to muterede alleler i et gen af interesse er vist; Se venligst12,45,56 for andre eksempler. (B) da udviklingen af champignon krop neuroner begynder med γ neuroner, så α'/ β' neuroner, og ender med α/β neuroner, hver klasse af neuron kan selektivt målrettet og visualiseret ved varme chokerende på forskellige udviklingsmæssige tidspunkter. Som beskrevet i 12, en 40 min varme chok ved 37 ° C, der opstår ≤2.5 dage efter larve klækning (ALH) vil være målrettet mod γ; neuroner, mens varme chok, der opstår, 3,5-4,5 dage ALH (i den sene L3 larve fase) vil målrette α'/ β' neuroner, og en heat shock at o ccurs mellem 5-7 dage ALH (under puppe udvikling) vil målrette α/β neuroner. (C) individuelle vildtype axoner blev visualiseret ved hjælp af MARCM. Wild-type ~ 5-6 dages gamle pupper (genotype: hsFLP, UAS-CD8-normal god landbrugspraksis; FRT82B, UAS-CD8-normal god landbrugspraksis/FRT82B, badekar > Gal80; OK107-GAL4/+) chokerede varme ved 37 ° C i 40 min til at fremkalde mitotiske rekombination. Hjerner blev dissekeret, fast og farves med antistoffer erkendelse af normal god landbrugspraksis (1: 500) og Fas2 (1:20). Hjerner blev derefter inkuberes med fluorescently mærket sekundære antistoffer og visualiseret ved Konfokal mikroskopi. I dette eksempeldata fra en "kontrol" genotype, normal god landbrugspraksis positive celler genereret ved hjælp af MARCM er wild-type og i stedet for som indeholder to genmut alleler, indeholder to genWT alleler. Champignon krop β lapper (visualiseret ved hjælp af antistoffer anerkende Fas2) opsige før at nå hjernen midterlinjen; Α lap neuroner er også til stede. For at vise større detalje, er en zoomet på baggrund af en enkelt hjernen halvkugle vist i den nederste række af billeder. Del C blev tilpasset med tilladelse fra reference34. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Fotoreceptor axoner kan også visualiseres. Voksen hjerne udtrykker β-galactosidase i R7 fotoreceptorer (venstre, ved hjælp af Rh4-LacZ) eller R8 fotoreceptorer (lige, ved hjælp af Rh6-LacZ) var dissekeret, fast og inkuberes med antistoffer anerkende β-galactosidase eller chaoptin. Hjerner blev derefter inkuberes med fluorescently mærket sekundære antistoffer og visualiseret ved laser scanning Konfokal mikroskopi. Enkelt optisk sektioner er vist fra hver hjerne. Til venstre, kan flere R7 fotoreceptor axoner (pile) ses afsluttes i den dybere M6 lag af medulla (vist ved den gule stiplede linje). Til højre opsige R8 fotoreceptor axoner (pile) i det ydre M3 lag af medulla (vist af den grøn stiplet linie). Da R7 fotoreceptorer express enten Rh3 eller Rh4 og R8 fotoreceptorer express enten Rh5 eller Rh663, kan ikke alle R7 eller R8 fotoreceptorer visualiseres ved hjælp af et enkelt LacZ reporter gen. Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den ovenfor beskrevne dissektion og visualisering metode kan anvendes i en bred vifte af immunfarvning og live billedbehandlingsprogrammer. Vi har skitseret en generel immunfarvning protokol og har understreget én måde, hvorpå MARCM kan bruges til at visualisere cytoskeletale morfologi af individuelle champignon krop neuroner. Derudover disse generelle procedurer kan også bruges til imaging andre områder af hjernen i fast eller frisk dissekeret voksen hjerne48,65. Live imaging kan yde en mere effektiv tilgang når analysere udtryk mønstre forstærker fælder, reporter gener eller efterligne linjer66, f.eks. At forhindre fanger artefakter fra celledød under live imaging af normal god landbrugspraksis i ikke optagne væv, hjerne bør være dissekeret i 1 x phosphat bufferet saltvand (PBS) eller HL3 media48, monteret på broen dias i 1 x PBS (eller HL3) og afbildet i mindre end 15-20 min. pleje bør også tages til at fjerne så meget luft som muligt fra dissekeret hjernen før billedbehandling, da det kan forstyrre visualisering af normal god landbrugspraksis fluorescens.

Mens farvning betingelserne for at vurdere morfologi af champignon krop og fotoreceptor neuroner er forholdsvis veletableret24,61,67, lokalisering af et specifikt protein af interesse i disse celle typer kan kræve omfattende fejlfinding og optimering. Navnlig skal flere kritiske trin, herunder antistof fortynding, blokerende buffer komponent koncentration og fiksering, optimeres for at generere de mest reproducerbare og pålidelige resultater. Først, den optimale koncentration af primære antistof bør fastlægges. Selv om kommercielt tilgængelige antistoffer ofte har en foreslået fortynding (og vi ofte først starte ved hjælp af denne koncentration), er disse værdier sjældent bestemt empirisk på Drosophila væv. Derfor tester en serie af primære antistof fortyndinger, der spænder over og under fabrikantens start forslag ofte resulterer i mere specifik farvning. Mens primære antistof fortynding kan have en betydelig indvirkning på farvning nøjagtighed og præcist fastsættes, tid hjerner er udruget i primære antistof der indeholder kan løsninger variere betydeligt med lille effekt på det samlede resultat. For eksempel, har vi observeret lignende resultater når inkubere dissekeret hjerner med Fas2 antistof primære antistof for to, tre eller endda fire dage ved 4 ° C. Selv om vi anbefaler mindst to nætter, har vi også inkuberes hjerner i primære antistof løsning for en enkelt nat og opnået reproducerbare farvning. Vigtigere, hjælper begrænser mængden tid hjerner er udruget i den sekundære antistof til 3 timer ved stuetemperatur (eller en nat ved 4 ° C) grænse ikke-specifik binding af sekundære antistoffer til hjernevæv.

Andet, kan det være nødvendigt at bruge yderligere "blokering" reagenser til at fjerne uønsket baggrund signal. Indstillinger omfatter øget koncentration af NGS ~ 10%, tilføje 1-10% bovint serumalbumin (BSA) til blokering og primær/sekundær antistof løsninger, eller før adsorption af primære antistoffer natten over ved 4 ° C med Drosophila embryoner (Se reference68, afsnit 2.9, trin 3).

Mens vi har skrevet ovenstående protokollen bruger PTN som den foreslåede buffer for alle fiksering, kan vask, og antistof inkubation trin, væv fiksering i andre buffere (såsom PLP og PEM, der er opført i Materialer tabel) resultere i dybe forskelle i signalstyrke. For eksempel, har tidligere undersøgelser vist at Cyclin E er ikke målbart i larve fantasiens diske når væv er fast i traditionelle 4% PARAFORMALDEHYD fortyndes i PBS, men er klart synlig, når væv er faste i PLP buffer (Ken Moberg, personlige kommunikation og reference69). Ud over ændringer i buffer komponenter, ændre tid og temperatur til vævet fiksering kan også væsentligt påvirke immunfluorescent farvning og empirisk kan bestemmes, hvis det er nødvendigt. Generelt, fiksering tid skal være lang nok til at give mulighed for tilstrækkelig crosslinking af cellulære komponenter og langsigtede vedligeholdelse af samlede cellulære morfologi samtidig være begrænset nok til at forhindre over-crosslinking og "begrave" af protein epitoper. Derfor, når i første omgang optimere farvning betingelser for en nyerhvervede primære antistof, vi normalt begrænse fiksering tid til ca 20 min og vil ofte løse væv på koldere temperaturer.

Flere kontrolelementer bør indgå i enhver immunofluorescens eksperiment for at undersøge specificiteten af primære og sekundære antistoffer samt effekten af transgener/genetiske baggrund på de observerede fænotype. For at fastslå, om den primære antistof anvendes specifikt genkender protein af interesse, skal væv fra fluer mangler dette protein og/eller væv overekspression af protein medtages som kontrol. Tilsætning af overskydende renset antigen protein kan også indgå for at afgøre, om den primære antistof genkender andre epitoper i flyve hjernen. Endelig repræsenterer nogen fluorescerende signal når primære antistoffer er udeladt niveauet af ikke-specifik binding af de udvalgte sekundære antistoffer.

Flere vigtige kontrol bør inddrages for at vurdere bidrag af genetiske baggrund eller tilstedeværelsen af transgener til farvning intensitet eller neuronal morfologi. For eksempel fluerne bruges i MARCM forsøget i figur 5 indeholder flere transgener (hsFLP, UAS-CD8-normal god landbrugspraksis, FRT82B, badekar > GAL80, og OK107-GAL4), hvoraf hver bør analyseres separat for effekter på champignon krop morfologi. På et absolut minimum, champignon krop morfologi af fluer bør som indeholder både OK107-GAL4 og UAS-CD8-normal god landbrugspraksis være analyseret. Det kan også være nødvendigt at vurdere effekten af heat shock og Flp recombinase produktion på champignon organ udvikling ved at analysere fluer som indeholder både hsFLP og FRT82B. Selv om MARCM kan give betydelig indsigt i hvorvidt en given protein selvstændigt styrer cytoskeletale vejledning, kan antallet af Kontroller præcist foretage denne konklusion være en mindre begrænsning af denne teknik. Der gælder også ens kontrolelementer i mindre kompliceret eksperimenter. For eksempel, tage et eksperiment, hvor GAL4/UAS system bruges i kombination med et RNAi transgen til knockdown udtryk for et protein af interesse for alle neuroner. I dette eksperiment, mindst to transgener vil være til stede: en pan-neuronal GAL4 driver, såsom elav-GAL4, og UAS-RNAi transgenet. Morfologi af champignon krop neuroner i fluer der indeholder hver af disse transgener alene bør undersøges ud over den eksperimentelle tilstand hvor fluer harbor begge transgener i den samme flyve.

Endelig for at afgøre, om protein af interesse er udtrykt i champignon krop neuroner er det normalt nødvendigt at co pletten hjerner med antistoffer til Fas2. Fluorescerende proteiner som normal god landbrugspraksis, RFP eller membranen bundet CD8-normal god landbrugspraksis kan alternativt også udtrykkes ved hjælp af GAL4/UAS system og bruges i kombination med antistoffer anerkende protein af interesse. Da Fas2 kun anerkender fasciculated axoner, der danner champignon krop α og β lapper, har brug af GAL4-drevet, membran-bundet CD8-NGL været særlig nyttig for mærkning champignon krop neuroner.

Defekter i cytoskeletale vejledning er ofte ikke 100% penetrant og endda hjerner af den samme genotype kan vise nogle variation. Derfor, når analysere nyligt genererede mutante alleler for defekter i champignon krop eller fotoreceptor pathfinding, en kombination af forskellige alleler og tilgange bør udnyttes. De fleste undersøgelser i litteraturen bruge flere forskellige tilgange til at undersøge, om et protein spiller en celle-selvstændig rolle i at kontrollere cytoskeletale vejledning: Jeg) analyse af pathfinding defekter i homozygot null fluer (helst med forskellige null alleler), ii) analyse af pathfinding defekter i fluer mangler protein af interesse kun i neuroner (normalt via RNAi), iii) MARCM analyse af pathfinding defekter, og iv) redde eksperimenter hvor genet er re udtrykt i neuroner i homozygot null fluer. Ideelt set, flere dusin hjerner pr. genotype bør analyseres for defekter i neuronal morfologi.

Selv om protokollen beskrevet her primært fokuserer på immunfluorescent lokalisering af proteiner i faste væv, udvikles flere fremtidige anvendelser af denne teknik til billede live hjernevæv. Når hjerner er dissekeret (normalt i celle kultur medier), kan de så være kulturperler i flere dage ved 25 ° C. Disse ex vivo dyrkningsbaserede metoder er ved at blive udviklet for at undersøge en bred vifte af biologiske processer, såsom protein aktivitet, der fremmer axon regeneration efter skade70,71, intracellulære Signaling dynamics72, og neuronal udvikling73.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Changhui Pak og Olafs Vrailas Mortimer for i første omgang undervisning SMK hjernen dissektion teknik. Vi takker også medlemmerne af Ken Moberg lab gruppe, især Chris runder, for kritisk læsning af manuskript. Antistoffer anerkende Fas2 (1 d 4) og chaoptin (24B10) stammer fra den udviklingsmæssige undersøgelser hybridom Bank. Antistof 24B10 blev indsat på DSHB af Seymour Benzer og Nansi Colley24,60,61, antistof 1 d 4 blev indsat på DSHB af Corey Goodman 22,23,56. Flyve bestande blev indhentet fra Bloomington Stock Center. Vi ønsker også at takke Ohio landbrugsforskning og udvikling Center (OARDC) MCIC Imaging Center for brug af en Konfokal mikroskop billede hjerner i figur 4A og B. SMK understøttes af et tilskud fra NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microdissection forceps/tweezers Ted Pella 505-NM
Sylgard dishes Living Systems Instrumentation DD-50-S-BLK Available from amazon.com
Fas2 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 1D4
Chaoptin Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 24B10
GFP Antibody Aves Lab GFP-1010
Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody ThermoFisher A-11001
Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody ThermoFisher A-11039
Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody ThermoFisher A-21236
20% paraformaldehyde Electron Microscope Services RT15713
VectaShield Vector Labs H-1000
SuperFrost Plus Slides ThermoFisher 99-910-01
Coverslips ThermoFisher 12-553-454
Na Phosphate Buffer monobasic Sigma S3139
Na phosphate Buffer dibasic Sigma S3264
Triton X 100 Sigma X100-100ml
fingernail polish Electron Microscope Services (EMS) 72180
stereomicroscope Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate) VWR 89090-482
nutator/rocker Fisher 22-363-152 or 88-861-041
35mm dish Genesee Scientific 32-103
Sylgard Fisher 50-366-794
Kimwipe Fisher 06-666
Name Company Catalog Number Comments
Potential Fixation Buffers
PTN Buffer 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed
PLP buffer 2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O
PEM buffer 0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA
Name Company Catalog Number Comments
Fly Stocks available from Bloomington
elav (c155)-GAL4 BL458 Pan-neuronal GAL4 driver
w*;;;OK107-GAL4 BL 854 GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)
y(1), w(67c23); c739-GAL4 BL 7362 GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP BL 64305 GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP
w*; 201Y-GAL4 BL 4440 GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP BL 64296 GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO BL 5145 MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP BL5146 MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4 BL 44408 MARCM stock for flipping 3rd chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub>GAL80;OK107-GAL4 BL44406 MARCM stock for flipping 2nd chromosome
w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4 BL 44407 MARCM stock for flipping X chromosome
y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO BL 5137 GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)
y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP BL 5139 MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO BL 28832 MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome
w*; FRTG13, Tub>GAL80 BL 5140 MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome
y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80 BL 5135 MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reichert, H. Evolutionary conservation of mechanisms for neural regionalization, proliferation and interconnection in brain development. Biol Lett. 5 (1), 112-116 (2009).
  2. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat Rev Neurosci. 11 (7), 514-522 (2010).
  3. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
  4. Oortveld, M. A., et al. Human intellectual disability genes form conserved functional modules in Drosophila. PLoS Genet. 9 (10), 1003911 (2013).
  5. Sanchez-Soriano, N., Tear, G., Whitington, P., Prokop, A. Drosophila as a genetic and cellular model for studies on axonal growth. Neural Dev. 2, 9 (2007).
  6. Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
  7. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  8. Harris, R., Sabatelli, L. M., Seeger, M. A. Guidance cues at the Drosophila CNS midline: identification and characterization of two Drosophila Netrin/UNC-6 homologs. Neuron. 17 (2), 217-228 (1996).
  9. Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
  10. Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (3), 001743 (2010).
  11. Hattori, D., et al. Dscam diversity is essential for neuronal wiring and self-recognition. Nature. 449 (7159), 223-227 (2007).
  12. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  13. Reynaud, E., et al. Guidance of Drosophila Mushroom Body Axons Depends upon DRL-Wnt Receptor Cleavage in the Brain Dorsomedial Lineage Precursors. Cell Rep. 11 (8), 1293-1304 (2015).
  14. Reuter, J. E., et al. A mosaic genetic screen for genes necessary for Drosophila mushroom body neuronal morphogenesis. Development. 130 (6), 1203-1213 (2003).
  15. Ng, J. Wnt/PCP proteins regulate stereotyped axon branch extension in Drosophila. Development. 139 (1), 165-177 (2012).
  16. Lai, Y. W., et al. Drosophila microRNA-34 Impairs Axon Pruning of Mushroom Body gamma Neurons by Downregulating the Expression of Ecdysone Receptor. Sci Rep. 6, 39141 (2016).
  17. Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
  18. Borst, A., Helmstaedter, M. Common circuit design in fly and mammalian motion vision. Nat Neurosci. 18 (8), 1067-1076 (2015).
  19. Clandinin, T. R., Zipursky, S. L. Making connections in the fly visual system. Neuron. 35 (5), 827-841 (2002).
  20. Schurmann, F. W. Fine structure of synaptic sites and circuits in mushroom bodies of insect brains. Arthropod Struct Dev. 45 (5), 399-421 (2016).
  21. Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).
  22. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
  23. Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
  24. Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7929-7933 (1982).
  25. Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes. Cell. 36 (1), 15-26 (1984).
  26. Wan, L., Dockendorff, T. C., Jongens, T. A., Dreyfuss, G. Characterization of dFMR1, a Drosophila melanogaster homolog of the fragile X mental retardation protein. Mol Cell Biol. 20 (22), 8536-8547 (2000).
  27. Androschuk, A., Al-Jabri, B., Bolduc, F. V. From Learning to Memory: What Flies Can Tell Us about Intellectual Disability Treatment. Front Psychiatry. 6, 85 (2015).
  28. Bolduc, F. V., Tully, T. Fruit flies and intellectual disability. Fly (Austin). 3 (1), 91-104 (2009).
  29. van der Voet, M., Nijhof, B., Oortveld, M. A., Schenck, A. Drosophila models of early onset cognitive disorders and their clinical applications. Neurosci Biobehav Rev. 46, Pt 2 326-342 (2014).
  30. Pak, C., et al. Mutation of the conserved polyadenosine RNA binding protein, ZC3H14/dNab2, impairs neural function in Drosophila and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12390-12395 (2011).
  31. Gatto, C. L., Broadie, K. Drosophila modeling of heritable neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 21 (6), 834-841 (2011).
  32. van Alphen, B., van Swinderen, B. Drosophila strategies to study psychiatric disorders. Brain Res Bull. 92, 1-11 (2013).
  33. Kelly, S. M., et al. A conserved role for the zinc finger polyadenosine RNA binding protein, ZC3H14, in control of poly(A) tail length. RNA. 20 (5), 681-688 (2014).
  34. Kelly, S. M., et al. The Drosophila ortholog of the Zc3h14 RNA binding protein acts within neurons to pattern axon projection in the developing brain. Dev Neurobiol. 76 (1), 93-106 (2016).
  35. Michel, C. I., Kraft, R., Restifo, L. L. Defective neuronal development in the mushroom bodies of Drosophila fragile X mental retardation 1 mutants. J Neurosci. 24 (25), 5798-5809 (2004).
  36. Yamamoto, D., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat Rev Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
  37. Busto, G. U., Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L. Olfactory learning in Drosophila. Physiology (Bethesda). 25 (6), 338-346 (2010).
  38. Ueno, T., et al. Identification of a dopamine pathway that regulates sleep and arousal in Drosophila. Nat Neurosci. 15 (11), 1516-1523 (2012).
  39. Vogelstein, J. T., et al. Discovery of brainwide neural-behavioral maps via multiscale unsupervised structure learning. Science. 344 (6182), 386-392 (2014).
  40. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  41. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  42. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
  43. Hodge, J. J. Ion channels to inactivate neurons in Drosophila. Front Mol Neurosci. 2, 13 (2009).
  44. Neumuller, R. A., Perrimon, N. Where gene discovery turns into systems biology: genome-scale RNAi screens in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 471-478 (2011).
  45. Ni, J. Q., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
  46. Seelig, J. D., et al. Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior. Nat Methods. 7 (7), 535-540 (2010).
  47. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
  48. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
  49. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), (2011).
  50. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (12), 1472-1474 (2011).
  51. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
  52. Liu, Y., Liao, S., Veenstra, J. A., Nassel, D. R. Drosophila insulin-like peptide 1 (DILP1) is transiently expressed during non-feeding stages and reproductive dormancy. Sci Rep. 6, 26620 (2016).
  53. Shafer, O. T., Helfrich-Forster, C., Renn, S. C., Taghert, P. H. Reevaluation of Drosophila melanogaster's neuronal circadian pacemakers reveals new neuronal classes. J Comp Neurol. 498 (2), 180-193 (2006).
  54. Rieger, D., Shafer, O. T., Tomioka, K., Helfrich-Forster, C. Functional analysis of circadian pacemaker neurons in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 26 (9), 2531-2543 (2006).
  55. Hillebrand, J., et al. The Me31B DEAD-Box Helicase Localizes to Postsynaptic Foci and Regulates Expression of a CaMKII Reporter mRNA in Dendrites of Drosophila Olfactory Projection Neurons. Front Neural Circuits. 4, 121 (2010).
  56. Goodman, C. S., Davis, G. W., Zito, K. The many faces of fasciclin II: Genetic analysis reveals multiple roles for a cell adhesion molecule during the generation of neuronal specificity. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 479-491 (1997).
  57. Fushima, K., Tsujimura, H. Precise control of fasciclin II expression is required for adult mushroom body development in Drosophila. Dev Growth Differ. 49 (3), 215-227 (2007).
  58. Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
  59. Hadjieconomou, D., Timofeev, K., Salecker, I. A step-by-step guide to visual circuit assembly in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 76-84 (2011).
  60. Van Vactor, D. Adhesion and signaling in axonal fasciculation. Curr Opin Neurobiol. 8 (1), 80-86 (1998).
  61. Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human. Cell. 52 (2), 291-301 (1988).
  62. Tahayato, A., et al. Otd/Crx, a dual regulator for the specification of ommatidia subtypes in the Drosophila retina. Dev Cell. 5 (3), 391-402 (2003).
  63. Cook, T., Desplan, C. Photoreceptor subtype specification: from flies to humans. Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).
  64. Hakeda-Suzuki, S., et al. Goal collaborates with Flamingo in conferring synaptic-layer specificity in the visual system. Nat Neurosci. 14 (3), 314-323 (2011).
  65. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
  66. Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  67. Crittenden, J. R., Skoulakis, E. M., Han, K. A., Kalderon, D., Davis, R. L. Tripartite mushroom body architecture revealed by antigenic markers. Learn Mem. 5 (1-2), 38-51 (1998).
  68. Muller, H. A. Immunolabeling of embryos. Methods Mol Biol. 420, 207-218 (2008).
  69. Baker, N. E., Li, K., Quiquand, M., Ruggiero, R., Wang, L. H. Eye development. Methods. 68 (1), 252-259 (2014).
  70. Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
  71. Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 575-597 (2012).
  72. Tomchik, S. M., Davis, R. L. Dynamics of learning-related cAMP signaling and stimulus integration in the Drosophila olfactory pathway. Neuron. 64 (4), 510-521 (2009).
  73. Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).

Tags

Udviklingsmæssige biologi sag 129 cellebiologi neurovidenskab Drosophila melanogaster dissektion immunofluorescens hjernen axon vejledning pathfinding konfokalmikroskopi
Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen <em>Drosophila melanogaster</em> hjerner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M.… More

Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. J. Vis. Exp. (129), e56174, doi:10.3791/56174 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter