Summary
هنا، نحن وصف إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (شريحة) ورقاقة seq المكتبة إعداد بروتوكول لإنشاء التشكيلات الجانبية ابيجينوميك العالمية من عينات الدجاج منخفض-وفرة الجنينية.
Abstract
إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) تقنية تستخدم على نطاق واسع لرسم خرائط التعريب histones بوستترانسلاتيونالي المعدلة أو المتغيرات هستون، عوامل النسخ أو تعديل الكروماتين الإنزيمات في موضع معين، أو على نطاق الجينوم. مزيج فحوصات رقاقة مع الجيل التالي التسلسل (أي رقاقة Seq) نهج قوية لكشف الشبكات التنظيمية الجينات على الصعيد العالمي وتحسين الشروح الوظيفية من الجينوم، لا سيما من تسلسل تنظيمي غير الترميز. عادة ما تتطلب البروتوكولات رقاقة كميات كبيرة من المواد الخلوية، مما حال دون إمكانية تطبيق هذا الأسلوب للتحري عن أنواع نادرة من الخلية أو خزعات الأنسجة الصغيرة. من أجل جعل المقايسة رقاقة متوافقة مع كمية المواد البيولوجية التي يمكن الحصول عليها عادة في فيفو خلال أوائل embryogenesis الفقاريات، يصف لنا هنا بروتوكولا رقاقة مبسطة التي عدد الخطوات اللازمة لإكمال تم تخفيض مقايسة للتقليل من فقدان عينة. هذا البروتوكول رقاقة قد استخدمت بنجاح للتحقيق التعديلات هيستون مختلفة في مختلف الدجاج الجنينية والأنسجة الماوس الكبار استخدام منخفضة إلى أرقام الخلية المتوسطة (5 × 104 -5 × 105 الخلايا). الأهم من ذلك، هذا البروتوكول متوافقاً مع تكنولوجيا رقاقة seq استخدام أساليب إعداد المكتبة القياسية، وبالتالي توفير ابيجينوميك العالمية خرائط في الأنسجة الجنينية جداً ذات الصلة.
Introduction
هيستون بوستترانسلاشونال التعديلات بصورة مباشرة في العمليات المعتمدة على الكروماتين المختلفة، بما في ذلك النسخ والنسخ المتماثل والحمض النووي إصلاح1،،من23. وعلاوة على ذلك، تظهر التعديلات المختلفة هستون إيجابية (مثلاً، H3K4me3 و H3K27ac) أو السلبية (مثلاً، H3K9me3 و H3K27me3) العلاقات المتبادلة مع التعبير الجيني ويمكن تعريفها بشكل عام تحتفل هيستون تفعيل أو القمعية، على التوالي من2،،3. ونتيجة لذلك، ظهرت خرائط التعديل هيستون العالمية، كما يشار إلى خرائط ابيجينوميك، كأدوات قوية وعالمية تعليم وظيفيا جينومات الفقارية4،5. على سبيل المثال، تسلسل تنظيمي القاصي مثل كما يمكن تحديد القدرة على استناداً إلى وجود التواقيع الكروماتين محددة (مثلاً، نشط معززات: H3K4me1 و H3K27ac)، التي تميزها عن مناطق المروج الدانية (مثلاً، المروجين نشطة: H3K4me3)6،،من78. من ناحية أخرى، توجد الجينات مع المهام التنظيمية هوية الخلية الرئيسية عادة مع مجالات واسعة الكروماتين ملحوظ مع H3K4me3 أو H3K27me3، استناداً إلى حالة نشطة أو غير نشطة ترانسكريبتيونالي الجينات الكامنة على التوالي9 ،10. وبالمثل، يبدو التعبير عن الجينات هوية الخلية الرئيسية بشكل متكرر التحكم متعددة ومكانيا متفاوت القدرة على (أي، فائقة القدرة على)، التي يمكن تحديدها كمجالات واسعة بعلامات H3K27ac11.
حاليا، يتم إنشاؤها هستون تعديل خرائط استخدام seq رقاقة التكنولوجيا، والتي توفر الدقة العالية، القطع الأثرية أقل وأقل ضوضاء وتغطية أكبر وأقل بالمقارنة مع النهج السابقة مثل رقاقة رقاقة (شريحة بالإضافة إلى [ميكروارس]) تكاليف12. ومع ذلك، قد توليد خرائط ابيجينوميك باستخدام تكنولوجيا رقاقة seq قصورها المتأصلة، معظمها المرتبطة بالقدرة على القيام بنجاح برقاقة في عينات الفائدة. التقليدية رقاقة البروتوكولات المطلوبة عادة ملايين خلايا، التي حد خطوط انطباق هذا الأسلوب إلى المختبر في الخلية أو الخلايا التي يمكن بسهولة معزولة في فيفو (مثل خلايا الدم). في السنوات القليلة الماضية، عددا من البروتوكولات رقاقة معدلة متوافقة مع أرقام الخلية منخفض قد وصف13،14،،من1516. بيد أن هذه البروتوكولات مصممة خصيصا أن يقترن ذلك بتسلسل الجيل المقبل (أي رقاقة seq) وهم عادة استخدام المخصص المكتبة إعداد أساليب13،14، 15 , 16.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول رقاقة التي يمكن استخدامها للتحقيق هستون تعديل التشكيلات الجانبية باستخدام أرقام الخلية منخفضة إلى متوسطة (5 × 104 -5 × 105 خلايا) أما المكاني المحدد (أي رقاقة qPCR) أو على الصعيد العالمي (أي، رقاقة seq) (الشكل 1). عندما يقترن بتكنولوجيا رقاقة seq، يمكن استخدام بروتوكول رقاقة لدينا جنبا إلى جنب مع أساليب إعداد المكتبة القياسية، مما يجعلها متاحة على نطاق واسع للعديد من المختبرات10. تم استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في عدة علامات هيستون (مثلاً، H3K4me3 و H3K27me3 و H3K27ac) في الأنسجة الجنينية الدجاج مختلفة (مثلاً، العمود الفقري الأنبوب العصبي (SNT) وبرومينينسيس فرونتوناسال و epiblast). ومع ذلك، ونحن نتوقع أن يكون نطاق واسع ينطبق على غيرها من الكائنات الحية فيها عينات ذات صلة من الناحية البيولوجية و/أو سريرياً يمكن فقط الحصول على كميات منخفضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان الألمانية، لا الموافقة على "رعاية الحيوان مؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) ضروري للقيام بتجارب الأجنة الدجاج. وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية، فقط التجارب مع الدجاج HH44 الأجنة (18 يوما) وكبار السن وتتطلب موافقة إياكوك. ومع ذلك، كانت الأجنة المستخدمة في هذه الدراسة في المراحل الأولى من التنمية الجنينية (أي HH19 (ح 72))-
ملاحظة: الغرض من هذا البروتوكول تقديم وصف مفصل للمقايسة رقاقة حيث أنها يمكن أن تكون فعالية جنبا إلى جنب مع qPCR أو تسلسل الجيل المقبل (أي رقاقة seq) للتحقيق في التعديلات هيستون في عينات قليلة-وفرة الجنينية (تتراوح من 5 × 10 4-5 × 10 5 خلايا لكل رد فعل رقاقة) وأنواع مختلفة من الأنسجة ( الشكل 1). ينبغي أن يكون البروتوكول تنطبق على التحقيق في ملامح ربط عوامل النسخ وتفعيل المشارك (مثلاً، p300). ومع ذلك، نظراً لوفرة هذه البروتينات التنظيمية الأدنى، إعداد أكبر من الخلية يرجح أن تكون المطلوبة (5 × 10 5-5 10 6 خلايا لكل رد فعل رقاقة).
1-إعداد البيض وميكروديسيكشن من "سنة الدجاج"
ملاحظة: يختلف الإجراء ميكروديسيكشنز من الناحية التقنية من الأنسجة للأنسجة ومن الحيوان نموذج إلى نموذج الحيوان. يصف هذا القسم بالتفصيل تشريح البروتوكول المستخدمة للحصول على عضدي سنت المقاطع من مرحلة HH19 أجنة الدجاج كمثال-
- احتضان البيض الدجاجة القبعة البيضاء الخصبة، التي تم الحصول عليها من مربي محلية، في اتجاه أفقي في 37 درجة مئوية و 80% من الرطوبة لمدة 3 أيام للحصول على المرحلة HH19 أجنة الدجاج.
- تحديد مراحل وفقا همبرغر وهاملتون الدجاج الجنينية الإنمائية التدريج نظام 17-
- أداء ميكروديسيكشنز جميع الظروف الباردة؛ وخلاف ذلك، يمكن أن تتعرض للخطر سلامة الكروماتين.
- عزل الأجنة HH19.
- لإتاحة الأجنة، استخراج 3 مل الزلال استخدام حقنه 10 مل بإبرة (0.90 × 40 مم) إلى انخفاض في بلاستوديرم.
- جعل فتحه صغيرة في البيض باستخدام مقص جيد وإضافة 1 مل من محلول لوك (انظر المواد التكميلية للوصفة) لتسهيل إزالة الأغشية الجنينية خارج-
- حقن محلول الحبر الأسود الهندي/لوك 10% باستخدام حقنه 1 مل بإبرة (0.55 × 25 مم 2) تحت بلاستوديرم جعل تصور الأجنة أسهل.
- قطع خارج الجنينية الغشاء الذي يحيط بالجنين باستخدام مقص غرامة الجراحية الطبية وملقط.
- استخدام ملعقة مثقبة لنقل الجنين إلى سم 4.5 طبق بتري يحتوي على 20 مل 1 × الحل PBS.
- تشريح بعيداً في amnion والأجزاء المتبقية من الأغشية الجنينية الخارجة عن استخدام مقص جيد والملقط تحت ستيريوميكروسكوبي.
- قص الجزء سنت عرضية على مستوى عضدي الجنين، تمتد كاودالي في منطقة الصدر لعزل سنت ( الشكل 2).
- إزالة الأنسجة المحيطة أفقياً/بطنيا SNT (مثل، لوحة جانبية mesoderm والأديم الظاهر، notochord والشريان الاورطي) استخدام الملقط ( الشكل 2).
- تزج كل قطعة SNT تشريح الدجاج في 3.5 سم طبق بتري يحتوي على 5 مل من الحارة (37 درجة مئوية) التربسين (التربسين/يدتا الحل 1: 250)-
- وقف العلاج التربسين عند تفكك الأنسجة غير العصبية حول سنة الكشف عن تحت ستيريوميكروسكوبي.
ملاحظة: الوقت تريبسينيزيشن يجب أن تكون رقابة مشددة لتجنب الإفراط في الهضم وتشتت الأنسجة العصبية، والاحتفاظ بالسلامة الهيكلية سنة- - بعد العلاج التربسين، إزالة الأنسجة الوسيطة وعسر المتبقية يدوياً إعداد القسم SNT نظيفة.
- نقل المقطع SNT إلى أنبوب 1.5 مل وفلاش-تجميد من النتروجين السائل. مرة واحدة كافية SNT المقاطع المتراكمة (تجمع SNT الفروع من أجنة الدجاج ~ 30 لرد فعل شريحة واحدة)، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: إذا كان يكفي الأنسجة الجنينية (أي 5 × 10 5-5 × 10 6 خلايا) يمكن تشريح من واحدة أو عدد قليل من أجنة الدجاج، ثم تجميد ليس من الضروري ومن الممكن المضي مباشرة إلى الخطوات التالية. يرجى الرجوع إلى دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها في الجدول 1-
ملاحظة: تنبيه! النتروجين السائل بدرجة حرارة منخفضة للغاية، وارتداء حماية ملائمة.
2. البروتينات كروسلينكينج للحمض النووي: 1 يوم
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات على الجليد، ما لم ينص على خلاف ذلك.
- إضافة 500 ميليلتر من دميم مع 10% FBS و 10 ميليلتر من 1 م نا butyrate مباشرة للأنسجة المجمدة، أو بدلاً من ذلك، فورا إلى الأنسجة تشريح الطازجة. مجانسة الخلايا بإعادة تعليق بلطف مع ماصة 1 مل.
ملاحظة: إضافة butyrate نا اختياري ولكن يوصي إذا كان التحقيق acetylation هيستون. بدلاً من FBS دميم-10%، ويمكن حراكه عينات في برنامج تلفزيوني 1 x مع جيش صرب البوسنة 0.1%. إضافة FBS أو جيش صرب البوسنة اختياري، ولكن يسهل التكوير العينات في الخطوات اللاحقة استخدام الطرد المركزي. - إضافة 13.5 ميليلتر من 37% فورمالدهيد (1% فورمالدهايد النهائي) ووضعه على دوار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
ملاحظة: تنبيه! الفورمالديهايد السامة. - إضافة 25 ميليلتر من 2.5 م جليكاين إلى الأنبوب ووضعه على دوار لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة آرو والفورمالديهايد.
- تدور الأنبوب في 850 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في أجهزة الطرد مركزي في أعلى الجدول. تجاهل المادة طافية.
- يغسل بيليه مرة واحدة مع 500 ميليلتر من البرد يغسل الطازجة المخزن المؤقت (انظر المواد التكميلية للوصفة)، أجهزة الطرد المركزي في 850 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وتجاهل المادة طافية.
3. تحلل وسونيكيشن
- تحلل كامل إعداد المخزن المؤقت (رطل) (انظر المواد التكميلية للوصفة) والبرد على الجليد. لمل 1، استخدم ميليلتر 950 رطلا وميليلتر 40 من تركيز مثبط البروتياز (25 س) 10 ميليلتر من 100% بمسف.
- ريسوسبيند بيليه في 300 ميليلتر من رطل كامل من بيبيتينج ووضعه على منصة هزاز لمدة 10 دقائق في 4 ° C.
- Sonicate العينات باستخدام الإعدادات التالية: Temp = 4 درجات مئوية، مجموع الوقت = 7 دقائق، “ على ” الفاصل الزمني = 30 s، “ قبالة ” الفاصل الزمني = 30 ثانية، السعة = 25%
ملاحظة: الشروط سونيكيشن بحاجة إلى أن يكون الأمثل لكل الأنسجة وستختلف سونيكاتور المستخدمة. من المستحسن استخدام الإعدادات sonication أدنى أن تسفر عن الحمض النووي المنفصمة يتراوح من 200 إلى 600 شركة بريتيش بتروليوم في الحجم. القص يختلف اختلافاً كبيرا تبعاً لنوع النسيج، كانتيتاي وحجم sonication وظروف crosslinking والمعدات. يرجى الرجوع إلى دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها في الجدول 1- - تدور عينة سونيكاتيد في 16,000 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية بيليه الحطام الخلوية. نقل
- ليساتي (المادة طافية) إلى أنبوب 1.5 مل طازجة.
ملاحظة: في حالة انطلاق المواد التي تعتبر كافية لتجربتين رقاقة، ثم 300 ميليلتر من رطل كاملة يمكن إضافة إلى الكروماتين سونيكاتيد (أي الحجم النهائي: 600 ميليلتر)-
سونيكاتيد أوكتيلفينول - ميليلتر إضافة 30% 10 اثوكسيلاتي لكل 300 ميليلتر من ليساتي (التركيز النهائي: 1%)، ومزيج من بيبيتينج.
ملاحظة: تنبيه! أوكتيلفينول اثوكسيلاتي ذات سمية حادة (عن طريق الفم، الجلد، الاستنشاق).
4. حضانة جسم
سونيكاتيد ميليلتر- قاسمة 330 من إلى أنبوبين 1.5 مل: 300 ميليلتر لرقاقة و 30 ميليلتر كعنصر تحكم الإدخال (10% المواد البداية). مخزن " 30 ميليلتر التحكم بإدخال نموذج " في-20 درجة مئوية.
ملاحظة: إذا كان يتم تنفيذ اثنين من ردود فعل شريحة من نفس العينة، ثم ميليلتر 660 من سونيكاتيد ليستي يمكن أن توزع في ثلاثة أنابيب 1.5 مل (300 ميليلتر لرقاقة #1 و 300 ميليلتر لرقاقة #2 ميليلتر 60 كعنصر تحكم الإدخال (20% المواد بدءاً من كل شريحة) ). - بإضافة 3-5 ميكروغرام من جسم إلى ميليلتر 300 اليكووت سونيكاتيد الكروماتين وعكس لمزيج.
ملاحظة: في هذه الدراسة، أنجز كل رد فعل رقاقة مع جسم معين لثلاثي H3 هيستون ميثليته في K4 (H3K4me3)، H3 هيستون دي ميثليته في K4 (H3K4me2)، ثلاثي H3 هيستون ميثليته في K27 (H3K27me3)، و H3 هيستون ثلاثي أسيتيليشن في K27 (H3K27me3). أن نجاح هذا البروتوكول تعتمد اعتماداً كلياً على نوعية الأجسام المضادة المستخدمة. ينبغي أن يكون الضد محددة وفعالة في إيمونوبريسيبيتيشن البروتين محددة. من المهم تحديد كمية الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها في إيمونوبريسيبيتاتي البروتين كروسلينكيد-الحمض النووي المعقدة. أيضا، يمكن التحقق من خصوصية الجسم بوصمة عار الغربية التأكد من أن الكشف عن البروتين الصحيح. جسم يقوم بالكشف عن عدة نطاقات غير محدد لا ينصح لرقاقة. - ضع الأنبوب على منصة هزاز عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها (12-16 ح) لربط الأجسام المضادة الكروماتين-
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها في الجدول 1-
5. إعداد حبات مغناطيسية: 2 يوم
- الكوة 50-100 ميليلتر من الملاط حبة ز البروتين المغناطيسي لكل رد فعل رقاقة إلى 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب على مدت أغسل
- الخرز المغناطيسي ثلاث مرات مع الحل الكتلة الباردة (انظر المواد التكميلية للوصفة) (4 درجات مئوية). إضافة 500 ميليلتر من حل كتلة باردة ومزيج بعكس أو التحريك. وضع الأنبوبة في حامل مغناطيسية وانتظر الخرز لتسوية على جانب الأنبوب. من أجل إيقاف السائل واضحة وتكرار. بعد الغسيل الأخير، إزالة جميع السائل مع تلميح هلام-تحميل-
6. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين
- إضافة 300 ميليلتر من الكروماتين جسم زمنياً الخرز غسلها وعكس لخلط-
- تدوير عمودياً على المدورة أنبوب في 4 درجات مئوية على الأقل 4 ح ربطه الجسم الخرز.
7. تغسل والوت وعكس في كروسلينكس
- "البرد ريبا يغسل المخزن المؤقت" (انظر المواد التكميلية للوصفة) على الجليد، وتعيين حمام المياه إلى 65 درجة مئوية، وبريكول أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجة مئوية. تغسل حبات الكروماتين زمنياً أربع مرات في 1 مل ريبا البارد يغسل المخزن المؤقت
- والحفاظ على الجليد. للقيام بذلك، إضافة 1 مل من البرد "ريبا يغسل المخزن المؤقت" ومزيج بعكس أو التحريك. ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية وانتظر الخرز لتسوية على جانب الأنبوب. من أجل إيقاف السائل واضحة وكرر.
ملاحظة: قد تحتاج إلى عدد يغسل مع "المخزن المؤقت ليغسل ريبا" الأمثل تبعاً لنوع العينة ووفرة عينة، والأجسام المضادة المستخدمة. عدد متزايد من يغسل يقلل من الخلفية ولكن أيضا انخفاض المبلغ الإجمالي للحمض النووي تم استردادها، والتي يمكن أن تسيء تحليل المتلقين للمعلومات التي قبكر أو ما يليها رقاقة - إضافة 1 مل من الشركة المصرية للاتصالات/50 مم كلوريد الصوديوم في الأنبوب ونقل الخرز الكروماتين زمنياً في الشركة المصرية للاتصالات/50 مم كلوريد الصوديوم إلى أنبوب جديد 1.5 مل [ميكروفوج] قبل إزالة السائل باستخدام حامل المغناطيسي، كما هو موضح أعلاه.
- تدور الخرز في 900 غ س لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، ووضع الأنبوب يعود إلى صاحب التسجيل المغناطيسي، وإزالة جميع ما تبقى من الشركة المصرية للاتصالات مع تلميح هلام-تحميل-
- إضافة 210 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت (انظر المواد التكميلية للوصفة) في درجة حرارة الغرفة وريسوسبيند بالتحريك.
- الوتي لمدة 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية في كتلة حرارة أثناء الهز.
- تدور الخرز في 16,000 س ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ووضع الأنبوب في حامل المغناطيسي.
- نقل المادة طافية (~ 200 ميليلتر) إلى أنبوب [ميكروفوج] جديدة حالما استقر الخرز.
- ذوبان الجليد عينات التحكم الإدخال (30 ميليلتر) من-20 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة (المجمدة في الخطوة 4، 1) وإضافة 3 مجلدات شطف المخزن المؤقت (90 ميليلتر) وتخلط بإيجاز فورتيكسينج.
- احتضان عينات الرقائق والتحكم في 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها (12-16 ح) لعكس في كروسلينكس-
8. هضم البروتينات الخلوية والحمض النووي الريبي: 3 يوم
- 8.1At الغرف درجة الحرارة وإضافة 1 حجم المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات كل أنبوب (لتمييع الحزب الديمقراطي الصربي) وعكس لخلط: إضافة ميليلتر 120 من الشركة المصرية للاتصالات إلى 120 ميليلتر من نموذج عنصر تحكم و 200 ميليلتر من الشركة المصرية للاتصالات إلى 200 ميكروليتر من عينة رقاقة.
- "إضافة رناسي" بتركيز 0.2 مغ/مل النهائي وعكس لخلط: إضافة 2.4 ميليلتر من 20 ملغ/مل رناسي A ميليلتر 240 من نموذج عنصر تحكم وميليلتر 4 من 20 ملغ/مل رناسي ألف إلى 400 ميليلتر من العينة رقاقة.
- احتضان هذه الأنابيب عند 37 درجة مئوية في حمام مائي ح 2 لهضم الجيش الملكي النيبالي-
- "ك بروتيناز إضافة" إلى تركيز نهائي 0.2 مغ/مل وعكس لخلط: إضافة 2.4 ميليلتر من 20 ملغ/مل بروتيناز ك ميليلتر 240 من نموذج عنصر تحكم وميليلتر 4 من 20 ملغ/مل بروتيناز ك إلى 400 ميليلتر من العينة رقاقة.
- إينكوباتي في 55 درجة مئوية في حمام مائي ح 2 هضم البروتين، وتنقية الحمض النووي-
9. رقاقة--قبكر
ملاحظة: تنفيذ استخراج الحمض النووي وتنقية، كما هو موضح في المواد التكميلية.
ملاحظة: التحقق من كفاءة سونيكيشن كما هو موضح في المواد التكميلية، للتأكد من الحصول على 200 إلى 500 bp شظايا من الحمض النووي ( الشكل 3).
ملاحظة: خطوة حاسمة لتحديد إذا عملت في الواقع الرقاقة. إذا كان من المعروف هناك مواقع الربط الجينوم لبروتين الفائدة، كبسولة تفجير يمكن المصممة ل PCR الكمي (qPCR) لتحديد إذا كانت المواقع المعروفة هي تحديداً أثري في "رقاقة الحمض النووي"، بالمقارنة مع مناطق مراقبة سلبية ليس من المتوقع أن تكون ملزمة كانديتاريخ البروتينات. على سبيل مثال، يظهر هذا العمل qPCR رقاقة النتائج المتحصل عليها مع رقائق المنجز ل H3K4me3 (مارك هيستون المروج النشط) و H3K27me3 (مارك هيستون المروج غير نشط) في أقسام SNT عزل من الأجنة الفرخ HH14 ( الشكل 4A ).
- مزيج كل زوج التمهيدي (إلى الأمام أو عكس) في الأنبوب نفسه وتعد تركز أسهم في 20 ميكرومتر كل استخدام dH 2 س (الجدول 2).
ملاحظة: يجب أن يتم تقييم كفاءة كل زوج التمهيدي قبل تحليل رقاقة--قبكر- - استخدام عنصر تحكم الإدخال رقاقة و 20% الحمض النووي التي تم الحصول عليها في الخطوة 8.5 للتحسين قبكر.
ملاحظة: إدخال الحمض النووي عادة تضعف x 20 (إلى 1% لانطلاق المواد المستخدمة في التفاعلات رقاقة) لتحليل qPCR. - لكل 10 ميليلتر من بكر، خلط المكونات التالية في أنبوب بكر: للحمض النووي mastermix، إضافة 2 ميليلتر من dH2O و 2.5 ميليلتر من مزيج سيبر خضراء 1 ميليلتر من الحمض النووي (من شرائح أو الإدخال 1%)؛ mastermix مع الإشعال ، إضافة ميليلتر 2.375 dH2O و 2.5 ميليلتر من مزيج سيبر الأخضر 0.125 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام وعكس مزيج.
- خلط العينات قبل فورتيكسينج 2 s والطرد المركزي بإيجاز في 900 غ س لدقيقة 1
- إجراء PCR الوقت الحقيقي (الإشعال وركوب الدراجات الشروط المستخدمة هنا يمكن العثور على مثال في الجدول 2 و الجدول 3، على التوالي).
ملاحظة: تحليل البيانات رقاقة--قبكر: إشارات رقاقة تحسب كنسبة المدخلات. بإيجاز، مرة الأشعة المقطعية يتم الحصول على قيم لكل رد فعل qPCR، عامل إضعاف لدورات 100 أو 6.644 (log2 100) يتم تطبيق القيم المقطعية الحصول على ردود فعل الحمض النووي الإدخال. ثم، لمنطقة معينة من الفائدة (أي زوج التمهيدي)، إشارات رقاقة وتحسب كما يلي:
تعديل الإدخال = Ct (مدخلات)-6.644
إشارة رقاقة = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)
10-إعداد مكتبة شرائح seq؛ الإصلاح نهاية: يوم 4
- إضعاف ما يصل إلى 100 نانوغرام من رقاقة الحمض النووي في 60 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت (انظر المواد الجدول).
- إضافة 40 ميكروليتر من نهاية إصلاح ميكس و "الماصة؛" 10 مرات بلطف.
- إينكوباتي في 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على cycler حرارية.
- دوامة المغناطيسي الخرز وإضافة 160 ميكروليتر إلى الأنبوب الذي يحتوي على مزيج إصلاح نهاية. مزيج دقيق من بيبيتينج 10 مرات. احتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
- ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية وانتظر الخرز لتسوية على جانب أنبوب...
- من أجل إيقاف السائل واضح.
- مع إبقاء الأنبوب على حامل المغناطيسي، إضافة 200 ميكروليتر طازجة 80% EtOH.
- إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة 30 ثانية وتجاهل المادة طافية. كرر مرة واحدة...
- إبقاء الأنبوب لمدة 15 دقيقة على حامل المغناطيسية في درجة حرارة الغرفة. بمجرد بيليه الجافة، إزالة الأنبوب من صاحب المغناطيسي.
- ريسوسبيند بيليه في 20 ميكروليتر من استثارة المخزن المؤقت. بلطف "الماصة؛" 10 مرات مزيج دقيق.
- إينكوباتي لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة- ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية
- وانتظر الخرز لتسوية على جانب الأنبوب. نقل 17.5 ميكروليتر من المادة طافية إلى أنبوب جديد.
11. إعداد مكتبة شرائح seq؛ 3 أدينيلاتي ' ينتهي
- ميكروليتر 12.5 إضافة مزيج أ-تراجع إلى الجديد من أنبوب ومزيج دقيق من قبل بيبيتينج برفق صعودا وهبوطاً 10 مرات. ضع الأنبوبة في cycler حرارية واحتضان وفقا للبرنامج التالي: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وعقد في 4 درجات مئوية
12. إعداد مكتبة شرائح seq؛ سد محولات
- ميكروليتر 2.5 إضافة لاستثارة المخزن المؤقت، وميكروليتر 2.5 من مزيج ربط وميكروليتر 2.5 من الفهرس محول الحمض النووي الريبي المناسبة. مزيج دقيق من قبل بيبيتينج برفق صعودا وهبوطاً 10 مرات.
- إينكوباتي على cycler حرارية لمدة 10 دقائق في 30 °.
- ميكروليتر إضافة 5 لإيقاف عملية ربط المخزن المؤقت ومزيج دقيق من قبل بيبيتينج 10 مرات.
- دوامة المغناطيسي الخرز وإضافة ميكروليتر 42.5 للعينة. مزيج دقيق من بيبيتينج 10 مرات. احتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
- ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية وانتظر الخرز تسوية على جانب الأنبوب ومن أجل إيقاف السائل واضحة
- مع إبقاء الأنبوب على حامل المغناطيسي، إضافة 200 ميكروليتر طازجة 80% EtOH.
- إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة 30 ثانية وتجاهل المادة طافية. كرر مرة واحدة.
- إبقاء الأنبوب على حامل المغناطيسية، والسماح العينة أيردري على 15 دقيقة. إزالة الأنبوب من صاحب المغناطيسية
- وريسوسبيند بيليه في ميكروليتر 52.5 استثارة المخزن المؤقت. مزيج دقيق من بيبيتينج 10 مرات. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة، ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية وانتظر الخرز لتسوية على جانب الأنبوب. نقل 50 ميكروليتر من المادة طافية واضحة إلى أنبوب جديد.
- دوامة المغناطيسي الخرز وإضافة 50 ميكروليتر إلى العينة. مزيج دقيق من بيبيتينج 10 مرات. احتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
- ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية وانتظر الخرز تسوية على جانب الأنبوب ومن أجل إيقاف السائل واضح.
- مع إبقاء الأنبوب على حامل المغناطيسي، إضافة 200 ميكروليتر طازجة 80% EtOH.
- إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة 30 ثانية وتجاهل المادة طافية. كرر مرة واحدة.
- الاحتفاظ بالانبوب على حامل المغناطيسي، واسمحوا الهواء العينة الجافة ل 15 دقيقة إزالة الأنبوب من صاحب المغناطيسية
- وريسوسبيند بيليه في ميكروليتر 27.5 استثارة المخزن المؤقت. مزيج دقيق من قبل بيبيتينج 10 مرات.
- إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة، ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية وانتظر الخرز لتسوية على جانب الأنبوب. نقل 25 ميكروليتر من المادة طافية واضحة إلى أنبوب جديد.
13. إعداد مكتبة شرائح seq؛ التضخيم من "شظايا من الحمض النووي"
أنبوب- 12.5 مكان ميليلتر من القالب في مل 0.2 PCR. إضافة 2.5 ميكروليتر من التمهيدي PCR كوكتيل، 10 ميكروليتر من المحسن بكر ميكس-مزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 مرات. ضع الأنبوبة في cycler حرارية واستخدام الشروط الموضحة في الجدول 4-
- دوامة المغناطيسي الخرز وإضافة 25 ميكروليتر إلى العينة. مزيج دقيق من بيبيتينج 10 مرات. احتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
- ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية، والانتظار الخرز تسوية على جانب الأنبوب ومن أجل إيقاف السائل واضح.
- مع إبقاء الأنبوب على حامل المغناطيسي، إضافة 200 ميكروليتر طازجة 80% EtOH. احتضان في درجة حرارة الغرفة 30 ثانية وتجاهل المادة طافية. كرر مرة واحدة. إزالة الأنبوب من صاحب المغناطيسي
- إبقاء الأنبوب على حامل المغناطيسية، واسمحوا الهواء العينة الجافة ل 15 دقيقة وريسوسبيند بيليه في ميكروليتر 32.5 استثارة المخزن المؤقت. مزيج دقيق من قبل بيبيتينج 10 مرات. احتضان
- بكر/لوحة الأنبوب لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وضع الأنبوب أو لوحة بكر على الوقوف المغناطيسية في درجة حرارة الغرفة، والانتظار الخرز تسوية على جانب الأنبوب ونقل ميكروليتر 30 من المادة طافية إلى أنبوب جديد.
14. إعداد مكتبة شرائح seq؛ التحقق من صحة مكتبة
ملاحظة: يتم تنفيذ التحقق المكتبة باستخدام نظام مراقبة جودة الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي. إعداد للسلم: ميليلتر 1 الكوة سلم الدنا الجينومي في الأول أنبوب/جيدا وإضافة 3 ميليلتر من المخزن المؤقت عينة.
- إعداد العينة: مزيج 1 ميليلتر من العينة مكتبة (10-100 نانوغرام/ميليلتر) مع 3 ميليلتر من المخزن المؤقت للعينة في أنبوب. زيادة ونقصان لأسفل، ومن ثم دوامة في السرعة القصوى لتدور س. 5 وصولاً إلى موقف العينة في الجزء السفلي من الأنبوب.
- تحميل العينات في نظام مراقبة الجودة-
- بمجرد اكتمال التشغيل، تحليل النتائج بتعيين التباين في القيمة القصوى للتأكد من لا مبلمر موجودة في العينة ( الشكل 5)؛ وينبغي أن تتوافق مع مبلمر في عصابة حوالي 135 بي بي. إذا كانت موجودة حتى عصابة ضعيفة، الشروع في تنظيف ثانية بإضافة شطف المخزن المؤقت (انظر جدول المواد) يصل إلى وحدة تخزين 50 ميليلتر وإضافة 47.5 ميليلتر من حبات مغناطيسية مختلطة. إذا كان تركيز العينة منخفضا جداً (< 2 نانومتر)، والشروع في تشغيل الاسترداد (الخطوة 13.1)، واستخدام دورات 18 بدلاً من 15، ومع حجم العينة 12.5-ميليلتر غادر من الخطوة 12.16.
- قياس المكتبات على حدة قبل قبكر باستخدام أدوات متوفرة تجارياً.
ملاحظة: تجمعات المكتبات يمكن أن تكون متسلسلة استخدام المنظم مع واحد-قراءة 1 × 50 nt بروتوكول يهدف إلى ما يلي: 30 م/عينة-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتوضيح أداء البروتوكول رقاقة لدينا، أجرينا رقاقة-seq تجارب باستخدام المقاطع سنت المجمعة من أجنة الدجاج HH19، برومينينسيس فكي علوي من HH22 الدجاج الأجنة، واجنة الدجاج HH3 مرحلة التحقيق ملامح ملزمة مختلف التعديلات هستون (أي، H3K4me2، H3K27ac، H3K4me3، و H3K27me3). بمجرد الحصول على "رقاقة السلطات الوطنية المعينة"، وكان تقييم كفاءة sonication [اغروس] هلام التفريد للسلطات الوطنية المعينة الإدخال المطابق (الشكل 3). ثم استخدمت رقاقة والإدخال المعينة لتحليل رقاقة qPCR لقياس الفاسدون في المكاني ومن المتوقع أن تكون أما منضم أو غير منضم بالتعديلات هيستون التحقيق (الشكل 4 أ). في المثال الموضح في إثراء الشكل 4Aو H3K27me3 و H3K4me3 قيمت مستويات في أقسام HH19 SNT برقاقة qPCR حول مناطق المروج SOX17 و SOX2، اثنين من الجينات التي غير نشطة ونشط في سنة، على التوالي. كما هو متوقع، المروج SOX2 بشدة تميزت H3K4me3 ولكن ليس عن طريق H3K27me3، في حين أظهرت المروج SOX17 النمط المعاكس (الشكل 4 أ). عن طريق تقييم مواضع قليلة، فمن الممكن لتقدير نوعية الرقاقة دون أن تفقد الكثير من المواد الحمض النووي المصب seq رقاقة التحليل. مرة واحدة وأكد نوعية الرقائق، وأعدت مكتبات seq رقاقة ومتسلسلة. تظهر المكاني ممثلة لكل من الأنسجة الجنينية الدجاج التحقيق: (ط) ملفات التعريف الخاصة ب H3K27me3 و H3K4me3 في الأجنة الفرخ سنت HH19 حول PAX7 (الشكل 4 باء)؛ (ثانيا) التشكيلات الجانبية ل H3K4me2 و H3K27ac في برومينينسيس فكي علوي لاجنة الدجاج HH22 حول SNAI1 (الشكل 4)؛ والشخصية (ثالثا) ل H3K27me3 في أجنة الدجاج HH3-المرحلة حول محور TBX3/TBX5 (الشكل 4). هذه التجارب seq رقاقة تبين بوضوح أن لدينا بروتوكول رقاقة يمكن استخدامها لإنشاء ملفات تعريف ابيجينوميك من كميات محدودة من المواد البيولوجية في طائفة واسعة من الأنسجة الجنينية.
رقم 1: نظرة عامة التخطيطي رقاقة بروتوكول للعينات منخفضة-وفرة الجنينية المعزولة من أجنة الدجاج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: لمحة موجزة عن البروتوكول ميكروديسيكشن سنة. يتم اقتطاع الجزء SNT عرضية على مستوى الجنين الدجاج HH19 عضدي. وبعد العلاج التربسين، تتم إزالة الأنسجة غير العصبية ميكانيكيا باستخدام الملقط. لا، نوتوتشورد؛ SNT، الأنبوب العصبي الشوكي؛ وهكذا، سوميتي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: مثال للأمثل Sonication. وكان سونيكاتيد عينة دجاج SNT HH19 لدورات 11، مع 30 ثانية على وق 45 OFF البقول في السعة "عالية" باستخدام سونيكاتور. تم عكس في كروسلينكس وتنقية الحمض النووي تم حلها على 1.5% [اغروس] هلام. ويلاحظ حجم جزء الأمثل بعد دورات 11، تتراوح بين 200-500 هناك الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 4: أمثلة الممثل لتحليل رقاقة رقاقة--قبكر أو ما يليها رقاقة (A) H3K27me3 (على اليسار) ومستويات H3K4me3 (يمين) في المناطق المشار إليها كانت تقاس برقاقة qPCR تحليل تنفيذ استخدام المقاطع SNT عزل من الأجنة الفرخ HH19. منطقة المروج SOX2 نشطة في سنت وهكذا تم وضع علامة H3K4me3 ولكن ليس عن طريق H3K27me3؛ منطقة المروج SOX17 غير نشطة في سنت وهو لذلك أثرت في H3K27me3 ولكن ليس في H3K4me3؛ الراتب Chr6 يمثل منطقة إينتيرجينيك في الدجاج الصبغي 6 ويعمل كعنصر سلبي. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري من ثلاثة replicates التقنية. (ب) رقاقة seq (H3K27me3 في أرجواني، و H3K4me3 باللون الأزرق، وإدخال باللون الأحمر) تظهر لمحات من الأجنة الفرخ سنتس HH14 حول محور PAX7. (ج) رقاقة seq (H3K4me2 اللون البرتقالي، و H3K27ac باللون الأخضر، وإدخال باللون الأحمر) تظهر لمحات من برومينينسيس فكي علوي الأجنة الفرخ HH22 حول محور SNAI1. (د) رقاقة-seq يتم إظهار التشكيلات الجانبية (H3K27me3 في أرجواني) والإدخال باللون الأحمر من الأجنة الفرخ HH3 حول محور TBX3/TBX5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: مثال على رقاقة seq "مكتبة التحقق من الصحة" باستخدام نظام مراقبة الجودة الحمض النووي الريبي الآلي. حللت نفس مكتبات seq رقاقة مع نظام مراقبة الجودة الحمض النووي الريبي قبل (A) وبعد تنظيف ديمر التمهيدي (ب). يمكن اعتبار مبلمر عصابة bp ~ 135 ضعيفة في (ألف). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الخطوات | المشكلة | السبب المحتمل | الحل |
| 1,2,3,4 5 و 11 | رقاقة المنخفضة إشارة إلى نسب الضوضاء وفقا لرقاقة--قبكر و/أو seq رقاقة | نوعية الأنسجة لما يثير الشبهة. | إجراء تشريح الدقيقة في الظروف الباردة؛ وإلا يمكن أن يتعرض للخطر سلامة الكروماتين. |
| فقدان عينة بعد الطرد المركزي عينات كروسلينكيد. | استخدام دميم المتوسطة مع 10-20% مصل أو الطرد المركزي تكرار الخطوة وزيادة الوقت إلى 10 دقيقة. | ||
| مدة العابرة للربط. | تحسين وقت كروسلينكينج. يمكن تيسير مرات crosslinking زيادة الكشف عن بعض البروتينات، مثل تفعيل المشارك والمشارك ريبريسورس التي لا تربط مباشرة للحمض النووي. | ||
| فقدان عينة بسبب يغسل متعددة في برنامج تلفزيوني. | تقليل عدد يغسل؛ يمكنك تكرار الخطوات الطرد المركزي في 1,500 س ز. | ||
| Sonication الأمثل أسفر عن أحجام الحمض النووي قصيرة جداً أو طويلة جداً. | إجراء تجربة دورة وقت لتحسين ظروف sonication. جزء الأمثل أحجام تتراوح بين 200 إلى 500 bp | ||
| جسم غير مناسب لشرائح. | استخدام جسم مختلفة ضد البروتين الذاتية أو جسم مضاد ضد علامة إضافة إلى بروتينات مناشئ المعلنة (مثل العلم، هكتار). | ||
| 12 | منخفضة أو لا إشارات في قبكر، حتى بالنسبة لإدخال الحمض النووي | كبسولة تفجير الأمثل | التحقق من كفاءة التمهيدي وخصوصية؛ تصميم كبسولة تفجير جديد. |
| كمية غير كافية من الحمض النووي | ليس ما يكفي من المواد البداية. زيادة كمية الحمض النووي المستخدمة لكل رد فعل قبكر. |
| كبسولة تفجير | التسلسل |
| SOX2 إف | ككتجكتججاجتاكجاكات |
| SOX2-R | جكككتجكاجتاكاكتككات |
| SOX17 إف | كككتجاكتجتكاتجتجتج |
| SOX17-R | كااكاجتجككتتجاجكا |
| Chr6-الراتب-F | ككجتكاتكتكتجكتجتجا |
| Chr6-الراتب-R | تجاتكتجكتجتكاكتجك |
الجدول 2: تسلسل التمهيدي لرقاقة qPCR.
| بريينكوبيشن | ||
| درجة الحرارة | الوقت | |
| 95 درجة مئوية | 5 دقيقة | |
| التضخيم | ||
| درجة الحرارة | الوقت | |
| 95 درجة مئوية | 10 s | |
| 60 درجة مئوية | 10 s | 45 |
| 72 درجة مئوية | 10 s | دورات |
| انصهار منحنى | ||
| درجة الحرارة | الوقت | |
| 95 درجة مئوية | 5 s | |
| 65 درجة مئوية | 1 دقيقة | |
| التبريد | ||
| 40 درجة مئوية | 30 s | |
الجدول 3: شروط PCR لرقاقة qPCR.
| تمسخ الأولى | ||
| درجة الحرارة | الوقت | |
| 95 درجة مئوية | 3 دقيقة | |
| التضخيم | ||
| درجة الحرارة | الوقت | |
| 98 درجة مئوية | 20 s | |
| 60 درجة مئوية | 15 s | 15 |
| 72 درجة مئوية | 30 s | دورات |
| التمديد النهائي | ||
| درجة الحرارة | الوقت | |
| 72 درجة مئوية | 5 s | |
| التبريد | ||
| 4 درجة مئوية | عقد | |
الجدول 4: شروط PCR لتضخيم شظايا من الحمض النووي أثناء إعداد مكتبة شرائح seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ابيجينوميك التنميط هستون تعديل استخدام seq رقاقة يمكن استخدامها لتحسين الشروح الوظيفية من جينومات الفقاريات في مختلف السياقات الخلوية4،5،18. يمكن استخدام هذه التشكيلات ابيجينوميك، من بين أمور أخرى، لتحديد العناصر محسن، تعريف الدولة التنظيمية من القدرة على (أي، نشط، جاهزة، أو تستعد)، وتحديد الخلية الرئيسية هوية المنظمين في بيولوجية مختلفة أو سياقات المرضية (مثل المجالات مروج H3K4me3 واسعة وسوبر-معززات)6،،من79،10،11،19. ومع ذلك، فرز معظم هستون تعديل ملفات تم إنشاؤها في خطوط الخلايا في المختبر والخلية الأنواع التي يمكن أن تكون سبب القيد الملازمة للمقايسة الرقائق، التي عادة ما يتطلب ملايين خلايا، في فيفو بكميات كبيرة 4-وقد وصف العديد من البروتوكولات seq رقاقة متوافقة مع أرقام الخلية منخفضة للغاية، وبالتالي توسيع نطاق أنواع الخلايا هائلة في الآونة الأخيرة، والأنسجة التي ابيجينوميك الملامح، من حيث المبدأ، يمكن إنشاء13 14، ،،من1516. هذه الرقاقة seq بروتوكولات جديدة كل الاعتماد على أساليب إعداد المكتبة المخصصة المحددة التي، على الأقل في بعض الحالات، تتطلب المعدات غير القياسية و/أو الكواشف14،،من1516.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول رقاقة تعمل مع منخفضة إلى أرقام الخلية المتوسطة (5 × 104 -5 × 105 خلايا) التي تم الحصول عليها في فيفو من الأنسجة الجنينية المختلفة10. لزيادة حساسية لدينا فحوصات رقاقة، ازلنا العديد من الخطوات التي تستخدم عادة خلال رقاقة، مثل الخلية متسلسلة وتحلل النووي، الذي يمكن أن يؤدي فقدان تدريجي للمواد الثمينة. وهكذا، بعد كروسلينكينج، تعامل مع مخزن مؤقت واحد تحلل العينات ويتم سونيكاتيد بعد ذلك تقليل الخسائر في عينة. الأهم من ذلك، لدينا رقاقة بروتوكول متوافق مع التحليل قبكر، مما يتيح تحليل ابيجينوميك المكاني المحدد للفائدة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يقترن لدينا بروتوكول رقاقة رقاقة seq مكتبة إعداد الأساليب القياسية، وبالتالي يجري يحتمل أن يكون مفيداً لمعظم المختبرات مع إمكانية الوصول إلى تكنولوجيا الجيل التالي التسلسل.
رقاقة والبروتوكولات seq رقاقة يمكن استخدامها ليس فقط للتحقيق لمحات ملزمة من التعديلات هيستون ولكن أيضا لكشف مواقع الربط للمنظمين النسخي الهامة الأخرى، مثل عوامل النسخ وتفعيل المشارك (مثلاً، p300 والجمارك وحماية الحدود)20. عادة، رقائق (ورقاقة seq) عوامل النسخ وتفعيل المشارك، التي ليست وفيرة كما وصفها هيستونيس، تتطلب مواد انطلاق أكثر كثيرا من رقائق لعلامات هيستون. وهكذا، وصف البروتوكول قد لا تعمل بالضرورة لمعظم عوامل النسخ أو تفعيل المشاركة ما لم يكن عدد ابتداء من الخلايا إلى حد كبير زيادة (مثلاً 5 × 105 -5 × 106 خلايا) و/أو محددة للغاية و وتتوفر الأجسام المضادة الفعالة. ومع ذلك، مع المزيد من التحسين، وأساليب إعداد المكتبة باستمرار تحسين، نتوقع أن تصبح seq رقاقة من المواد الخلوية محدودة عمليا لمعظم البروتينات التنظيمية.
على الرغم من أن لدينا رقاقة بروتوكولي seq رقاقة وقد صودق على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من التعديلات هيستون والأنسجة الجنينية، نود تسليط الضوء على بعض الخطوات الحاسمة التي نعتبرها أساسية لتوليد ملفات تعريف ابيجينوميك عالية الجودة. أولاً، يلزم العينات الجنينية تكون طازجة معزولة تحت الظروف التي لا تعرض للخطر سلامة الكروماتين. وهذه تشمل إجراء تشريح تحت ظروف البرد أو فلاش-تجميد العينات المجمعة حتى تراكمت مواد كافية. خطوة حاسمة أخرى هي سونيكيشن، الذي يحتاج إلى دقة الأمثل لأداء رقائق عالية الجودة. كثيرا ما تختلف الظروف المثلى سونيكيشن، تبعاً لنوع النسيج، كمية الأنسجة، أو سونيكاتور قيد الاستخدام. أخيرا وليس آخراً، في نهاية المطاف شريحة ناجح يعتمد على توافر المحددة والمتوافقة مع رقاقة أضداد البروتينات ذات الاهتمام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفون لا تملك أي تضارب المصالح المالية التي يجب الكشف عنها.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون يان أبيل لمساعدته التقنية ممتازة أثناء وضع هذا البروتوكول. العمل في مختبر رادا-إغليسياس معتمد من قبل كممك داخلية التمويل، منح البحوث DFG (RA 2547/1-1، RA 2547/2-1، و "الشركة المصرية للاتصالات" 1007/3-1)، باحث متقدم. جامعة ابرطا المجموعة منحة، والمنحة سيكاد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH 8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1 Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100 - 1,000 µL Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2 - 20 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2 - 200 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5 - 10 µL Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10 mL) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5 –1,000 μL) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
References
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Kouzarides, T.
- Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K.
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
- Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
- Ho, J. W. K., et al.
- Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
- Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
