Summary
Bakgrunn autofluorescence av biologiske prøver kompliserer ofte fluorescens-baserte Bildeteknikker, særlig i alderen menneskelig postmitotic vev. Denne protokollen beskriver hvordan autofluorescence fra disse prøvene effektivt kan fjernes ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig lys emitting diode lys kilde photobleach prøven før immunostaining.
Abstract
Immunofluorescence er en felles metode som brukes til å visualisere subcellular rom og bestemme lokaliseringen av spesifikke proteiner i en Vevsprøve. En stor hindring oppkjøpet av høykvalitets immunofluorescence bilder er endogene autofluorescence av vev forårsaket av aldring pigmenter som lipofuscin eller vanlig eksempel forberedelse prosesser som aldehyd fiksering. Denne protokollen beskriver hvordan bakgrunnen fluorescens kan reduseres betraktelig gjennom photobleaching bruker hvit fosfor lys emitting diode (LED) matriser før behandling med fluorescerende sonder. Bredt spekter utslipp av hvitt fosfor lysdioder tillate bleking av fluorophores gjennom en rekke utslipp topper. Photobleaching apparatet kan konstrueres fra sokkel komponenter til meget lav pris og tilbyr et tilgjengelig alternativ til kommersielt tilgjengelige kjemiske quenchers. En photobleaching behandling av vev etterfulgt av konvensjonelle immunofluorescence flekker genererer bilder uten bakgrunn autofluorescence. Forhold etablert kjemiske quenchers som redusert sonde som bakgrunn signaler, photobleaching behandling hadde ingen effekt på sonde fluorescens intensitet mens det effektivt redusert bakgrunn og lipofuscin fluorescens. Selv om photobleaching krever mer tid for forbehandling, kan høyere intensitet LED matriser brukes til å redusere photobleaching. Denne enkle metoden kan potensielt brukes til en rekke vev, spesielt postmitotic vev som samler lipofuscin som hjernen og hjerte- eller skjelettlidelser muskler.
Introduction
Fluorescens mikroskopi bruker antistoffer rettet mot spesifikke proteiner brukes rutinemessig visualisere proteiner av interesse i cellekultur og vev. En stor komplikasjon til anskaffelsen av klare og definitive bilder i immunofluorescence er autofluorescence, som kan skyldes endogenously i pattedyr vev ved alder pigment lipofuscin og proteiner som elastin og kollagen1, 2. Andre kilder til autofluorescence kan bli introdusert gjennom eksempel klargjøringstrinn som aldehyd fiksering3. Lipofuscin korn, består hovedsakelig av oxidatively endret protein og lipid fornedrelse rester, akkumuleres i lang-levende celler med økt alder2. Dette skaper problemer i imaging postmitotic vev som hjernen og hjerte- eller skjelettlidelser muskler, som fluorescens utslipp spektrum av lipofuscin er bred og variabel, ofte sammenfallende med utslipp bølgelengden til felles fluorophores brukes for merking4. Disse faktorene gjør imaging hjernen vev fra tilfeller av sen-utbruddet nevrodegenerative sykdommer som frontotemporal lobar degenerasjon (FTLD) spesielt utfordrende.
For å redusere autofluorescence, har vi utviklet en teknikk der vi irradiate delene lysbilde montert vev med hvitt lys emitting diode (LED) matrise med en husholdning pulten lampen5. Denne enkle teknikken gir et alternativ til teknikker bruke kjemiske quenchers som CuSO4 ammonium acetate, eller kommersielt tilgjengelige slukke fargestoffer som Sudan svart B og Eriochrome svart T6. Det har også betydelig kostnadsbesparende over multispectral ledet lampe photobleaching teknikker og unngår komplikasjoner og gjenstander fra digitale autofluorescence fjerning metoder som spectral un blande7,8. Hvitt fosfor lysdioder har en bred utslipp spektrum, høy lysstyrke og lav produksjon kostnader, noe som gjør dem ideelle som en sokkel komponent for photobleaching en rekke chromophores5,9.
Denne protokollen, vi viser byggingen av en photobleaching apparater bruker tilgjengelige komponenter og bruke photobleaching på et tilfelle av FTLD vev som inneholder tau-positive Inneslutninger (FTLD-T) bruker et antistoff bestemt fosforylert tau. Vi viser effekten av photobleaching på imaging fluorescently-merket antistoffer ansette to vanlige chromophores: Alexa 488 og Texas rød. Effekten av photobleaching versus ubehandlet deler eller disse behandlet med en kommersiell kjemiske avsluttes er kvantifisert og sammenlignet. Denne photobleaching før behandling kan innlemmes i alle standard immunofluorescence fargeprotokoll fjerne autofluorescence i et biologiske utvalg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: arbeidet presentert ble utført i samsvar med anerkjente internasjonale standarder, inkludert den internasjonale konferansen om harmonisering (ICH), Rådet for internasjonale organisasjoner av medisinsk vitenskap (CIOMS) , og prinsippene for deklarasjon i Helsinki. Bruk av menneskelig vev var med godkjenning av universitetet helse nettverk forskning etikk kortet. Menneskelige hjerne prøvene ble samlet som en del av Maritime hjernen vev Bank. På tiden av samlingen, samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
1. bygging av photobleaching apparat og
- forberede lager løsninger.
- Forberede 1 L 1 x lager Tris-bufret (1 x TBS) saltløsning (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7.4) av oppløsning 8.77 g av NaCl og 6.06 g Tris base i 800 mL ddH 2 O og justere pH 7,4 bruker HCl. Bring opp til 1 L og autoclave. < / Li >
- forberede 10% (200 x lager) Natriumazid ved oppløsning 1 g Natriumazid i 10 mL av ddH 2 O (10%, 200 x lager).
- 1-3 standard størrelse lysbilder, bruke en enkelt 100 mm x 100 mm gjennomsiktig, firkantet Petriskål som et lysbilde kammer. For et enkeltlysbilde kammer, legge til 0,25 mL av 200 x natrium azide lager 50 mL 1 x TBS å lage en 0,05% azide-SS løsning. Stable 2-3 lysbildet kamre vertikalt for å behandle flere lysbilder. Forberede en ytterligere 50 mL av azide-SS løsning for hvert kammer.
- Opprette et stillas for å heve lysbilde-chamber(s) slik at en lampe hodet kan passe under.
- For et 100 mm x 100 mm lysbildet kammer, kuttet åpninger i bunnen og sidene av et 100 mm x 100 mm x 30 mm plast mat container og invertere beholderen. Sikre siden åpningene er stor nok til å passe en LED-lyskilde og sikre bunnen åpningen er store nok slik at lys fra lyskilden når prøven kammeret uten hinder.
- Gjelder stillaset å øke grep mellom stillaset og prøve kammer/Borstemmaskin elektriske tape. Bruke alternative materiale for å konstruere stillaset så lenge det trygt løfter lysbildet kammeret uten hindrer lyset når prøven.
- Fjerne diffusorer eller ugjennomsiktig plast fra den bordlampe som kan hindre LED-lys direkte når prøven (hvis mulig) og orientere LED matrisen oppover. Plass den stillaset og skyv chamber(s) over LED matrisen. Bruke en lampe med en fleksibel nakke enkel manipulering.
- Lage en reflekterende kuppel dekke for apparatet av fôr innsiden av en boks som er stor nok til å dekke lysbildet kammer og stillaset med aluminiumsfolie. Bruk en 1 mL pipette tips for en enkelt kammer eller en 150 x 150 mm x 150 mm pappeske for flere vertikalt stablet kamre.
2. Photobleaching før behandling av vev
Merk: vev delen forberedelse kan variere avhengig av vev og fiksering og innebygging brukes. Her hjernevev (orbitofrontal gyri) fra et tilfelle av FTLD-T ble løst ~ 2 dager i formalin, kjøre gjennom sukrose gradering, innebygd i OCT og kuttet til 10 µm tykke snitt med en kryostaten.
- i et 4 ºC kalde rom, kaldt regjering eller kjøleskap, orientere lampen under stillaset og plasser prøven kammeret på skafottet. Hell 50 mL av azide-SS løsning i prøven kammeret.
- Submerge vev deler montert på målestokk barometer objektglass i lysbildet kammeret som inneholder azide-SS bruker ren tang. Flere lysbilder, sikre at lysbildene er plassert i kammeret på en ettlags.
- Dekker apparatet med reflekterende kuppelen, slå på LED-lampen og ruge 48 h på 4 ºC.
3. Immunofluorescence
- flekken vev for fosforylert tau med DAPI counterstain og Alexa 488- og Texas Red-konjugerte sekundære antistoffer, først forberede løsninger antigen henting, permeabilization, blokkering og primær antistoff binding.
- Forberede 500 mL av antigen henting buffer (10 mM sitronsyre, 2 mM ethylenediaminetetraacetic syre, 0,05% mellom 20; pH 6.2) av oppløsende 0,92 g av sitronsyre og 0.37 g ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) i 500 mL av ddH 2 O. justere pH til 6.2 med NaOH og legge 0,25 mL mellom 20.
- Forberede 500 mL 0.025% Triton X-100 i TBS løsning (TBS-Triton) ved å legge til 0.125 mL Triton X-100 500 mL 1 x TBS.
- Forbered en 1% bovin serum albumin (BSA) løsning i ss (BSA-SS buffer) av oppløsende 0,1 g BSA i 10 mL TBS.
- Utarbeide en blokkering løsning ved å legge til 0,2 mL normal geit serum 1,8 mL 1% BSA/TBS.
- For hvert lysbilde forberede 150 µL av primære antistoff løsning (1: 100 fortynning) av pipettering 1,5 µL av anti-phospho-PHF-tau pSer202 + Thr205 (AT8) antistoffer i 148.5 µL av 1% BSA-SS buffer og la på ice.
- For å utføre antigen henting, dukke photobleached lysbildene vertikalt i en lysbilde samler inneholder 25 mL av antigen henting buffer. Sikre kollektoren med tape og/eller strenger slik at kollektoren ikke faller i vannbad. Varme samleren i et vannbad på 90 º c i 30 min og la kollektoren avkjøles til romtemperatur i 30 min før du fjerner lysbildene. Ikke fjerne lysbildene umiddelbart som det vil føre til delene tørke.
- Overføre lysbildene fra antigen henting kollektoren til et flekker glass fylt med 30 mL av TBS-Triton og vask delene i 5 min på en orbital shaker med mild risting. Gjenta vask en gang med ny TBS-Triton. Veken bort overflødig buffer med en lofri vev og skissere vevet med hydrofobe penn. Ta vare ikke for å la lysbildene tørke ut.
- For hvert lysbilde blokkere vev av pipettering 200 µL av blokkering løsning på vevet og plassere lysbildet i en fuktet kammer. Konstruere kammeret ved å plassere en objektglasstativet i en pipette tips boks som inneholder våtserviett. Inkuber ved romtemperatur for 2t på jevnt underlag. Sikre at den blokkerende løsningen fullt ut dekker vevet.
- Fjerner blokkerende løsningen av aspirasjon og Pipetter 100-150 µL av primære antistoff løsning på vevet. Sikre tilstrekkelig volum antistoff finnes og at delen er på en plan overflate å unngå av antistoff løsning til side. Ruge på 4 ºC overnatter i en fuktet kammer.
- Forberede sekundære antistoff blandingen og DAPI kjernefysiske counterstain.
- For hvert lysbilde forberede 150 µL av sekundær antistoff blanding (1: 100 fortynninger) ved å legge 1,5 µL av geit anti-musen Alexa 488 og 1,5 µL av geit anti-musen Texas rødt til 147 µL av BSA-TBS og la på ice.
- Forberede 0,1 µg/mL DAPI counterstain av føljetong fortynning. Bland lager løsningen godt og fortynne 1 µL av lager 5 mg/mL DAPI i 999 av TBS å 1 mL av 5 µg/mL løsning. For hvert lysbilde fortynne 3 µL 5 µg/mL løsning med 147 µL av TBS til en siste konsentrasjon av 0,1 µg/mL.
FORSIKTIG: DAPI er en kjent mutagen og bør behandles med forsiktighet.
- Fjerne primære antistoffer av aspirasjon. Senk lysbildene i et glass flekker glasset som inneholder 30 mL av TBS-Triton og vask for 5 min med mild blande på en orbital shaker. Gjenta trinnet vask med ny TBS-Triton. Veken bort overflødig TBS-Triton og Pipetter 100-150 µL av sekundær antistoff blanding til hvert lysbilde.
- Sikre vevet er fullstendig dekket av antistoff blandingen. Inkuber for 2 timer ved romtemperatur i fuktet kammer i mørket.
- Fjerne sekundære antistoff blandingen av aspirasjon og overføre lysbildet i et glass flekker glasset som inneholder 30 mL av TBS (ingen Triton). Vask for 5 min med mild blande på en orbital shaker. Gjenta wash trinn med fersk TBS. 100-150 µL av 0,1 µg/mL DAPI counterstain gjelder hvert lysbilde og ruge i 10 min ved romtemperatur i mørket.
- Overføre lysbildene til et glass flekker glasset som inneholder TBS og vask 3 ganger med mild miksing for 5 minutter hver, med fersk TBS for hver vask. Veken bort overflødig buffer.
- Bruke 3 dråper vandig montering medium til vev. Ved hjelp av pinsett, forsiktig lavere en ren glass dekkglassvæske på vevet, starter med en kant og sakte senke den andre kanten å unngå overtrykk luftbobler. Ta vare ikke for å fjerne dekkglassvæske hvis imaging umiddelbart. Ellers lar montering mediet tørke før lagring på 4 ºC i mørket.
4. Fluorescens mikroskopi
- sving på fluorescens lampen, mikroskopet og datamaskinen og tillate å varm opp i 15 min. sted farget vevet lysbilder i fluorescens mikroskop scenen. Bruk lyse feltet bildet for å finne vev på 10 x forstørrelse.
- Bruker en dråpe ddH 2 O til dekkglassvæske overflaten og bruke en 20 x vann nedsenking linsen (NA = 1.0). Velg 4-linjers gjennomsnittlig flyet Skann innstilling. Angi pinhole 1 luftige enhet som gir en optisk skive ~ 3 mikrometer. Velg laser eksitasjon og utslipp bølgelengder for hver fluorophore i separate spor for beste signalet.
Merk: Alexa 488: λ ex = 488 nm (argon laser) λ em = 493-570 nm; Texas rød: λ ex = 561 nm (DPSS 561 nm laser), λ em = 601-635 nm; DAPI: λ ex = 405 nm (Diode 405 laser), λ em = 410-507 nm.- Juster laser makt og få innstillingene for å optimalisere signal intensiteten for hvert spor. Samle det sammensatte bildet og lagre. Bruke samme laser for å sammenligne fluorescens bakgrunnsintensitetene i et annet lysbilde.
- For visualisering fluorescens intensitet i hver kanal, installere makroen RGB-profil verktøy for ImageJ 10. Lagre makroen fra websiden som en tekstfil (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). ImageJ menyen, Velg Plugins - > makroer - > installere; Velg teksten arkiv å installere verktøyet for RGB-profiler.
- Åpner AC confocal bildefilen i ImageJ og konvertere kompositt bilder fra 3 stabler til RGB ved å utføre følgende: Image - > farge - > kanal verktøyet. Velg " sammensatte " fra nedtrekksmenyen og sjekk alle tre kanaler. Velg bilde - > Type - > RGB-farge.
- Velg ikonet RGB-profil verktøy og trekke en linje over delen i bildet for å bli profilert. Lagre intensitet dataene som et regneark for plotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Photobleaching forbehandling trinnet kan legges til en standard immunofluorescence protokoll umiddelbart før antigen henting og immunostai-(figur 1A). Montering av photobleaching apparater kan også utføres ved hjelp av ulike, billig, sokkel komponenter (figur 1B). Utslipp spekteret av hvitt fosfor lysdioder dekker et bredt spekter av bølgelengder som gjør dem egnet for bredt photobleaching, enige med tidligere rapporter (figur 1 c)5,11. Etter 48 timer photobleaching, ble intensiteten av autofluorescent flekker som ligner på lipofuscin samt generell bakgrunnsinformasjon fluorescens redusert betydelig i både utslipp bølgelengder i en unstained kvinne del av FTLD-T (figur 1 d). For å vist virkningen av photobleaching, farget vi for hyperphosphorylated tau å visualisere patologisk tau inkludering i et tilfelle av FTLD-T bruker to ulike sekundære antistoffer. Forskjellige form av tau Inneslutninger og bruk av to chromophores for merking også tillater oss å trygt skille autofluorescent funksjoner fra de tiltenkte målene validere teknikken.
I sammensatte bilder på forstørring, morfologi av tau-positive inkluderinger, farget gul fra kombinasjonen av Alexa 488 og Texas rød kanaler, består av ringformede samlinger av kort celleprosesser som kalles "astrocytic plaketter (figur 2ac). Denne morfologi er karakteristisk for Kortikobasal degenerasjon (CBD)12,13, som er enig med patologi rapporten i denne saken. I ubehandlet utvalget, finnes det flere bygninger i det sammensatte bildet som ikke ligner tau inkluderinger, og viste fluorescens hovedsakelig i den røde kanalen, antyder at det er autofluorescence tiltenkte antistoff flekker. En merkbar bakgrunn fluorescens er også synlig i denne kanalen gjennom synsfelt (figur 2a). Funksjonene autofluorescent fjernes og det generelle bildet vises mye renere når prøver ble behandlet med photobleaching (PB) og den kjemiske avsluttes (figur 2b-c).
Vi deretter kvantifisert fluorescens forskjellene i disse prøvene av profilering et mindre område i hver prøve. En enkelt astrocytic plakett vises i hver behandling betingelse for sammenligning (figur 2d-r). I ubehandlet utvalget, bakgrunn fluorescens finnes i alle tre kanaler, men sekundære antistoff fluorescens for både Alexa 488 og Texas Red antistoffer var relativt høy (Fig 2h). Imidlertid hadde autofluorescent strukturer i ubehandlet prøven fluorescens intensiteter i Texas røde channel sammenlignes med Texas Red sekundære antistoffer farget for tau (figur 2 h). Hvis målet protein ikke har en distinkt, forutsigbar morfologi som tau i vårt tilfelle, ville autofluorescence i vevet ha gjengis bildet uninterpretable.
Derimot når photobleaching før behandling ble brukt før immunostaining, bakgrunn fluorescens i Alexa 488 og Texas Red kanaler ble betydelig redusert i forhold til ubehandlet prøven og fluorescens over immunostained tau forble upåvirket (figur 2i-m). Den kommersielle kjemiske avsluttes slukket autofluorescence i Alexa 488 kanalen like effektivt som photobleaching. Det også undertrykt DAPI bakgrunn fluorescens, som ikke var påvirket av 48t photobleaching behandling (figur 2 m). Men redusert den kjemiske avsluttes også intensiteten av Texas Red sekundær og DAPI signaler, tyder på en viss grad av mot sin hensikt slukke (figur 2n-r).
Figur 1 : Bruk av photobleaching pre-behandling i en standard immunofluorescence. A) forenklet skjematisk av standard immunofluorescence protokollen fra vev oppkjøpet bildebehandling. Bruk av primære og sekundære fluorescerende antistoffer representeres av tegneserier. En representant mikroskop-bilde er produsert. Skala bar = 100 µm. B) en representant photobleaching apparater bygget ved hjelp av sokkel komponenter (reflekterende lokket ikke vises). C) utslipp spektrum av hvite LED-matrise. En smal utslipp topp ved 450 nm og en bred peak på 550 nm er observert. D) effekten av photobleaching på endogene bakgrunn fluorescens av FTLD-T vev på Alexa 488 (493-570 nm) og Texas rød (601-635 nm) utslipp bølgelengder. Autofluorescent flekker som ligner lipofuscin reduseres synlig etter 48 timer photobleaching. Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:effekten av autofluorescence fjerning av bildekvalitet av et tilfelle av FTLD-T vev med anti-fosforylert tau immunostaining a-c) lav forstørrelsen, sammensatt immunofluorescence bilder av representant synsfelt i ubehandlet (a), photobleached for 48 h (b) og kjemiske avsluttes behandlet (c) prøver. Fargene representerer fluorescens i følgende kanaler via magnetisering av deres respektive lyskilder: Alexa 488 (grønn): λex = 488 nm (argon laser) λem = 493-570 nm; Texas rød (rød): λex = 561 nm (DPSS 561 nm laser), λem = 601-635 nm; DAPI (blå): λex = 405 nm (Diode 405 laser), λem = 410-507 nm. Skala bar = 100 µm. d-r) høyere forstørrelse bilder av stiplede regioner i ubehandlet (d-g), photobleached (i-l) og kjemiske avsluttes behandlet (n-q) prøver, med separate fluorescens kanaler, flettes bilde og kvantifisert fluorescens signal profiler. Prikkede linjer i de flettede kanalene (g, l, q) representerer linjen som signal profiler (h, m, r) ble generert. Skala bar = 50 µm. Autofluorescent partikler (af),immunolabeled tau fluorescens (tau) og kjernen signal (nuc) angis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Photobleaching før behandling av vev beskrevet i dette manuskriptet gir effektiv eliminasjon av autofluorescence bruke sokkel komponenter. Protokollen beskriver immunofluorescence imaging av fosforylert tau aggregater i formalin-fast hjernevev med sekundær antistoffer konjugert til Alexa 488 og Texas rødt, med DAPI som en kjernefysisk counterstain. For å bruke metoden andre vev, anbefaler vi utfører en 48t photobleaching behandling til prøven som utgangspunkt. Når photobleaching, utføre den standard immunofluorescence flekker protokoll for funksjoner av interesse med antistoff fortynninger følge anbefalingene fra produsenten. Hvis bakgrunnen fluorescens er fortsatt til stede, må hele photobleaching og/eller antistoffer flekker skritt endres. Varigheten av photobleaching vil variere avhengig av lampen valgt å konstruere apparatet og nivået på autofluorescence i utvalget. Det optimale bleking tidspunktet for hver unike lampe apparatet må bestemmes. Dette kan gjøres ved photobleaching et unstained kvinne, coverslipped vev delen montert i SS-azide og måle den endogene fluorescensen lysbildet på 12t intervaller med fluorescens mikroskop. I tidligere rapporter, overvåket vi lipofuscin photobleaching av partikkel analyse og kurven passende å eksponensiell decay funksjoner5, men enkelhet, visuell observasjon av delene med jevne mellomrom kan være like effektive til å dømme den varighet på som de fleste av fluorescensen blir slukket. I vårt tilfelle av alderen hjernevev som inneholder store mengder lipofuscin pigmenter, var 48t inkubasjon med en 800 lux lampe tilstrekkelig. Hvis bestemte signalet fortsatt er svakt sammenlignet med bakgrunnen etter photobleaching, kan du vurdere å øke konsentrasjonen av primære og sekundære antistoffer under fargingen. Det er også viktig å utføre en sekundær antistoff-bare kontroll for å sikre bakgrunn signalet ikke skyldes uspesifisert sekundære antistoff bindende. Velges antistoffer som ikke cross-react, særlig når flekker for flere mål. I tillegg sikre at de spesifikke signalene ikke er utilsiktet slukkes under farging prosessen. For eksempel er Nissl flekk (til farging nerveceller) slukket av BSA. I dette tilfellet skal komponenten BSA blokkerer løsningen erstattes med alternativer som fisk huden gelatin5.
Bruk av hvitt fosfor lysdioder for photobleaching har visse begrensninger på grunn av dens utslipp spektrum fra 420 nm til 650 nm. Dermed er ingen betydelige photobleaching i UV bølgelengdene mulig. Også, på grunn av det brede utslipp spektret, photobleaching chromophores av bestemte bølgelengder krever endringer som overliggende fargefilter ark over LED-matriser for å filtrere ut uønskede utslipp bølgelengder. I tillegg krever photobleaching av vev lengre behandlingstider enn andre metoder. I dette tilfellet en alder av hjernevevet (fra en 89 år gamle person) og lang aldehyd fiksering periode på mer enn 2 dager var 48 h photobleaching varighet nødvendig. Selv om ingen aktive behandlingstid er nødvendig, må en ta hensyn photobleaching tid og planlegge flekker økten deretter. LED-lamper til høyere lyshet eller bruk av flere lamper kan betydelig redusere tiden photobleaching ved enkel økningen Foton flux.
Sammenlignet med eksisterende metoder, tilbyr vår teknikken flere viktige fordeler. I motsetning til photobleaching ved hjelp av skanning lasere i fluorescens mikroskopi, observerte vi ingen tegn til Foto-indusert skade av våre prøver med LED photobleaching. En annen stor fordel av våre apparater er betydelig reduksjon kostnadene over andre teknikker. Montering av våre apparater er ca $10 USD, og monteringen av apparatet er fleksibel nok slik at alle laboratorium kan vedta sin egen versjon av photobleacher. Sammenligning andre metoder benytter mutispectral ledet matriser med egendefinerte lysbilde holdere og kjøling kamre krever opptil $1000 USD å konstruere8. I tillegg, er kommersiell kjemiske quenchers forbruksvarer som koster $120 USD 100 lysbilder og introdusere uønsket forbindelser i utvalget. Den kjemiske avsluttes brukes til sammenligning studien sannsynligvis inneholder lipid-bindende Sudan sort fargestoff, som kan forstyrre immunostaining av lipoproteiner.
Samlet de viktigste trinnene i photobleaching før behandling og immunostai-av prøven innebærer håndtering av delen under immunostaining. Det er viktig at når delen er utvannet under photobleaching, ikke er det tillatt å tørke ut i noen av de påfølgende trinnene. Tørking av lysbildet vil forårsake ujevn fordeling av antistoffer og skape uninterpretable gjenstander. For å unngå tap av tid og potensielt verdifulle prøver, må utvises ved flere trinn i protokollen. Etter antigen henting, tillate vevet avkjøles før du overfører til SS-Triton permeabilization løsning. Selv midlertidig eksponering til luft når prøven er oppvarmet til høye temperaturer vil føre til umiddelbar tørking av vev. Kontroller også at antistoff, blokkerer eller counterstain løsninger fullt ut dekker vev under programmet. Dette kan oppnås ved å kontrollere at vevet er fullstendig disponert av hydrofobe pennen unngå løsning avrenning og at alle løsninger brukes i en fuktet kammer på en plan overflate. Dette er spesielt viktig i løpet av natten incubations (primære antistoff bindende).
Bruk av photobleaching bruker hvit fosfor LED før flekker kan lette anvendelse av immunofluorescence metoder arkiverte vev. Det er en allsidig og rimelig behandling som vi forventer å være mottakelig for et bredt spekter av i fremtiden. Selv om vi har bare brukt denne metoden til hjernevev, denne teknikken kan lett innlemmet i noen fargeprotokoll i autofluorescence som hindrer ønskelig resultat, særlig i postmitotic vev som hjerte eller skjelettlidelser musklene der lipofucin er mer sannsynlig å akkumulere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet helt eller delvis av den kanadiske Consortium av Neurodegeneration og aldring (CCNA), Canadian Institute for Health Research (CIHR), den ALS Society of Canada (ALS Canada) og Alzheimers Society av Canada (ASC). Forfatterne gjerne takke Sultan Darvesh og Andrew Reid fra Maritime hjernen vev banken for å gi FTLD hjernen vev, Milan Ganguly fra programmet Spatio-Temporal målretting og forsterkning av stråling svar (STTARR) og dens tilknyttede finansiering etater for vev innebygging og snitting tjenester og den avanserte optiske mikroskopi anlegg (AOMF) for å gi mikroskopi instrumenter. Kevin Hadley er takket for kritisk gjennomgang av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T.
- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al.
- Sun, Y., Chakrabartty, A. Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array. Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).
- Davis, A. S., Richter, A., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).
- Duong, H., Han, M. A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy. J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).
- Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).
- Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy. Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).
