ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
שיטה מבוססת cytometry זרימה כדי לקבוע באופן כמותי את הפעילות ציטוטוקסיות של תאים אנושיים של הרוצח הטבעי מוצגים כאן.
Abstract
בתוך מערכת החיסון המולדת, לימפוציטים המכונה תאים הטבעיים (NK) רוצח ממלאות תפקיד חיוני בהגנה מארח נגד תאי סוטה, במיוחד חיסול tumoral ו לשווק נגוע תאים. פגמים monogenic ידוע כ-30, יחד עם שורה של מצבים פתולוגיים אחרים, לגרום מחסור התא NK תפקודית או קלאסי, מתבטא ב מופחתת או נעדר ציטוטוקסיות פעילות. מבחינה היסטורית, cytotoxicity נחקר בשיטות רדיואקטיביות, אשר הם מסוכנים, מסורבל ויקר. מאמר זה מתאר שיטה מבוססת cytometry זרימה יעילה, ישים קלינית לכמת פעילות ציטוטוקסיות התא NK. זה assay, תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) או מטוהרים ההכנות התא NK הם שיתוף incubated-יחסים שונים עם קו תא הגידול יעד ידוע להיות רגישים NK תאית cytotoxicity (NKCC). התאים היעד הם מראש עם תוויות עם הפלורסנט כדי לאפשר האפליה מתאי אפקטור (תאי NK). לאחר תקופת דגירה, התאים היעד ההרוגים מזוהים על ידי כתם חומצת גרעין, וחוקר במיוחד תאים מתים. שיטה זו היא נוטה גם אבחון המחקר והיישומים, הודות ליכולות פרמטר מרובה של cytometry זרימה, יש יתרון נוסף של פוטנציאל המאפשר ניתוח עמוק של פנוטיפ התא NK ותפקוד.
Introduction
תאים (NK) רוצח טבעי הם תת-קבוצה מתוחכם של לימפוציטים אנושיים מולדת אנושות מעורב חיסול של תאים נגועים לשווק, טרנספורמציה תאים אחרים איומים פתוגניים 1,2. תאי NK בגרגרים lytic בית חלבונים ציטוטוקסיות, כגון perforin ו- granzymes. בעת ההפעלה, תאי NK טופס באינטראקציה מורכבת עם המטרות שלהם הידוע בשם סינפסה חיסוניות, לפיה מולקולות cytolytic אלה מתפרסמים באופן מקומי, וכתוצאה מכך פירוק תא היעד הישיר אפופטוזיס, יחד עם שחרור ציטוקינים ו כימוקין, בסופו של דבר ב- אינדוקציה של דלקתיות המדינה 1,3,4.
הפעלת התא NK כרוך מחרוזת המורכבת של מפעיל, מעכבות האינטראקציות בין NK התא קולטנים ליגנדים באה לידי ביטוי על פני השטח של התאים היעד, ויוצרים מערכת מוסדרת בחוזקה. אחד המנגנונים הכי נחקרות של הפעלת תאי NK הוא חסר ה"עצמי". אכן, חוסר זיהוי של מחלקה שאני רס ן histocompatibility מורכבים (MHC), או מולקולות של אנטיגן (הלע) לויקוציטים אנושיים, על נגוע או טרנספורמציה המפעילים תאי NK תא cytotoxicity. גידול של תאים הנגועים בנגיף בדרך כלל downregulate אנטיגנים אלה כדי להימלט חסינות T תאית, וכך להפוך NK ראשי תא מטרות 1,3,4.
הערכה של תפקוד תאי NK היא בעיקר מחולקת degranulation או cytotoxicity מבחני. עם זאת, מבחני degranulation, כגון זרימת cytometric זיהוי של דה מרקר הקשורים degranulation CD107a, הם רק מעיד של הפעלת תאי NK ולא של תפקידם האולטימטיבי, ההרג הישיר של היעד תאים 5,6,7,8. לפיכך, מגבלה זו יש נמשך החוקרים מבחני cytotoxicity כתחליף לספר יותר, ישירה יותר.
ותיק "תקן הזהב" להערכת פעילות ציטוטוקסיות תאית של תאי T ו- NK היא וזמינותו שחרור כרום (CRA). CRA כרוך radioactively תיוג של התאים היעד עם 51Cr משותפת המקננת בהם עם תאים אפקטור. זה וזמינותו ספוגים העיקרון שהזה פירוק התא תוצאות במהדורה של חלבון מכורך 51Cr לתוך תגובת שיקוע, אשר נמדד על ידי סופר גמא. זה וזמינותו, בזמן יעיל, הוא בעייתי עבור מגוון סיבות: עלויות חומרים גבוה, טיפול, סילוק של רדיואקטיבי 51Cr, לשחרור ספונטני של 51Cr ו תקינה קשה - שהופך אותו לגמרי מעשי 9,10.
מאז פותחו מספר מבחני שאינו רדיואקטיבי, מעורבים תיוג פלורסנט, שחרור אנזים ו ביולומינסנציה אפילו, כחלופות CRA 11,12,13,14. נתאר כאן שיטה מבוססת cytometry זרימה למדידת NK תא ציטוטוקסיות פעילות התאים היעד K562 פשוט, רגיש, וניתן לשחזור. K562 תאים הם תא אנושי erythroleukemic קו עם ביטוי מופחתת של הכיתה הלע ביטוי מוגבר של ליגנדים עבור רצפטורים NK activatory, מה שהופך אותם רגישים במיוחד NK cytotoxicity תאית 15ואני. זה assay, K562 תאים מסומנים מראש עם אסתר succinimidyl diacetate carboxyfluorescein (CFSE) תרבותי משותף-יחסי שונים עם תאי תאי או דם היקפיים (PBMCs) או מטוהרים תאי NK 1. CFSE הוא צבע פלורסנט יציב, מחייב חלבון המאפשר אפליה של התאים היעד מ 16,של תאי NK אפקטור17. לאחר שיתוף הדגירה, כתם חומצת גרעין, במיוחד המגובש הקרום של תאים מתים, משמש לזיהוי תאי היעד נהרג (ראה טבלה של חומרים). הדגימות נרכשים ואז על cytometer זרימה כדי לקבוע את אחוז המלח (קרי, הכתם +) CFSE + התאים היעד.
Assay הזה יכול לשמש הקרנה אבחון שגרתי על פגמים monogenic להשפיע על תא התא NK, אשר יש כ 30 פגם ידוע גורם תפקודית או קלאסי NK תא מחסור, ועל lymphohistiocytosis hemophagocytic ראשית או משנית. זה שימושי גם לחקור את פעילות תאי NK בחולים עם זיהומים נגיפיים הרפס חוזרים ונשנים, חמור, כדי להעריך את שיחזור המערכת החיסונית לאחר השתלת תא hematopoietic או פוסט immunomodulatory טיפול 18,19,20, ועבור שורה של יישומי מחקר בסיסי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לפני הגדרת וזמינותו, מומלץ מאוד כי תוכן התא NK להידרש באוכלוסייה אפקטור של בחירה. איור 1 מציג צביעת CD56 טיפוסית לפני (תכלת) ואחרי העשרה התא NK (אדום). תאי NK מהווים עד 15% PBMCs, צריך להיות לפחות 80% טהור לאחר העשרה.
ניתוח תזרים cytometric ב assay הזה כרוך גילוי של שני פרמטרים: CFSE, לזיהוי בערוץ אותו כמו FITC; כתם תא מת, לזיהוי בערוץ אותו כמו APC (איור 2 אב'). לאחר ייבוא נתונים, האסטרטגיה המגביל באיור 2 משמשת לניתוח נתונים. התאים היעד K562 המתים (קרי, תאים מתים הכתם +) הן פיקוח מחוץ CFSE + האוכלוסייה, מספקים את % תאים נהרג בתוך אוכלוסית היעד.
שליטה התנאים חיוני להבטיח היעילות של וזמינותו עצמה ומרכיביה נפרדים. על מנת וזמינותו להיחשב חוקיים, הבא אמור להיות צפוי בתנאי בקרה (6-8): המטרה היחידה (תנאי 6) צריך לגרום מוות תאים תאים < 15% (איור 3 א). אין אות CFSE שיזוהו עבור אפקטור תאים היחיד (תנאי 7), מוות התא צריך להיות < 5% (איור 3B). עבור בתיווך Tween הריגת התאים היעד (תנאי 8), מוות התא צריך להיות > 85% (איור 3C).
מטופל עם פגם בתפקוד תאי NK צפוי צמצמו פעילות ההרג לכל היותר או יחסי כל נבדק בהשוואה לאדם בריא. המקבילה של התורם בריאים ותאים החולה באיור 4 מציג צמצום דיפרנציאלית, משמעותי מוות תאי היעד עם הפחתת יחס תא אפקטור-יעד.
איור 1: הערכה של תוכן התא NK בתוך האוכלוסייה אפקטור. היסטוגרמה מייצגת לאחר צביעת סך PBMCs (כחול בהיר) או מטוהרים תאי NK (אדום) עבור CD56. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: Gating אסטרטגיה גילוי של התאים היעד. A) השער הראשונית מוגדרת בחלקה FITC-A/האס-A. K562 תאים הן פיקוח כמו CFSE + אירועים. B) תאים מתים K562 (קרי, כתם חיובית עבור תאים מתים) הן פיקוח בעלילה APC-A/האס-A הבאים בתוך CFSE + תא אוכלוסית היעד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: נציג נתונים עבור בקרת תנאי. א) אחוז תאים מתים הכתם + K562 תאים בתוך השער CFSE + (gating אסטרטגיה כמו איור 2) תנאי 6 (היעד תאים בלבד) - בקרה שלילית על מוות של תאים K562. B) CFSE והתא מת כתם בזיהוי המצב 7 (אפקטור תאים בלבד - סה כ PBMCs). C) אחוז תאים מתים הכתם + K562 תאים בתוך השער CFSE + (gating אסטרטגיה כמו איור 2) תנאי 8 (התאים היעד + Tween) - בקרה חיובית עבור מוות של תאים K562. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: נציג נתונים עבור אפקט דילול של יחס תא אפקטור-יעד שונים- היחס תא אפקטור: היעד נבדק הן כדלקמן: 50:1, 25:1; 12.5:1; 6.25:1. הנתונים הם רקע (תנאי #6)-הוסר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מדגם | תנאי | אפקטור (E): היעד (T) |
| PBMCs | 1 - לשלוט על תאי NK cytotoxicity | 50:1 + IL-2 |
| 2 | 50: 1 | |
| 3 | 25: 1 | |
| 4 | 12.5: 1 | |
| 5 | 6.25: 1 | |
| 6 | T בלבד | |
| 7 - בקרה שלילית K562 למוות | E בלבד | |
| 8 - לשלוט על מות K562 | T + יצירת רצף | |
| תאי NK (טהור) | 1 - לשלוט על תאי NK cytotoxicity | 5:1 + IL-2 |
| 2 | 5: 1 | |
| 3 | 2.5: 1 | |
| 4 | 1.25: 1 | |
| 5 | 0.625: 1 | |
| 6 | T בלבד | |
| 7 - בקרה שלילית K562 למוות | E בלבד | |
| 8 - לשלוט על מות K562 | T + יצירת רצף |
טבלה 1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן מספק אלטרנטיבה פשוטה וחסכונית מסורתי 51Cr שחרור הנועד להעריך התא NK פעילות ציטוטוקסיות. בשיטה זו הוא רגיש, הדירים פחות זמן רב יותר בשיטות הרגילות הקודם, כמו CRA, יכול לשמש עבור שניהם קליני, מחקר יישומי.
בעוד וזמינותו עובד עם PBMCs הכולל וגם תאי NK מועשר, האפשרות להשתמש PBMCs ללא הצורך לטהר תא אוכלוסיות הוא תועלת רבה בהתמודדות עם כמויות קטנות של דם שנאספו או איכות או המסכן כמה תאים מדגימות של המטופלים. זה וזמינותו מנצל רק CFSE של תאים מתים הדרה הכדאיות הכתם. מסתכל על שני הפרמטרים האלה לבד מספק מידע תמציתי ומספיק למטרות אבחון, עם ערך מוסף שאינו זקוק עוד יותר פיצוי בניתוח cytometric זרימה.
שיטה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד ביולוגיה בסיסית של התא NK ולבדוק NK הציבה כמטרה טיפולים. בהקשר זה, היכולות והולך של זרימה cytometers מציגים רכיב שלא יסולא בפז של רב-תכליתיות זו assay, ומאפשר לניתוח multiparameter של תאי NK ואת הפעילות שלהם לא אפשרי בעבר עם מבחני כמו CRA. תא חלופי מעקב צבעי הכדאיות, ואזוריט בערוצים אחרים, הינם זמינים לענות על הצרכים של החוקרים.
פרוטוקול זה ממוטב לשימוש עם המטרה התא NK ומופת שורת התאים K562. עם זאת, זה יכול להיות מותאם שורות תאים היעד ההשעיה אלטרנטיבית עם דרגות שונות של רגישות cytotoxicity תאי NK, כגון HL-60, דאודי, U937, ראג'י. בהקשר זה, חשוב לציין כי הריכוז של הפלורסנט ושל סרום לשימוש בזמן תיוג תא היעד ייתכן שיהיה עליך להיות אופטימיזציה עבור כל קו תא היעד, כפי שורות תאים שונים עלול לקחת את התווית פלורסנט באופן שונה, ועל כל cytometer זרימה. בזמן זה בדרך כלל מומלץ להימנע משימוש סרום במהלך תיוג, הסכמנו להרוות קלה עם 0.5% FBS משתי סיבות. ראשית, היא מסייעת הפחתת מתח התא המטרה, ובכך רקע כתם; שנית, הוא מביא את האות CFSE בטווח המתאים של זיהוי של cytometer הזרימה שלנו מבלי לדרוש התאמות הגדרות יומי, ובכך מסייע ב הפארמצבטית של וזמינותו. הנספח וריאציות עשויות לכלול בדיקות E:T שונים יחסי ושעות הדגירה להסתגל וזמינותו לתנאים הפעלה שונות. יש המשך של תרבות משותפת אפקטור ותאי המטרה לבדוק NK cytotoxicity היסטורית נע בין 4-16 ה', למרות תקופות ארוכות יותר נוטים לגרום לשחרור ספונטני מוגברת 9,16. בשיטה שלנו, זמן הדגירה עלול גם לגרום לאובדן פלורסנט תיוג על ידי תאי היעד עקב הרג או התפשטות, כמו אלה צבעי פלורסנט הם מדולל על חלוקת התא. לפיכך, incubations בקצה התחתון של חלון הזמן עדיפים בדרך כלל, הם לא יעלה על לילה הדגירה 6,16,22.
חשוב לשים לב אשר משתנים יכול להשפיע על התוצאה של זה וזמינותו. מניסיוננו, תאי היעד K562 רגישים במיוחד שינויי טמפרטורה. לכן, התאים K562 לא בקירור אבל מעדיף לשמור בטמפרטורת החדר או להציב על חממה2 CO humidified ב 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש בהם. מאותה סיבה, ריאגנטים כל טיכסו לטמפרטורות המתאים כמצוין בפרוטוקול. פרמטר נוסף משפיע על תאים אלה הוא מהירות צנטריפוגה, אשר צריך להיות מופחת כדי למזער את הלחץ הסלולר. יתר על כן, להגביל את זמן ההשהיה בין תחילת הדגירה שיתוף כדי פחות מ 30 דקות הכנה אפקטור/יעד חיוני כדי לוודא הריגה מקסימלי פעילות ואת וזמינותו הפארמצבטית. באופן דומה, כמו האות CFSE הוא בדרך כלל חזקים, pipetting מדויק, ערבוב תקין של תאים מדויקות הדגירה זמן כאשר תיוג ו שכבתה מכריעים להבטיח עקביות ההכתמה. לבסוף תאי NK יכולת ציטוטוקסיות זה משתנה מאוד גם אצל אנשים בריאים, מושפע על ידי מספר גורמים, כולל שלב התפתחותי, מין, גיל, משקל 23,24,25- בנוסף, עד 30% של פקדים בריא להציג הפחתה משמעותית או אובדן מוחלט של היכולת ציטוטוקסיות אם נבדקו יותר מ 24 שעות לאחר דם. לכן, מומלץ להשתמש טרי מטוהרים PBMCs או NK תאים במידת האפשר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים אין התנגשויות עניין פיננסי.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ג'יל Narciso, UCLA מרכז Immunogenetics, על הסיוע עם הכנת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Stock solution at 10,000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml) |
| K562 Cells | ATCC | CCL-243 | Cancer cell line |
| T-75 cell culture flasks | Corning | 431464 | |
| CFSE cell proliferation kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation. |
| Sodium/lithium heparin blood collection tubes | BD | 02-687-95 | |
| U-bottom 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
| Serological pipettes | BD Falcon | ||
| Polystyrene round-bottom tubes (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| Reagent reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Human NK cell enrichment cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
References
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A.
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger? Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Warren, H. S., Smyth, M. J.
- Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357 (2014).
- Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
- West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
- Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
- Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
- Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152 (2016).
- Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
- Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578 (2015).
- Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
- Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
- Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
- Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1 (2015).
- Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).
Tags
אימונולוגיה גיליון 126 הרוצח הטבעי תאי NK cytotoxicity פירוק התא התא להרוג K562 cytometry זרימה שחרור כרום NK תא cytotoxicity CFSEErratum
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 09/10/2017.
Citeable Link.
An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was corrected from:
to:
