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Summary
양적 인간의 자연 킬러 세포의 세포 독성 활동을 결정 하는 흐름 cytometry 기반 방법은 여기에 표시 됩니다.
Abstract
타고 난 면역 계통 내에서 이펙터 세포 자연 킬러 (NK) 세포로 알려진 탈 선 셀, 구체적으로 종양을 제거 하 고 virally 감염 된 세포에 대 한 호스트 방어에 필수적인 역할을 재생할. 다른 병 적인 상태의 호스트 함께 약 30 알려진된 monogenic 결함 발생 기능 또는 고전적인 NK 세포 결핍에서 만들어 낸 감소 또는 세포 독성 활동을 결 석. 역사적으로, 세포 독성은, 비싼 복잡 하 고 잠재적으로 위험한 방사성 방법 조사 하고있다. 이 문서는 NK 세포의 세포 독성 활동을 계량 유선형, 임상 적용 흐름 cytometry 기반 메서드를 설명 합니다. 이 분석 결과에 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 또는 순화 된 NK 세포 준비는 다른 비율에서 공동 incubated NK 세포 중재 된 세포 독성 (NKCC)에 민감한 것으로 알려져 대상 종양 세포 라인. 대상 세포는 효과 기 세포 (NK 세포)에서 그들의 차별 수 있도록 형광 염료와 사전 분류. 잠복기, 후 살해 대상 세포 특히 죽은 세포를 침투 하는 핵 산 얼룩에 의해 식별 됩니다. 이 방법은 의무가 모두 진단 및 연구 애플리케이션과, cytometry의 다중 매개 변수 기능에 감사 합니다는, 잠재적으로 NK 세포 표현 형 및 기능에 대 한 깊은 분석의 추가한 이점이 있다.
Introduction
자연적인 살인자 (NK) 세포는 virally 감염 된 세포, 변형 된 세포, 그리고 다른 병원 성 위협 1,2의 제거에서 비판적으로 관련 된 인간의 타고 난 세포의 정교한 부분 집합. NK 세포 용균성 립 집 perforin 등 granzymes 세포 독성 단백질. 활성화, NK 세포는 직접 대상 세포 세포의 용 해 및 apoptosis, cytokine 및 chemokine 릴리스 함께 결과로 이러한 cytolytic 분자 로컬로 출시 되 면 면역 시 냅 스로 알려진 그들의 목표와 복잡 한 상호 작용을 형성 하 고 궁극적으로 염증의 유도에서 상태 1,,34.
NK 세포 활성화 활성화의 복잡 한 문자열을 포함 하 고 억제 상호작용 NK 세포 수용 체와 ligands 단단히 규제 시스템을 형성 하는 대상 셀의 표면에 표현. NK 세포 활성화의 가장 공부 메커니즘 중 하나는 "누락 자가"입니다. 사실, 내가 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC), 또는 인간 백혈구 항 원 (HLA) 분자에 클래스의 탐지의 부족 감염 또는 변형 세포 트리거 NK 세포 세포 독성. 종양과 바이러스 감염 세포 일반적으로 downregulate T 세포 중재 면역, 따라서 기본 NK 지 고 탈출이 항 원 셀 대상 1,,34.
NK 세포의 기능에 대 한 평가 주로 degranulation 또는 세포 독성으로 분류 분석 실험. 그러나, degranulation 관련 마커 CD107a의 흐름 cytometric 감지와 같은 degranulation 분석 실험, NK 세포 활성화 그리고 그들의 궁극적인 기능, 대상 셀 5,6,,78의 직접적인 살인의 아닙니다 나타내는 있습니다. 따라서,이 제한 더 이야기 하 고 더 직접적인 대안으로 세포 독성 분석 실험에 조사를 받고 있다.
T와 NK 세포의 세포 독성 활동 셀 중재를 평가 하기 위한 오랜 "금 표준" 크롬 방출 분석 결과 (CRA) 이다. CRA 포함 방사성 51Cr 대상 셀의 라벨 공동 effector 세포 배양. 이 분석 결과 세포 세포의 용 해 단백질 바인딩 51Cr 감마 계산에 의해 측정 될 수 있는 상쾌한에의 릴리스 결과 원리에 가득한은. 효과적인, 반면이 분석 결과 여러 가지 이유로 문제가: 높은 물자 비용, 처리 및 방사성 51Cr의 처리, 51Cr의 자발적인 릴리스 및 어려운 표준화-그건 전부 허무 9,10.
다양 한 형광 라벨, 효소 릴리스, 그리고 심지어 생물 발광, 관련 된 비 방사능 분석 실험 이후 CRA 11,12,,1314대 안으로 개발 되었다. 여기의 NK 세포 세포 독성 활동 K562 대상 셀에, 민감한, 간단 하 고 재현성 있는 측정 흐름 cytometry 기반 방법을 설명 합니다. K562 세포는 인간의 erythroleukemic 셀 라인 감소 표현의 HLA 클래스와 내가 그들을 특히 NK 세포 독성 세포 중재 15에 취약 하 게 activatory NK 수용 체에 ligands의 과장 된 표현. 이 분석 결과에서 K562 셀 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 표시 미리 어느 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)와 함께 다양 한 비율에서 공동 경작 또는 NK 세포 1정화. CFSE는 안정, 단백질 바인딩 형광 염료 이펙터 NK 세포 16,17에서 대상 셀의 차별 수 있습니다. 공동 부 화 후 특히 permeating 죽은 세포의 막, 핵 산 얼룩 살해 대상 세포 (재료의 표 참조)를 식별 하는 데 사용 됩니다. 샘플은 죽은 (즉, 얼룩 +)의 비율을 결정 하는 흐름 cytometer에 취득 CFSE + 대상 셀.
이 분석 결과는 약 30 알려진된 결함 기능 또는 고전적인 NK 세포 결핍을 일으키는 원인이 되는 NK 세포 구획에 영향을 미치는 monogenic 결함에 대 한 및 기본 또는 보조 hemophagocytic lymphohistiocytosis에 대 한 일상적인 진단 심사로 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 기초 연구 응용 프로그램의 호스트에 대 한 조 혈 모 세포 이식 또는 게시물 immunomodulatory 치료 18,,1920다음 면역 재구성을 평가 하기 위해 재발, 심한 헤 르 페 스 바이러스 감염 환자에서 NK 세포 활동을 조사 하는 데 유용.
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Representative Results
분석 결과 설정 하기 전에 NK 셀 내용 선택의 이펙터 인구에 평가 될 것이 좋습니다. 그림 1 에 일반적인 CD56 얼룩 (밝은 파란색) 전에 나와 (빨간색) NK 세포 농축 후. NK 세포 PBMCs의 최대 15% 고 농축 후 순수 80% 이상 이어야 한다.
흐름 cytometric 분석이 분석이 결과에 두 개의 매개 변수 검색 포함: CFSE, FITC;로 같은 채널에서 감지 그리고 죽은 세포 얼룩, APC (그림 2AB)로 같은 채널에서 감지. 데이터 수집 후 그림 2에서 제어 전략은 데이터를 분석 하는 데 사용 됩니다. CFSE + 인구, 타깃 집단 내의 사망된 세포의 %를 제공 하는 (즉, 죽은 세포 얼룩 +) 죽은 K562 대상 셀 문이 있습니다.
제어 조건 자체와 별도 구성 요소 분석 결과의 효율성 확보에 결정적 이다. 분석 결과 유효 하기 위해서, 다음 제어 조건 (6-8)에서 예상 한다: 대상 셀만 (조건 6) 세포 죽음 초래 한다 < 15% (그림 3A). 이펙터만 (조건 7), 세포 그리고 세포 죽음 이어야 한다 CFSE 신호를 감지 해야 합니다 < 5% (그림 3B). 트윈 중재 대상 셀 (조건 8)의 살인, 대 한 세포 죽음 이어야 한다 > 85% (그림 3C).
NK 세포의 기능에 결함을 가진 환자 대부분 살인 활동을 감소 할 것으로 예상 된다 또는 모든 비율 건강 한 개인과 비교 테스트. 건강 한 기증자와 환자 세포 그림 4에서의 병렬 이펙터 대상 셀 비율 감소와 대상 세포 죽음에서 차동, 상당한 감소를 보여 줍니다.
그림 1: 이펙터 인구 내의 NK 세포 콘텐츠 평가. 얼룩 후 대표 히스토그램 총 PBMCs (밝은 파랑) 또는 CD56에 대 한 NK 세포 (빨간색)를 정화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대상 셀의 검출에 대 한 전략을 게이팅. A) 초기 게이트 SSC A FITC A 플롯에 설정 됩니다. K562 셀 CFSE + 이벤트로 문이 있습니다. B) 죽은 K562 셀 (즉, 죽은 세포에 대 한 긍정적인 얼룩) CFSE + 대상 셀 인구 내의 후속 APC-A/SSC-A 음모에 문이 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 제어 조건에 대 한 대표적인 데이터. A) 의 죽은 세포 얼룩 + K562 백분율 셀 CFSE + 게이트 ( 그림2 전략 게이팅) 내 조건 6 (대상 셀에만)-부정적인 제어 K562 세포 죽음에 대 한. B) CFSE와 죽은 세포 얼룩 조건 7 검색 (effector 세포만-총 PBMCs). C) 의 죽은 세포 얼룩 + K562 백분율 셀 CFSE + 게이트 ( 그림2 전략 게이팅) 내 조건 8 (대상 셀 + 트윈)-긍정적인 통제 K562 세포 죽음에 대 한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 다양 한 이펙터 대상 셀 비율의 희석 효과 대 한 대표적인 데이터. 이펙터: 대상 셀 비율 테스트는 다음과 같습니다: 50: 1, 25: 1; 12.5: 1; 6.25:1. 데이터는 배경 (조건 #6)-제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 샘플 | 조건 | 이펙터 (E): 대상 (T) |
| PBMCs | 1-NK 세포 세포 독성에 대 한 긍정적인 통제 | 50: 1 + 일리노이-2 |
| 2 | 50: 1 | |
| 3 | 25: 1 | |
| 4 | 12.5: 1 | |
| 5 | 6.25: 1 | |
| 6 | 만 T | |
| 7-K562 죽음에 대 한 부정적인 제어 | E만 | |
| 8-K562 죽음에 대 한 긍정적인 통제 | T + 트윈 | |
| NK 세포 (정화) | 1-NK 세포 세포 독성에 대 한 긍정적인 통제 | 5: 1 + 일리노이-2 |
| 2 | 5: 1 | |
| 3 | 2.5: 1 | |
| 4 | 1.25: 1 | |
| 5 | 0.625: 1 | |
| 6 | 만 T | |
| 7-K562 죽음에 대 한 부정적인 제어 | E만 | |
| 8-K562 죽음에 대 한 긍정적인 통제 | T + 트윈 |
표 1
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Discussion
여기 설명 하는 방법을 NK 세포의 세포 독성 활동을 평가 하기 위해 전통적인 51Cr 자료 분석 결과에 대 한 간단 하 고 비용 효율적인 대안을 제공 합니다. 이 방법은, 재현성, 민감하고 CRA, 같은 이전 표준 방법 보다 적게 시간이 걸리는 임상 모두에 사용할 수 있습니다 이며 응용 연구.
동안 분석 결과 총 PBMCs와 풍부한 NK 세포, 세포 인구를 정화 필요 없이 PBMCs을 사용 하 여 환자의 샘플에서 수집 된 혈액 또는 몇 또는 가난한 품질 셀의 작은 볼륨을 다룰 때 큰 혜택입니다. 이 분석 결과 CFSE와 죽은 셀 제외 생존 얼룩만 활용합니다. 혼자 이러한 두 개의 매개 변수를 보고 진단 목적, 흐름 cytometric 분석에서 보상을 더 요구 하지 않기의 추가 혜택에 대 한 간결 하 고 충분 한 정보를 제공 합니다.
이 방법은 또한 기본 NK 세포 생물학을 연구 하 고 소설 NK 세포 타겟 치료를 테스트를 사용할 수 있습니다. 이와 관련, 교류 cytometers의 적-확대 기능 허용 NK 세포와 그들의 활동의 다 항목 분석 하지 이전 CRA 같은 분석 가능이 분석 결과에 다양성의 귀중 한 요소를 소개 합니다. 대체 셀 추적 및 생존 염료, 다른 채널에 fluorescing 수 사관의 요구에 맞게 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 원형 NK 셀 대상 K562 셀 라인 사용 하기 위해 최적화 되어 있습니다. 그러나, 그것은 적용할 수 있습니다 대체 정지 대상 셀 라인 감도 NK 세포 세포 독성, HL-60, Daudi, U937 들의 삶 문의 등의 다양 한 각도. 이와 관련, 그것은 중요 한 것으로 다르게, 그리고 각 교류 cytometer 다른 셀 라인 형광 라벨을 걸릴 수 있습니다 형광 염료의 및 대상 셀 라벨 중에 사용 하는 혈 청의 농도 각 대상 셀 라인에 대 한 최적화 되어야 할 수도 있습니다. 그것은 일반적으로 라벨링 하는 동안 혈 청을 사용 하지 않도록 권장 하 고, 우리는 두 가지 이유로 FBS의 0.5%와 약간의 냉각에 대 한 하기로 했다. 첫째, 그것은 대상 셀 스트레스를 줄이는 데 도움이 및 따라서 배경 얼룩; 둘째, 그것은 따라서 분석 결과의 재현성에 은닉 매일 설정을 조정 하지 않고도 CFSE 신호 탐지의 우리의 교류 cytometer 적절 한 범위를 제공 합니다. 추가적인 프로토콜 변화 다른 E:T 비율 및 보육 시간 분석 결과 다른 활성화 조건에 맞게 테스트를 포함할 수 있습니다. 장기간 증가 자발적인 릴리스 9,16에서 발생 하는 경향이 있지만 이펙터와 NK 세포 독성을 테스트 하려면 대상 셀의 공동 문화 기간 4-16 h에서 배열 했다 역사적으로 있다. 우리의 방법에 더 이상 부 화 될 수 있습니다 또한 살인 또는 확산, 대상 세포에 의해 라벨 형광의 손실 이러한 형광 염료는 세포 분열 시 희석. 따라서, 외피 시간 윈도우의 하단에는 일반적으로 선호 하 고 그들은 야간 보육 6,,1622를 초과 하지 않아야 합니다.
변수 잠재적으로 영향을 미칠 수이 분석 결과의 결과 주의 깊게 살펴 중요 하다. 우리의 경험에서는, K562 대상 셀은 특히 온도 변화에 민감합니다. 따라서, K562 셀 해야 하지 수 냉장 하지만 오히려 실 온에서 보관 또는 사용 하기 전에 37 ° C에서 습도 CO2 인큐베이터에 배치. 같은 이유로 들어, 모든 시 약 한다 주어질 적절 한 온도에 프로토콜에 표시 된 대로. 이 세포에 영향을 미치는 다른 매개 변수는 세포 스트레스를 최소화 하기 위해 감소 되어야 한다 원심 분리 속도입니다. 또한, 이펙터/대상 준비와 30 분 미만에 공동 창업의 시작 사이 지연 시간을 제한 최대한 살인 활동을 보장 하 고 시험의 재현성에 필수적 이다. 마찬가지로, CFSE 신호는 일반적으로 강력한, 정확한 pipetting, 셀과 정확한 보육의 적절 한 혼합 시간 때 라벨 및 냉각 하는 얼룩에 일관성을 보장 하기 위해 중요 한. 마지막으로, NK 세포 세포 독성 능력 건강 한 개인에도 높은 변수 이며 발달 단계, 성별, 나이, 및 무게 23,24,를 포함 하 여 요인의 숫자에 의해 영향을25. 또한, 최대 30% 건강 한 컨트롤의 표시 상당한 감소 또는 세포 독성 능력의 완전 한 손실 혈액 그린 후 24 시간 이상 테스트 하는 경우. 따라서,이 좋습니다 갓 정화 사용 PBMCs 또는 NK 세포 가능.
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Disclosures
저자는 금융 관심의 없습니다 충돌을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 나 르 시 소 질, ucla의 Immunogenetics 센터, 원고 준비와 그녀의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Stock solution at 10,000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml) |
| K562 Cells | ATCC | CCL-243 | Cancer cell line |
| T-75 cell culture flasks | Corning | 431464 | |
| CFSE cell proliferation kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation. |
| Sodium/lithium heparin blood collection tubes | BD | 02-687-95 | |
| U-bottom 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
| Serological pipettes | BD Falcon | ||
| Polystyrene round-bottom tubes (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| Reagent reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Human NK cell enrichment cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
References
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면역학 문제 126 자연 킬러 NK 세포 세포 독성 세포 세포의 용 해 살인 K562 cytometry 크롬 릴리스 NK 세포의 세포 독성 CFSE 셀Erratum
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 09/10/2017.
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