ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
En flow flowcytometri-baserede metode til at bestemme kvantitativt cytotoksisk aktivitet af menneskets naturlige dræberceller er vist her.
Abstract
Inden for det innate immunsystem spille effektor lymfocytter kaldet natural killer (NK) celler en væsentlig rolle i vært forsvar mod afvigende celler, specielt eliminerer tumorsygdomme og viralt inficerede celler. Ca. 30 kendte monogene defekter, sammen med et væld af andre patologiske betingelser forårsage enten funktionelt eller klassiske NK celle mangel, manifesterer i reduceret eller fraværende cytotoksisk aktivitet. Historisk set har været undersøgt cytotoksicitet med radioaktive metoder, som er besværligt, dyrt og potentielt farlige. I denne artikel beskrives en strømlinet, klinisk relevant flow flowcytometri-baserede metode til at kvantificere NK celle cytotoksisk aktivitet. I denne analyse er perifert blod mononukleære celler (PBMC) eller renset NK celle præparater Co rugede på forskellige nøgletal med en target tumor celle linjen kendt for at være følsomme over for NK celle-medieret cytotoksicitet (NKCC). Målcellerne er forud mærket med et fluorescerende farvestof til at tillade deres diskrimination fra effektor celler (NK-celler). Efter inkubationstid, er dræbt target-cellerne identificeret ved en nukleinsyre plet, som specifikt gennemsyrer døde celler. Denne metode er modtagelig for både diagnostik og forskning applikationer og, tak til multi-parameter kapaciteter af flowcytometri, har den ekstra fordel af potentielt giver en dybere analyse af NK celle fænotype og funktion.
Introduction
Natural killer (NK) celler er en sofistikeret undersæt af menneskets medfødte lymfocytter kritisk involveret i fjernelsen af viralt inficerede celler, transformerede celler og andre patogene trusler 1,2. NK celle lytisk granulat hus cytotoksiske proteiner, såsom perforin og granzymes. Ved aktivering, NK-celler udgør et komplekst samspil med deres mål kendt som immunologiske synapse, hvorved disse cytolytisk molekyler er lokalt frigivet, medførende direkte mål celle lysis og apoptose, sammen med cytokin og chemokine frigivelse og i sidste ende i induktion af en inflammatorisk tilstand 1,3,4.
NK celle aktivering indebærer en kompleks række aktivering og hæmmende interaktioner mellem NK celle receptorer og ligander udtrykkes på overfladen af target-cellerne, danner et stramt reguleret system. En af de mest studerede mekanismer af NK celle aktivering er det "manglende selv". Ja, manglende påvisning af klasse jeg major histocompatibility complex (MHC) eller human leukocyt antigen (HLA) molekyler, på inficeret eller omdannet celler udløser NK celle cytotoksicitet. Tumor og virus-inficerede celler generelt nedregulere disse antigener at undslippe T-celle-medieret immunitet, bliver således primære NK celle mål 1,3,4.
Vurdering af NK cellefunktion er primært kategoriseret i degranulering eller cytotoksicitet assays. Degranulering assays, såsom flow cytometric påvisning af degranulering-associerede markør CD107a, er dog kun vejledende af NK celle aktivering og ikke af deres ultimative funktion, den direkte drab af target celler 5,6,7,8. Derfor, denne begrænsning har tegnet efterforskere til cytotoksicitet assays som et mere sigende og mere direkte alternativ.
Den mangeårige "guldstandarden" for at vurdere celle-mægle cytotoksisk aktivitet af både T og NK celler er chrom release assay (CRA). CRA indebærer radioaktivt mærkning af target-cellerne med 51Cr og co inkubere dem med effektor celler. Denne analyse er gennemsyret af principielt at celle lysis resulterer i frigivelse af protein-bundet 51Cr i supernatanten, der kan måles af gamma optælling. Denne analyse, mens effektiv, er problematisk for en række årsager: høj materialeomkostninger, håndtering og bortskaffelse af radioaktivt 51Cr, spontane frigivelse af 51Cr og vanskelige standardisering - gør det helt upraktisk 9,10.
Siden har udviklet en række ikke-radioaktive assays, der involverer fluorescerende mærkning, enzym udgivelse, og selv bioluminescens, som alternativer til CRA 11,12,13,14. Vi beskriver her en flow flowcytometri-baserede metode til måling af NK celler cytotoksisk aktivitet på K562 target-cellerne som er enkel, følsomme og reproducerbar. K562 celler er en menneskelig erythroleukemic celle linje med reducerede udtryk for HLA klasse I og øget udtryk for ligander til activatory NK receptorer, hvilket gør dem særligt modtagelige for NK celle-medieret cytotoksicitet 15. I denne analyse, K562 celler er forud mærket med carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFSE) og co kulturperler på forskellige nøgletal med enten perifert blod mononukleære celler (PBMC) eller renset NK celler 1. CFSE er en stabil, protein-bindende fluorescerende farvestof, der tillader diskrimination af target-cellerne fra effektor NK celler 16,17. Efter fælles inkubation bruges en nukleinsyre pletten, specielt gennemsyrer membranen af døde celler, til at identificere dræbt target-cellerne (se tabel over materialer). Prøverne er derefter erhvervet på en flow Flowcytometret at bestemme procentdelen af døde (dvs., bejdse +) CFSE + målceller.
Denne analyse kan bruges som en rutinemæssig diagnostisk screening for monogene defekter der påvirker NK celle rum, hvoraf der er ca 30 kendte fejl forårsager enten funktionelt eller klassiske NK celle mangel, og for primær eller sekundær hemophagocytic lymphohistiocytosis. Det er også nyttigt at undersøge NK celleaktivitet hos patienter med tilbagevendende, svær herpes virale infektioner, at evaluere immun rekonstituering efter hæmatopoietisk celle transplantation eller post immunmodulerende behandling 18,19,20, og til et væld af grundlæggende forskning applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før du konfigurerer analysen, er det stærkt anbefales, at NK celleindholdet vurderes i befolkningens effektor valg. Figur 1 viser en typisk CD56 farvning før (lyseblå) og efter (rød) NK celle berigelse. NK-celler udgør op til 15% af PBMC og bør være mindst 80% ren efter berigelse.
Flow cytometric analyse i denne analyse indebærer påvisning af to parametre: CFSE, påvises i den samme kanal som FITC; og en død celle pletten, påvises i den samme kanal som APC (figur 2AB). Efter dataopsamling bruges gating strategien i figur 2 til at analysere data. Døde (dvs., død celle pletten +) K562 target-cellerne er gated ud af CFSE + befolkning, leverer % af dræbte celler inden for målgruppen.
Kontrol betingelser er afgørende for at sikre effektiviteten af analysen sig selv og sin separate komponenter. I orden til analysen skal betragtes som gyldige, følgende bør forventes i kontrol betingelser (6-8): Target celler kun (betingelse 6) bør resultere i celledød < 15% (figur 3A). Ingen CFSE signal registreres for effektor celler kun (betingelse 7), og celledød bør være < 5% (figur 3B). Tween-medieret drab på target-cellerne (betingelse 8), celledød bør være > 85% (figur 3 c).
En patient med defekt i NK cellefunktion forventes at have reduceret drab aktivitet på de fleste eller alle nøgletal testet sammenlignet med en sund person. Parallellen til sund donor og patient celler i figur 4 viser differential, betydelig reduktion i target celledød med faldende effektor-target cell ratio.
Figur 1: vurdering af NK celleindhold inden for befolkningens effektor. Repræsentative histogram efter farvning samlede PBMC (lyseblå) eller renset NK celler (rød) til CD56. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Gating strategi for påvisning af målceller. A) første porten er sat i et FITC-Andersen/SSC plot. K562 celler er gated som CFSE + begivenheder. B) døde K562 celler (dvs. positiv for døde celle pletten) er låge i den efterfølgende APC-Andersen/SSC plot i CFSE + mål celle population. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative data for kontrol betingelser. A) procentdel af døde celle pletten + K562 celler i CFSE + gate (gating strategi som i figur 2) i betingelse 6 (målceller kun) - negativ kontrol for K562 celledød. B) CFSE og døde celle pletten påvisning i betingelse 7 (effektor celler kun - samlede PBMC). C) procentdel af døde celle pletten + K562 celler i CFSE + gate (gating strategi som i figur 2) i betingelse 8 (target-cellerne + Tween) - positiv kontrol for K562 celledød. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative data for fortynding effekten af forskellige effektor-target cell ratio. Effektor: target cell nøgletal testet er som følger: 50: 1, 25: 1; 12.5: 1; 6.25:1. Data er baggrunden (betingelse #6)-fjernet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Stikprøve | Betingelse | Effektor (E): Target (T) |
| PBMC | 1 - positiv kontrol for NK celle cytotoksicitet | 50:1 + IL-2 |
| 2 | 50: 1 | |
| 3 | 25: 1 | |
| 4 | 12.5: 1 | |
| 5 | 6.25: 1 | |
| 6 | T kun | |
| 7 - negativ kontrol for K562 død | E kun | |
| 8 - positiv kontrol for K562 død | T + Tween | |
| NK celler (renset) | 1 - positiv kontrol for NK celle cytotoksicitet | 5:1 + IL-2 |
| 2 | 5: 1 | |
| 3 | 2.5: 1 | |
| 4 | 1.25: 1 | |
| 5 | 0,625: 1 | |
| 6 | T kun | |
| 7 - negativ kontrol for K562 død | E kun | |
| 8 - positiv kontrol for K562 død | T + Tween |
Tabel 1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet her giver en enkel og omkostningseffektiv alternativ til traditionelle 51Cr release analysen at vurdere NK celle cytotoksisk aktivitet. Denne metode er følsomme, reproducerbare og mindre tidskrævende end tidligere standard metoder, ligesom CRA, og kan bruges til både klinisk og forskning applikationer.
Mens analysen arbejder med både samlede PBMC og beriget NK celler, er mulighed for at bruge PBMC uden behov for at rense cellepopulationer en stor fordel, når der beskæftiger sig med små mængder af indsamlet blod eller par eller dårlig kvalitet celler fra patienternes prøver. Denne analyse udnytter kun CFSE og døde celle udstødelse levedygtighed pletten. Ser man på disse to parametre alene giver kortfattet og tilstrækkelige oplysninger til diagnostiske formål, med den ekstra fordel af ikke kræver yderligere kompensation i flow cytometric analyse.
Denne metode kan også bruges til at studere grundlæggende NK cellebiologi og teste roman NK celle-målrettede behandlinger. I denne forbindelse indføre de stadigt voksende kapaciteter af flow cytometers en uvurderlig element af alsidighed til dette assay, så multiparameter analyse af NK celler og deres aktivitet ikke tidligere muligt med assays ligesom CRA. Alternative celle tracking og levedygtighed farvestoffer, fluorescerende i andre kanaler, er tilgængelig til at opfylde den efterforskernes behov.
Denne protokol er optimeret til brug med den prototypiske NK celle mål K562 cellelinje. Det kan dog tilpasses alternative suspension target cellelinjer med varierende grad af følsomhed til NK celle cytotoksicitet, såsom HL-60, Daudi, U937 og Mads. I denne forbindelse er det vigtigt at bemærke, at koncentrationen af fluorescerende farvestof og af serum anvendes under target cell mærkning måske nødt til at være optimeret til hvert mål cellelinie, som forskellige cellelinjer kan tage op fluorescerende etiketten forskelligt, og for hver flow forskellige. Mens typisk anbefales det at undgå at bruge serum under mærkning, valgte vi lille dæmper med 0,5% af FBS af to grunde. Først, det hjælper at reducere target cell stress og således baggrunden pletten; for det andet, det bringer CFSE signal inden for påvisning af vores flow Flowcytometret passende rækkevidde uden at kræve daglige indstillinger justeringer, således medvirken i reproducerbarhed af analysen. Tillægsprotokollen variationer kan omfatte afprøvning af forskellige E:T nøgletal og inkuberingstider at tilpasse assay til forskellige aktivering betingelser. Varighed af effektor og target-cellerne til at teste NK cytotoksicitet Co kultur har historisk varierede fra 4-16 h, selvom længere perioder har tendens til at resultere i øget spontan udgivelsen 9,16. I vores metode, kan længere inkubation også resultere i tab af fluorescerende mærkning af target-cellerne på grund af drab eller spredning, som disse fluorescerende farvestoffer fortyndes ved celledeling. Således inkubationer i den nedre ende af tidsvinduet er generelt foretrækkes, og de bør ikke overstige natten inkubation 6,16,22.
Det er vigtigt at notere som variabler kan potentielt påvirke udfaldet af denne analyse. Vores erfaring er K562 target-cellerne særligt følsomme over for temperaturændringer. Derfor, K562 cellerne bør ikke nedkølet men snarere opbevares ved stuetemperatur eller placeret i en fugtig CO2 inkubator ved 37 ° C før anvendelse. Af samme grund bør alle reagenser tilpasses til de passende temperaturer, som det fremgår af protokollen. En anden parameter påvirker disse celler er den hastighed, centrifugering, som bør reduceres, for at minimere cellulært stress. Desuden er begrænser tidsforsinkelsen mellem effektor/target forberedelse og starten af fælles inkubation til mindre end 30 min. afgørende for at sikre maksimal drab aktivitet og assay reproducerbarhed. På samme måde som CFSE signal er generelt solid, præcis pipettering, korrekt blanding af celler og præcise inkubation tid når mærkning og dæmper er afgørende at sikre sammenhæng i farvning. Endelig, NK celle cytotoksiske evne er meget varierende selv hos raske personer og er påvirket af en række faktorer, herunder udviklingsstadiet, køn, alder og vægt 23,24,25. Derudover op til 30% af raske kontrolpersoner vise en betydelig reduktion eller fuldstændig tab af cytotoksiske evne hvis testet mere end 24 timer efter blod tegne. Derfor anbefales det at brug frisk renset PBMC eller NK celler når det er muligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke nogen konflikter af økonomisk interesse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Jill Narciso, UCLA Immunogenetics Center, for hendes hjælp med håndskriftet forberedelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Stock solution at 10,000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml) |
| K562 Cells | ATCC | CCL-243 | Cancer cell line |
| T-75 cell culture flasks | Corning | 431464 | |
| CFSE cell proliferation kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation. |
| Sodium/lithium heparin blood collection tubes | BD | 02-687-95 | |
| U-bottom 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
| Serological pipettes | BD Falcon | ||
| Polystyrene round-bottom tubes (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| Reagent reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Human NK cell enrichment cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
References
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger? Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).
- Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357 (2014).
- Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
- West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
- Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
- Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
- Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152 (2016).
- Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
- Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578 (2015).
- Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
- Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
- Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
- Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1 (2015).
- Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).
Tags
Immunologi sag 126 natural killer NK celle cytotoksicitet celle lysis celle drab K562 flowcytometri chrom frigivelse NK celle cytotoksicitet CFSEErratum
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 09/10/2017.
Citeable Link.
An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was corrected from:
to:
