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Summary
Aquí se muestra un método basado en la citometría de flujo para determinar cuantitativamente la actividad citotóxica de las células de asesino naturales humanas.
Abstract
Dentro del sistema inmune innato, los linfocitos efectores conocidos como células de naturales del asesinas (NK) juegan un papel esencial en la defensa del huésped contra las células aberrantes, especialmente eliminando tumoral y viralmente infectadas las células. Aproximadamente 30 defectos monogénicas conocidos, junto con una serie de otras condiciones patológicas, deficiencia funcional o clásico NK célula, que se manifiesta en reducción o ausencia de actividad citotóxica. Históricamente, se ha investigado la citotoxicidad con métodos radiactivos, que son engorrosos, costosos y potencialmente peligrosos. Este artículo describe un método basado en la citometría de flujo aerodinámico, clínicamente aplicable para cuantificar la actividad citotóxica de células NK. En este ensayo, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o preparaciones de células NK purificadas son co se incubó a relaciones diferentes con una línea de células de tumor objetivo sabida que es sensible a la citotoxicidad mediada por células NK (NKCC). Las células diana son las marcadas con un colorante fluorescente para permitir la discriminación de las células efectoras (células NK). Después del período de incubación, las células diana mataron son identificadas por una mancha de ácido nucleico, que impregna específicamente células muertas. Este método es susceptible de diagnóstico y aplicaciones de investigación y, gracias a las capacidades de múltiples parámetros de la citometría de flujo, tiene la ventaja añadida de que potencialmente permite un análisis más profundo del fenotipo de la célula NK y la función.
Introduction
Células de naturales del asesinas (NK) son un subconjunto sofisticado de linfocitos innatos humanos críticamente implicados en la eliminación de las células viralmente infectadas, las células transformadas y otras amenazas patógenas 1,2. Casa de gránulos líticos de la célula NK proteínas citotóxicas, como perforin y granzymes. Tras la activación, las células NK forman una interacción compleja con sus objetivos conocidos como sinapsis inmunológica, por el que estas moléculas citolíticas se liberan localmente, dando por resultado la lisis de la célula objetivo directo y apoptosis, junto con liberación de citoquinas y quimioquinas y en última instancia en la inducción de un inflamatorio estado 1,3,4.
Activación de la célula NK involucra una compleja cadena de activación y las interacciones inhibitorias entre NK célula receptores y ligandos expresadas en la superficie de las células de la blanco, formando un sistema fuertemente regulado. Uno de los mecanismos más estudiados de la activación de células NK es la "falta". De hecho, falta de detección de clase en que mayor complejo de histocompatibilidad (MHC), o moléculas de leucocito humano antígeno (HLA), infectados o transformado citotoxicidad celular de células desencadenantes NK. Tumorales y células infectadas por virus generalmente regular a la baja estos antígenos para escapar de la inmunidad mediada por células T, convirtiéndose en principal NK célula objetivos 1,3,4.
Evaluación de la función de la célula NK se categoriza principalmente en degranulación o citotoxicidad ensayos. Sin embargo, ensayos de degranulación, como detección de citometría de flujo del degranulation asociados marcador CD107a, sólo son indicativos de la activación de células NK y no de su función final, la muerte directa de las células objetivo 5,6,7,8. Por lo tanto, esta limitación ha dibujado los investigadores ensayos de citotoxicidad como alternativa más directa y más revelador.
El largo plazo "gold standard" para evaluar la actividad citotóxica mediada por células de las células T y NK es el ensayo de liberación de cromo (CRA). CRA implica radiactivo etiquetado de células diana con 51Cr y co los incuban con las células efectoras. Este ensayo se empapa en el principio que lisis celular resulta en la liberación de proteína determinada 51Cr en el sobrenadante, que puede ser medido contando gamma. Este ensayo, al mismo tiempo eficaz, es problemático para una variedad de razones: altos costos de material, manejo y disposición de radiactivo 51Cr, lanzamiento espontáneo de 51Cr y difícil estandarización - lo que en conjunto práctico 9,10.
Un número de ensayos no radiactivo, con etiquetado fluorescente, liberación de enzima e incluso bioluminiscencia, desde entonces se han desarrollado como alternativas a la CRA 11,12,13,14. Aquí describimos un método basado en la citometría de flujo para medición de NK célula actividad citotóxica en las células K562 objetivo simple, sensible y reproducible. Células K562 son una células erythroleukemic humana la línea con menor expresión de HLA clase I y una mayor expresión de ligandos para receptores NK activatory, que los hace particularmente susceptibles a NK Citotoxicidad mediada por células 15. En este ensayo, las células K562 están marcadas previamente con carboxyfluorescein diacetato succinimidyl éster (CFSE) y cultivan conjuntamente en diferentes proporciones con cualquiera células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o purificaron de células NK 1. CFSE es un colorante fluorescente estable, proteínas de Unión que permite la discriminación de las células de la blanco del efectoras NK células 16,17. Después de la incubación Co, una mancha de ácido nucleico, específicamente impregnando la membrana de las células muertas, se utiliza para identificar las células de la blanco matado (véase tabla de materiales). Las muestras entonces se adquieren en un citómetro de flujo para determinar el porcentaje de muertos (es decir, mancha +) CFSE + células diana.
Este ensayo puede utilizarse como una investigación rutinaria de diagnóstico para defectos monogénicas, que afectan el compartimiento de células NK, que son aproximadamente 30 defectos conocidos que causan deficiencia de células NK ya sea funcional o clásica, y para el lymphohistiocytosis hemophagocytic primario o secundario. También es útil para investigar la actividad de células NK en pacientes con infecciones virales herpes recurrente, grave, para evaluar la reconstitución inmune tras el trasplante de células hematopoyéticas o post inmunomoduladores terapia 18,19,20y de una serie de aplicaciones de la investigación básica.
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Representative Results
Antes de establecer el ensayo, se recomienda evaluar contenido de células NK en la población de efector de elección. La figura 1 muestra una típica coloración CD56 antes (azul claro) y después de enriquecimiento de células NK (rojo). Las células NK constituyen hasta un 15% de PBMCs y deben ser por lo menos 80% de pureza después de enriquecimiento.
El análisis cytometric del flujo en este ensayo implica la detección de dos parámetros: CFSE, perceptible en el mismo canal como FITC; y una mancha de células muertas, perceptible en el mismo canal como APC (figura 2AB). Después de la adquisición de datos, la estrategia bloquea en la figura 2 se utiliza para analizar datos. Las células K562 destino muerto (es decir, células muertas mancha +) son bloqueadas fuera de la CFSE + población, % de células muertas dentro de la población objetivo.
Condiciones de control son fundamentales para asegurar la eficacia de la prueba de sí mismo y sus componentes por separado. En orden para el ensayo a considerar válido, lo siguiente es de esperarse en las condiciones de control (6-8): destino único (condición 6) debe resultar en la muerte celular de células < 15% (Figura 3A). No debe detectar ninguna señal CFSE efectoras de las células solamente (condición 7), y muerte de la célula debe ser < 5% (figura 3B). Para la matanza Tween-mediada de las células diana (condición 8), debe ser la muerte celular > 85% (figura 3).
Se espera que un paciente con defecto en función de las células NK han reducido la actividad de matanza en la mayoría o todos probaron con respecto a un individuo sano. El paralelo de donantes sanos y pacientes en la figura 4 muestra diferencial, significativa reducción en la muerte celular de destino con la disminución de la relación de células efectoras-objetivo.
Figura 1: evaluación del contenido de la célula NK dentro de la población de efector. Histograma representación después de la tinción total PBMCs (azul claro) o purificada (rojo) de las células NK para CD56. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: estrategia para la detección de las células Diana que bloquean. A) la puerta inicial se encuentra en una parcela de FITC-A/SSC-A. Células K562 están cerradas como CFSE + eventos. B) las células K562 muerto (es decir, tinción positiva para células muertas) están bloqueados en la posterior trama de APC-A/SSC-A dentro de la población celular CFSE + objetivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: datos representativos de las condiciones de control. A) porcentaje de tinción de células muertas + K562 células dentro de la CFSE + puerta (compuerta estrategia como en la figura 2) en la condición 6 (sólo células Diana) - control negativo de la muerte de las células K562. B) CFSE y células muertas mancha de detección en la condición 7 (efectoras de las células-PBMCs total). C) porcentaje de tinción de células muertas + K562 células dentro de la CFSE + puerta (compuerta estrategia como en la figura 2) en el estado 8 (células blanco + Tween) - control positivo para la muerte de las células K562. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: datos representativos para el efecto de dilución de vario cociente de células efectoras objetivo. Las proporciones de células efectoras: objetivo probadas son los siguientes: 50: 1, 25: 1; 12.5:1; 6.25:1. datos son antecedentes (estado #6)-eliminado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Muestra | Condición | Efectos (E): Destino (T) |
| PBMCs | 1 - control positivo para la citotoxicidad de células NK | 50:1 + IL-2 |
| 2 | 50: 1 | |
| 3 | 25: 1 | |
| 4 | 12.5: 1 | |
| 5 | 6.25: 1 | |
| 6 | T solamente | |
| 7 - control negativo por la muerte de K562 | E sólo | |
| 8 - control positivo para muerte K562 | T + Tween | |
| Células NK (purificadas) | 1 - control positivo para la citotoxicidad de células NK | 5:1 + IL-2 |
| 2 | 5: 1 | |
| 3 | 2.5: 1 | |
| 4 | 1.25: 1 | |
| 5 | 0,625: 1 | |
| 6 | T solamente | |
| 7 - control negativo por la muerte de K562 | E sólo | |
| 8 - control positivo para muerte K562 | T + Tween |
Tabla 1
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Discussion
El método descrito aquí proporciona una alternativa sencilla y rentable para el ensayo de lanzamiento tradicionales 51Cr para evaluar la actividad citotóxica de células NK. Este método es sensible, reproducible y menos desperdiciador de tiempo que los anteriores métodos estándar, como CRA y puede ser utilizado para ambas clínicas y aplicaciones de investigación.
Mientras que el ensayo trabaja con total PBMCs y enriquecida de las células NK, la opción de usar PBMCs sin la necesidad de purificar poblaciones celulares es un gran beneficio cuando se trata con pequeñas cantidades de sangre recogido o células de pocos o de mala calidad de las muestras de pacientes. Este ensayo utiliza sólo CFSE y tinción de viabilidad de exclusión de células muertas. Mirando estos dos parámetros sólo proporciona información sucinta y suficiente para el diagnóstico, con la ventaja de no exigir mayor indemnización en análisis cytometric del flujo.
Este método puede utilizarse también para estudiar la biología básica de la célula NK y probar nuevas terapias de orientada a la célula NK. En este sentido, la capacidad cada vez mayor de citómetros de flujo introduce un elemento inestimable de versatilidad a este ensayo, lo que permite análisis multiparamétrico de las células NK y su actividad no antes posible con ensayos como CRA. Alternativa de la célula de seguimiento y viabilidad colorantes fluorescentes en otros canales, están disponibles para satisfacer las necesidades de los investigadores.
Este protocolo está optimizado para su uso con el objetivo de la célula NK prototípico línea de celular K562. Sin embargo, puede adaptarse a líneas celulares de suspensión alternativa objetivo con distintos grados de sensibilidad a la citotoxicidad de células NK, como HL-60, Daudi, U937 y Raji. En este sentido, es importante tener en cuenta que la concentración de colorante fluorescente y el suero usado en blanco célula etiquetado podría tener que ser optimizado para cada línea celular de destino, como diferentes líneas celulares podrían tomar la etiqueta fluorescente diferentemente y para cada citómetro de flujo. Mientras que típicamente se recomienda evitar el uso del suero durante el etiquetado, optamos por amortiguamiento leve con 0.5% de FBS por dos razones. En primer lugar, ayuda a reducir la tensión de la célula objetivo y así manchar el fondo; en segundo lugar, trae señal CFSE dentro del rango apropiado de detección de nuestro citómetro de flujo sin necesidad de ajustes de configuración diaria, ayudando así a la reproducibilidad del ensayo. Variaciones del Protocolo adicional podrían incluir pruebas diferentes e: t ratios y tiempos de incubación para adaptar el análisis a las condiciones de activación diferente. La duración de la cultura Co efectoras y células de la blanco a prueba de la citotoxicidad NK ha sido históricamente 4-16 h, aunque períodos más largos tienden a producir mayor liberación espontánea 9,16. En nuestro método, incubación más largo también puede resultar en pérdida de fluorescente etiquetado por las células de la blanco debido a la matanza o la proliferación, como los tintes fluorescentes se diluyen en la división celular. Así, las incubaciones en el extremo inferior de la ventana de tiempo se prefiere generalmente y no deben exceder de16, 6,22de incubación durante la noche.
Es importante tomar nota de que variables pueden afectar potencialmente los resultados de este ensayo. En nuestra experiencia, las células K562 de blanco son especialmente sensibles a los cambios de temperatura. Por lo tanto, las células K562 no deberían refrigeradas pero algo mantuvo a temperatura ambiente o colocadas en una incubadora humidificada de2 CO a 37 ° C antes de su utilización. Por la misma razón, todos los reactivos deberán a las temperaturas adecuadas como se indica en el protocolo. Otro parámetro que afecta a estas células es la velocidad de centrifugación, que debe reducirse para minimizar el estrés celular. Por otra parte, limitar el tiempo entre la preparación del efector y destino y el inicio de la incubación co a menos de 30 min es esencial para asegurar la actividad de matanza máxima y reproducibilidad del análisis. Además, como señal de la CFSE es generalmente robusto, pipeteo preciso, una mezcla adecuada de las células e incubación precisa hora etiquetado y Temple son cruciales para asegurar la consistencia en la tinción. Por último, capacidad citotóxica de células NK es muy variable incluso en individuos sanos y es influenciado por varios factores, incluyendo la etapa de desarrollo, sexo, edad y peso 23,24,25. Además, hasta 30% de controles sanos muestran una reducción o pérdida completa de la capacidad citotóxica si más de 24 horas después de que sangre. Por lo tanto, se recomienda usar recién purificado PBMCs o NK células siempre que sea posible.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de interés financiero.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Jill Narciso, centro de inmunogenética de UCLA, por su asistencia con la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Stock solution at 10,000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml) |
| K562 Cells | ATCC | CCL-243 | Cancer cell line |
| T-75 cell culture flasks | Corning | 431464 | |
| CFSE cell proliferation kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation. |
| Sodium/lithium heparin blood collection tubes | BD | 02-687-95 | |
| U-bottom 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
| Serological pipettes | BD Falcon | ||
| Polystyrene round-bottom tubes (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| Reagent reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Human NK cell enrichment cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
References
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Inmunología número 126 natural killer células NK citotoxicidad lisis celular célula matando K562 citometría de flujo liberación de cromo citotoxicidad de células NK CFSEErratum
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 09/10/2017.
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An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
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