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JoVE Journal Genetics
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Genetics

एक मानक पद्धति पर जांच करने के लिए साइट Mutagenicity के एक समारोह के रूप में बिंदु उत्परिवर्तन मरंमत Catalyzed द्वारा CRISPR/Cas9 और SsODN मानव कोशिकाओं में

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/56195
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Gene Editing Institute, Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute, Christiana Care Health Services, 2Department of Medical Sciences, University of Delaware

Summary

इस प्रोटोकॉल स्तनधारी कोशिकाओं में बिंदु उत्परिवर्तनों की मरंमत के लिए एक CRISPR/Cas9 आधारित जीन संपादन प्रणाली के कार्यप्रवाह रूपरेखा । यहां, हम एक विस्तृत का पालन के साथ जीन संपादन के लिए एक मिश्रित दृष्टिकोण का उपयोग करें-लक्ष्य साइट पर indel गठन को मापने के लिए प्रयोगात्मक रणनीति पर-संक्षेप में, ऑनसाइट mutagenesis का विश्लेषण ।

Abstract

मिश्रित जीन CRISPR/Cas9 और एकल-असहाय oligonucleotides का उपयोग कर संपादन एकल आधार बिंदु उत्परिवर्तनों, जो अक्सर मानव विरासत में मिली विकारों की एक किस्म के लिए जिंमेदार है के सुधार के लिए एक प्रभावी रणनीति है । एक अच्छी तरह से स्थापित सेल-आधारित मॉडल प्रणाली का प्रयोग, एक एकल प्रतिलिपि उत्परिवर्ती eGFP जीन HCT116 कोशिकाओं में एकीकृत की बात उत्परिवर्तन इस मिश्रित दृष्टिकोण का उपयोग कर मरंमत की गई है । सही और सुधारित कोशिकाओं के विश्लेषण जीन संपादन के दोनों परिशुद्धता और आनुवंशिक घावों के विकास के बारे में पता चलता है, जब indels लक्ष्य साइट आसपास के डीएनए अनुक्रम में सही कोशिकाओं में पैदा कर रहे हैं । यहां, विशिष्ट पद्धति के लिए एक बिंदु उत्परिवर्तन के जीन संपादन के लिए इस मिश्रित दृष्टिकोण का विश्लेषण किया, लक्ष्य स्थल पर indel गठन को मापने के लिए एक विस्तृत प्रयोगात्मक रणनीति के साथ युग्मित, उल्लिखित है । इस प्रोटोकॉल CRISPR/Cas9 आधारित मानव चिकित्सा के लिए जीन संपादन विकसित करने के उद्देश्य से जांच के लिए एक मूलभूत दृष्टिकोण और कार्यप्रवाह रूपरेखा । इस काम के निष्कर्ष यह है कि साइट पर mutagenesis CRISPR/Cas9 गतिविधि का एक परिणाम के रूप में बिंदु उत्परिवर्तन की मरंमत की प्रक्रिया के दौरान जगह लेता है । यह काम जगह में एक मानकीकृत पद्धति को mutagenesis की डिग्री है, जो किसी भी नैदानिक कार्यांवयन के लिए किस्मत में दृष्टिकोण का एक महत्वपूर्ण और अहम पहलू होना चाहिए की पहचान डालता है ।

Introduction

Mandecki द्वारा अग्रणी अध्ययन (१९८६) प्लाज्मिड डीएनए में स्थाई परिवर्तन का उपयोग कर oligonucleotides बैक्टीरिया1में तब्दील हो, जबकि Walder और Walder (१९८६) खमीर में इसी तरह के अध्ययन किया2। उसके बाद शीघ्र ही, शर्मन और उनके सहयोगियों ने कागज की एक श्रृंखला है जिसमें एकल असहाय oligonucleotides खमीर कोशिकाओं में पेश करने के लिए जीन3में heritable परिवर्तन कर रहे थे प्रकाशित किया । माइक्रोबियल कोशिकाओं, Kmiec और सहयोगियों में प्राथमिक काम पर बिल्डिंग अद्वितीय एकल एजेंट oligonucleotides कि स्तनधारी कोशिकाओं में एक आधार मरंमत का निर्देश विकसित शुरू किया4। यह अवधारणा जैव रासायनिक डेटा पर आधारित है कि दिखाया गया है कि आरएनए असर अणु डीएनए ठिकानों की पूरी तरह से बना उन से लक्ष्य साइट को कसकर बांध । हालांकि वहां जीन संपादन सफलता के कई रिपोर्टों chimeric oligonucleotides5,6,7का उपयोग कर रहे थे, संपादन के स्तर के प्रयोगों के बीच और विभिंन लक्ष्य भर में उच्च चर रहे/ संयोजन.

एकल असहाय दाता डीएनए के लिए पसंद किया जाता है डबल असहाय दाता डीएनए क्योंकि यह कम से8जीनोम के भीतर यादृच्छिक साइटों पर एकीकृत करने की संभावना है । हालांकि, exogenously शुरू एकल-असहाय oligonucleotides सेलुलर nucleases द्वारा तेजी से गिरावट के लिए प्रवण हैं । oligonucleotides के टर्मिनी को क्षरण से बचाने के लिए कई रणनीतियों को नियोजित किया गया है । एक exonuclease-सुरक्षित, एकल असहाय डीएनए वांछित अनुक्रम युक्त 0.1-1% रेंज6में एक संपादन दक्षता प्राप्त करने के लिए पर्याप्त था । बेहतर और अधिक सुसंगत अभिकर्मक तकनीक, phenotypic readouts के साथ युग्मित, कई अनुसंधान समूहों द्वारा अधिक सुसंगत संपादन के लिए अनुमति दी8,9,10,11, 12,13.

पिछले 10 वर्षों में, वहां एक महत्वपूर्ण लक्ष्य कोशिकाओं को और अधिक जीन संपादन के लिए उत्तरदाई बनाने का प्रयास किया गया है । एक रणनीति सेल चक्र14,15,16का मॉडुलन कार्यरत हैं । जबकि एकल असहाय oligonucleotides (ssODNs) के साथ सामांय प्रतिक्रिया की स्थिति के तहत संपादन आवृत्तियों ०.१% और 1% के बीच मंडराया संस्कृति स्तनधारी कोशिकाओं में पेश किया, जीन संपादन की आवृत्तियों 3 वृद्धि हुई-5 गुना जब oligonucleotides एस चरण के माध्यम से अपने संक्रमण के दौरान कोशिकाओं में पेश किया गया । प्रयोगों की एक अलग श्रृंखला में, Brachman और Kmiec (२००५) सटीक जीन संपादन के अपेक्षाकृत उच्च स्तर (3-5%) प्राप्त किया गया था जब 2 ' 3 ' dideoxycytosine (डीडीसी) 24 एच के लिए कक्षों में oligonucleotide के अलावा करने के लिए पहले की मशीन था17 . डीडीसी ने की दर को कम करता है डीएनए प्रतिकृति कांटा आंदोलन, सुझाव है कि ssODNs द्वारा जीन संपादन की संभावना है कि कोशिकाओं में सक्रिय प्रतिकृति के क्षेत्रों में ODNs के शामिल11,18. एक साथ ले लिया, इन अध्ययनों की अवधारणा है कि दाता डीएनए एक बढ़ती प्रतिकृति जीन संपादन की कार्रवाई का सही तंत्र के भाग के रूप में कांटे में शामिल हो जाता है के नेतृत्व में, कि एक डबल असहाय तोड़ मौजूद है या नहीं19से स्वतंत्र । इस प्रकार, एक बिंदु उत्परिवर्तन के सुधार या गुणसूत्र के भीतर डीएनए के एक खंड के प्रतिस्थापन एक डीएनए बाँधना और एकल किनारा आत्मसात मार्ग के माध्यम से होता है ।

छोटे-अणु एजेंटों के साथ बढ़ती कोशिकाओं में यादृच्छिक डबल-असहाय डीएनए टूट उत्प्रेरण एक वातावरण बनाता है जिसमें डीएनए प्रतिकृति घटनाओं के रूप में सेल को नुकसान20मरंमत के प्रयास में ठप हो जाती है,21। प्रतिकृति कांटे के इस क्षणभंगुर मंदी एकल-असहाय संपादन oligonucleotides द्वारा क्रोमेटिन संरचना का एक अधिक कुशल पैठ में सक्षम बनाता है, लक्ष्य पहुंच15में सुधार । इस तरह के VP16, ब्लीयामीसिन, या camptothecin22,23, के रूप में दवाओं के द्वारा दोहरे फंसे डीएनए टूट के निर्माण के लिए लगभग 10 गुना, 6-8% तक जीन संपादन के स्तर को उत्तेजित करने के लिए दिखाया गया है । हालांकि, यादृच्छिक डबल फंसे डीएनए टूटता एक चिकित्सीय सेटिंग में अवांछनीय हैं ।

प्रोग्राम nucleases और oligonucleotides के साथ जीन संपादन भी सेल डिवीजन24,25के दौरान उत्तेजित है। जब न्यूक्लिक एसिड आधारित वितरण समरूपता बाहर ले जाने के लिए इस्तेमाल किया गया था-तुल्यकालित HCT ११६ कोशिकाओं में मरम्मत का निर्देश दिया, रिवेरा-Torres और सहकर्मियों गतिविधि लक्ष्यीकरण में एक ही वृद्धि प्रदर्शित जब प्रतिलेखन उत्प्रेरक प्रभाव nucleases (TALENs) की तरह एकल-कतरा oligonucleotides, दोनों एक नकल सेल जनसंख्या26,27 में शुरू के साथ कार्यरत थे । हाल ही में, Bialk और उनके सहयोगियों ने दिखाया है कि एकल आधार उत्परिवर्तनों की मरंमत के साथ एक-असहाय oligonucleotides और नियमित रूप से प्रतिस्थापित संकुल की एक सरणी कम palindromic दोहराता Cas9 (CRISPR/Cas9) अणुओं उच्च प्रभावकारिता के साथ जगह लेता है जब सेल की आबादी है ट्रैवर्स एस फेज28। CRISPR अणु आरएनए और कार्यों का समावेश लक्ष्य डीएनए अनुक्रम है कि दरार के लिए नामित किया गया है के भीतर इस क्षेत्र की पहचान करने के लिए है । Cas9 एक बैक्टीरियल एंजाइम है जिसका कार्य एक nucleolytic विनिमय प्रतिक्रिया में डबल-कतरा डीएनए सट करने के लिए है । इस प्रकार, CRISPR पदों जीनोमिक लक्ष्य पर परिसर, और Cas9 nuclease डबल असहाय तोड़ निष्पादित करता है । लिन एट अल । (२०१४) भी जीन संपादन के उच्च आवृत्तियों को प्राप्त करने के लिए सेल चक्र के महत्व का प्रदर्शन किया, एक संशोधित CRISPR/Cas9 ribonulceoprotien (RNP) प्राथमिक नवजात fibroblasts में जटिल मध्यस्थता वितरण प्रणाली का उपयोग कर, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं, और अंय कक्ष पंक्तियां24। इस प्रकार, जीन संपादन और एकल एजेंट जीन संपादन के लिए सेल चक्र प्रगति के बीच स्थापित संबंध प्रोग्राम nucleases और दाता डीएनए का उपयोग कर मिश्रित जीन संपादन के लिए लागू है टेंपलेट्स । जबकि जीन संपादन के लिए मिश्रित दृष्टिकोण एक साथ दाता डीएनए टेंपलेट के साथ भागीदारों की एक किस्म लाया गया है, क्षेत्र में ज्यादातर श्रमिकों का उपयोग CRISPR/Cas9 डबल असहाय तोड़ समारोह प्रदान करते हैं । इस विकल्प की आसानी पर predicated है इस विशेष आनुवंशिक उपकरण और लचीलापन है जिसके साथ यह जीन समारोह को निष्क्रिय करने के लिए या एक विशिष्ट साइट में डीएनए के एक विदेशी टुकड़ा लागू करने के लिए नियोजित किया जा सकता है का उपयोग करें । एक नॉकआउट की पीढ़ी तकनीकी रूप से आसान है एक जीन प्रतिस्थापन, की तुलना में जहां "सही" या रोग साइट में एक जीन की सामांय प्रतियां शामिल परिशुद्धता के साथ बाहर किया जाना चाहिए । शोधकर्ताओं की एक संख्या की पहचान कर रहे है और विशिष्ट दवाओं और रिएजेंट के उपयोग का अध्ययन है कि उत्परिवर्ती ठिकानों के सुधार और उंनत आवृत्तियों पर उचित स्थिति में सामांय आनुवंशिक दृश्यों के सम्मिलन सक्षम करें29।

हाल ही में, रिवेरा-Torres एट अल । 30 मिश्रित जीन संपादन करते थे, एक विशेष रूप से डिजाइन CRISPR/Cas9 प्रणाली और आनुवंशिक एक एकल असहाय oligonucleotide दाता डीएनए टेंपलेट द्वारा प्रदान की गई जानकारी का डबल-असहाय तोड़ गतिविधि का लाभ लेने, एक की मरंमत प्वाइंट उत्परिवर्तन में एकबढ़ाया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एकल प्रति (eGFP) जीन HCT116 कोशिकाओं में एकीकृत । लेखक इस अच्छी तरह मॉडल सेल लाइन का लाभ लिया करने के लिए लक्ष्य साइट आसपास के दरार की विशिष्टता का मूल्यांकन । डेटा पता चलता है कि लक्ष्य साइट पर विविधता मौजूद है, विशेष रूप से कोशिकाओं है कि एक सही अंक उत्परिवर्तन शामिल नहीं है में । इस पांडुलिपि में, हम विस्तार और इन श्रमिकों द्वारा इस्तेमाल के लिए साइट पर उत्परिवर्तन विविधता CRISPR/Cas9 जीन संपादन द्वारा बनाई गई जांच की पद्धति पर ध्यान केंद्रित ।

Protocol

< p class = "jove_content" > निंनलिखित प्रोटोकॉल स्तनधारी कोशिकाओं के साथ काम करना शामिल है; बाँझ तकनीक के साथ परिचित/

< p class = "jove_title" > 1. सेल लाइन और संस्कृति की स्थिति

  1. HCT की संस्कृति के लिए मध्यम के ५०० मिलीलीटर ११६ कोशिकाओं: McCoy & #39; एस 5 संशोधित माध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी L-glutamine, और 1% पेनिसिलिन के साथ पूरक (यह पूरा हो गया है मध् यम).
    नोट: एक टी-७५ या टी-१७५ कुप्पी में चढ़ाना करने से पहले HCT 116-19 कोशिकाओं बढ़ने । जब ९०% धाराप्रवाह, प्रत्येक टी-७५ कुप्पी निकलेगा ८.४ x 10 6 कोशिकाओं, लगभग ५ १० सेमी प्लेट, और प्रत्येक टी-१७५ निकलेगा १८.४ एक्स 10 6 कोशिकाओं, मोटे तौर पर १५ १० सेमी प्लेट.
< p class = "jove_title" > 2. इस कुप्पी से फसल की कोशिकाएं

  1. महाप्राण दूर माध्यम, Dulbecco & #39 के साथ धो; एस फॉस्फेट-बिना कैल्शियम और magniesium (पंजाबियों) के लिए बफर खारा (टी के लिए 10 मिलीलीटर-७५ या टी के लिए 25 मिलीलीटर-१७५), और महाप्राण.
  2. एक 2-एमएल पिपेट (टी के लिए 2 मिलीलीटर-१७५ या टी के लिए 1 मिलीलीटर-७५) का उपयोग कर कुप्पी के लिए trypsin dropwise जोड़ें । ३७ & #176 पर एक मशीन में कुप्पी प्लेस; सी और 5% सह 2 5 मिनट के लिए के लिए कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति है ।
  3. कुप्पी नल सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को उखाड़ फेंक रहे हैं और फिर यह कुप्पी की पूरी सतह पर फैलाने के द्वारा पूरा माध्यम के साथ बुझाने के लिए (8 मिलीलीटर टी के लिए १७५ या 4 एमएल टी-७५).
  4. पिपेट ऊपर और नीचे कई बार सेल के झुरमुट को तोड़ने के लिए और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण करने के लिए
  5. कोशिकाओं के नीचे कताई करने से पहले, 15 एमएल शंकु से 10 & #181; l ले लो और यह 10 के साथ गठबंधन & #181; l trypan नीला के कोशिकाओं को गिनने के लिए. १२५ x g पर 5 मिनट के लिए कताई द्वारा कोशिकाओं को गोली और 16 & #176; C.
< p class = "jove_title" > 3. कोशिकाओं की गिनती करने वाले

  1. Transfer 10 & #181; trypan ब्लू के साथ मिश्रित कोशिकाओं के hemocytometer को एल. बाहर के आसपास 4 ग्रिड गिनती (प्रत्येक ग्रिड 16 चौकों शामिल हैं) ।
    1. सोलह कोने वर्गों के प्रत्येक सेट से औसत सेल गिनती ले लो ।
    2. गुणा १०,००० (10 4 ).
    3. trypan ब्लू इसके अलावा से कमजोर पड़ने के लिए सही करने के लिए कोशिकाओं फसल के लिए इस्तेमाल किया माध्यम की कुल मात्रा से गुणा ।
      नोट: इस प्रकार कोशिकाओं reसस्पेंड करने के लिए खंड की गणना करने के लिए समीकरण स्वरूप:
      < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56195/56195eq1.jpg"/>
      < img alt = "समीकरण 2" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56195/56195eq2.jpg"/>
< p class = "jove_title" > 4. कोशिकाओं को चढ़ाना हर 10-cm प्लेट के लिए

  1. सिंक्रनाइज़ किया जा करने के लिए, पूर्ण मध्यम और 6 & #181 की 5 मिलीलीटर जोड़ें; M के aphidicholin (12 & #181; L २००-प्रूफ इथेनॉल में एक २.५ mM शेयर) के.
  2. Transfer १०० & #181; पुनः के एल-निलंबित सेल गोली, २.५ एक्स 10 6 कोशिकाओं, प्रत्येक 10 सेमी प्लेट और धीरे भंवर मिश्रण करने के लिए ।
  3. पर प्लेटें ३७ & #176; ग और 5% कं 2 के लिए 16-24 ज G1/एस सीमा पर कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 5. Aphidicolin तुल्यकालन से कोशिकाओं को रिहा

  1. 4 ज लक्ष्यीकरण से पहले, महाप्राण, पंजाबियों के साथ धो, महाप्राण, और पूरा मध्यम
    2. के 5 मिलीलीटर जोड़ें
  2. यह ३७ & #176 में वापस जगह है; ग र 5% सह 2 4 ज
< p class = "jove_title" > 6. आरएनए कॉंप्लेक्स

  1. जांग लैब में उत्परिवर्ती eGFP जीन अनुक्रम दर्ज करें & #39; एस ऑनलाइन जेनरेटर < सुप क्लास = "xref" > 25 (http://crispr.mit.edu/) और लक्ष्य साइट के करीब निकटता के साथ बाइंड crispr गाइड अनुक्रम चुनें । किसी व्यावसायिक स्रोत से CRISPR मार्गदर्शिका अनुक्रम प्राप्त करें.
  2. स्टोर CRISPR आरएनए (crRNA), ट्रांस सक्रिय crRNA (tracrRNA), और Cas9 प्रोटीन पर 20 & #176; सी और निर्माता सुझावों के अनुसार उपयोग करें ।
    1. equimolar सांद्रता में आरएनए को ४५ & #181 में मिलाएं; मी. Add ६.७५ & #181; l के a २०० & #181; m शेयर ऑफ़ crRNA and ६.७५ & #181; l a २०० & #181; एम tracrRNA का स्टॉक एक १.५-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब के लिए । Add १६.५० & #181; ते के L प के लिए 30 & #181 का अंतिम खंड बनाने के लिए बफर; l.
  3. हीट at ९५ & #176; सी के लिए 5 मिनट में एक हीट ब्लॉक या पीसीआर मशीन ।
    चेतावनी: Hot!
  4. कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: अगर एक पीसीआर मशीन का उपयोग कर, ०.२ & #176 के लिए ठंडा सेट; C/s.
  5. प्रत्येक नमूने के लिए निंन चरणों का पालन करें ।
    1. पतला २.२२ & #181; l के crRNA: tracrRNA कॉम्प्लेक्स मे २.७८ & #181; l के लिए बफर (10 एमएम Tris, पीएच ८.० और ०.१ एमएम EDTA; पीएच ८.०) का फाइनल वॉल्यूम 5 & #181; l.
    2. पतला १.६७ & #181; l के Cas9 प्रोटीन से एक ६० & #181; M शेयर इन ३.३३ & #181; l कम सीरम मीडियम का अंतिम आयतन 5 & #181; l.
  6. Mix 5 & #181; l के Cas9 प्रोटीन के साथ 5 & #181; स l द लेक् आरएनए
< p class = "jove_title" > 7. को निशाना बनाने के लिए कोशिकाओं की कटाई

  1. महाप्राण माध्यम, पंजाबियों की 5 मिलीलीटर, महाप्राण के साथ धो, और प्रत्येक 10 सेमी प्लेट के लिए पूर्व गर्म trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ & #176; C और 5% कं 2 के लिए 5 min.
    2. पर मशीन में प्लेट्स रखें
  2. 10-मुख्यमंत्री प्लेट पर नल सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को उखाड़ फेंक रहे हैं बनाने के लिए और फिर प्लेट की पूरी सतह पर इसे फैलाने से पूरा माध्यम के 4 मिलीलीटर के साथ बुझाने.
  3. पिपेट ऊपर और नीचे कई बार सेल के झुरमुट को तोड़ने के लिए और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण ।
    4. कोशिकाओं को नीचे की कताई से पहले
  4. , 15 एमएल वाली शंकु ट्यूब से 10 & #181; l लें और इसे 10 & #181 के साथ गठबंधन करें; trypan नीले रंग की कोशिकाओं की गणना करने के लिए । १२५ x जी और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कताई द्वारा कोशिकाओं गोली ।
  5. महाप्राण मध्यम और पंजाब के 5 मिलीलीटर से धो लें । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १२५ x g पर कताई द्वारा कोशिकाओं गोली ।
< p class = "jove_title" > 8. कोशिकाओं की गिनती करने वाले

  1. Transfer 10 & #181; trypan ब्लू के साथ मिश्रित कोशिकाओं के hemocytometer को एल. बाहर के आसपास 4 ग्रिड गिनती (प्रत्येक ग्रिड सोलह चौकों शामिल हैं) ।
    1. सोलह कोने वर्गों के प्रत्येक सेट से औसत सेल गिनती ले लो ।
    2. गुणा १०,००० (10 4 ).
    3. trypan ब्लू इसके अलावा से कमजोर पड़ने के लिए सही करने के लिए कोशिकाओं फसल के लिए इस्तेमाल किया माध्यम की कुल मात्रा से गुणा ।
      नोट: कक्ष पुनर्स्थगित करने के लिए वॉल्यूम की गणना करने के लिए समीकरण स्वरूप निंन है । फिर से आवश्यक संख्या में कोशिकाओं को निलंबित सीरम मुक्त McCoy & #39; एस 5 संशोधित मध्यम ।
      < img alt = "समीकरण 3" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56195/56195eq3.jpg"/>
      < img alt = "समीकरण 4" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56195/56195eq4.jpg"/>
< p class = "jove_title" > 9. लक्ष्यीकरण नमूने

  1. स्थानांतरण १०० & #181; L के सेल सस्पेंशन (5 x 10 5 cells) से स्टेप ८.१ तक प्रत्येक electroporation 4-mm गैप cuvette. Add 10 & #181; RNP कॉम्प्लेक्स का l चरण ६.७ से १०० & #181; l पर कोशिकाओं का एक 5 x 10 5 कोशिका घनत्व. प्रत्येक नमूने के लिए ODN (2 & #181; M) जोड़ें ।
    नोट: एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए, 1 & #181 जोड़ें; l के eGFP १ & #181; g/& #181; l व्यक्त प्लाज्मिड
    1. रैक एक electroporation मशीन के लिए ले लो, हल्के से प्रत्येक नमूने झटका, और उंहें चैंबर में जगह है । Electroporate at २५० V, LV; 2 दालें, 1 एस; 13 ms; एकध्रुवीय पल्स.
  2. रैक वापस हुड के लिए स्थानांतरण । एक अच्छी तरह से युक्त 2 मिलीलीटर के लिए प्रत्येक नमूना हस्तांतरण पूरा मध्यम मैंn a 6-वेल प्लेट. ३७ पर मशीन & #176; C और 5% सह 2 सुधार स्तरों के लिए जाँच करने से पहले ७२ h के लिए .
< p class = "jove_title" > 10. जीन संपादित कोशिकाओं और अभिकर्मक दक्षता का विश्लेषण

  1. महाप्राण मध्यम और पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें । पंजाबियों को महाप्राण और जोड़ ५०० & #181; L के 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुआं को प्री-वार्म trypsin. ३७ & #176; C और 5% कं 2 के लिए 5 min.
    2. पर मशीन में प्लेट्स रखें
  2. प्लेट नल सुनिश्चित करने के लिए सभी कोशिकाओं को उखाड़ फेंक रहे हैं और फिर इसे अच्छी तरह से पूरी सतह पर फैलाने से पूरा माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ बुझाने के लिए ।
  3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ५,००० x g पर एक १.५-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब और गोली में कोशिकाओं को पारित ।
  4. महाप्राण यम । पुनः निलंबित सेल गोली ५०० में & #181; FACS बफर (०.५% BSA, 2 मिमी EDTA, और 2 & #181; g/एमएल propidium आयोडाइड में पंजाब) के एल.
  5. नाप कर कोशिका प्रतिदीप्ति (eGFP +) को प्रवाह cytometry ।
    1. में वर्णित के रूप में रिवेरा Torres एट अल < सुप वर्ग = "xref" > 30 .
      2. -प्रत्येक नमूने में जीवित कोशिकाओं की कुल संख्या से अधिक कुल रहते eGFP-सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में सुधार दक्षता की गणना ।
< p class = "jove_title" > 11. डीएनए अनुक्रम विश्लेषण

  1. Electroporate सिंक्रनाइज़ और जारी HCT 116-19 कोशिकाओं की एकाग्रता पर 5 x 10 5 & #8197; cells/100 & #8197; & #181; L, with RNP परिसर at १०० pmols र 72NT ODN at २.० & #181; मी.
  2. 6-अच्छी तरह से प्लेटों के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और उन्हें ७२ एच
    3. के लिए ठीक करने की अनुमति
  3. ९६-अच्छी तरह से एक ४८८-एनएम (१०० मेगावाट) eGFP के लिए लेजर के साथ एक FACS सॉर्टर का उपयोग कर प्लेटों में व्यक्तिगत रूप से सॉर्ट करें/-रिवेरा में वर्णित के रूप में-Torres एट अल < सुप वर्ग = "xref" > 30 .
    नोट: सभी कुओं को सफलतापूर्वक विकसित नहीं होगा ।
  4. चरण 7 में वर्णित के रूप में 6 सप्ताह और फसल पर कोशिकाओं का विस्तार करें ।
    5. कुओं कि वृद्धि से
  5. , एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए आइसोलेशन किट का उपयोग कर सेलुलर gDNA को अलग (सामग्री के तालिका देखें) और पीसीआर के माध्यम से लक्ष्य आधार आसपास के क्षेत्र बढ़ाना (७१८ bp; आगे प्राइमरी 5 & #39;- ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 & #39; र रिवर्स प्राइमरी 5 & #39;-ACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3 & #39;).
  6. नमूने पर डीएनए अनुक्रमण विश्लेषण करते हैं.

Representative Results

हम एक मॉडल प्रणाली का इस्तेमाल किया स्तनधारी कोशिकाओं है, जो एक बिंदु eGFP जीन HCT116 कोशिकाओं में एक प्रतिलिपि के रूप में एकीकृत के भीतर एंबेडेड उत्परिवर्तन के सुधार पर निर्भर करता है में जीन संपादन का अध्ययन । यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि यह एक एकल प्रतिलिपि जीन है; इस प्रकार, डीएनए परिवर्तन या mutagenesis की एक कम जटिल दृश्य बनाया जा सकता है । चित्र 1a लक्षित आधार के साथ उत्परिवर्ती eGFP जीन अनुक्रम को प्रदर्शित करता है, बंद codon टैग के तीसरे आधार, लाल रंग में हाइलाइट किया गया । ७२-आधार oligonucleotide, जो आंशिक रूप से eGFP जीन (72NT) के गैर-लिखित किनारा के पूरक है और एक सी के लिए एक जी से बेस एक्सचेंज प्रेरित करने के लिए बनाया गया है, यह भी सचित्र है । इसके अलावा, एक CRISPR, 2 ए के रूप में नामित, एक 5 ' से 3 ' अभिविंयास में संकेत protospacer अनुक्रम के साथ, भी चित्र 1aमें दर्शाया गया है. इस जीन संपादन प्रतिक्रिया बाहर ले जाने के लिए, हम एक ribonucleoprotein (RNP) CRISPR (सीआर) आरएनए और tracr (एन) मिलकर आरएनए शुद्ध Cas9 प्रोटीन के लिए युग्मित (चित्र 1b), के बजाय एक स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर Cas9 जीन से मिलकर का उपयोग कर का इस्तेमाल किया और उपयुक्त विशिष्ट गाइड आरएनए अनुक्रम.

जब विशेष रूप से डिजाइन RNP कण electroporation, जीन संपादन, eGFP में एकल आधार उत्परिवर्तन की मरंमत के द्वारा सबूत के HCT116 कोशिकाओं में एकल असहाय oligonucleotide के साथ दिया है, के बाद मनाया जाता है ७२ एक प्रवाह का उपयोग कर मशीन के एच cytometer । कार्यात्मक मरंमत लक्षित कोशिकाओं, कोशिकाओं है कि भी इस प्रतिदीप्ति की वजह से छंटाई द्वारा पूरी आबादी से अलग किया जा सकता है में हरी प्रतिदीप्ति के उद्भव द्वारा चौकस है । के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, एक क्रमिक खुराक प्रतिक्रिया RNP और 72NT वृद्धि के समन्वित स्तर के रूप में देखा जा सकता है. आणविक अनुपात, RNP की picomoles, और 72NT के micromolar एकाग्रता के रूप में चित्रा में प्रदर्शित, इष्टतम खुराकों जीन संपादन प्रतिक्रियाओं कि Cas9 अभिव्यक्ति से और विशिष्ट गाइड आरएनए की शुरूआत पर निर्भर हैं में इस्तेमाल किया पर आधारित हैं वैक्टर. चित्रा 2 में इनसेट RNP कण के अभाव में किए गए एक जीन संपादन प्रतिक्रिया प्रदर्शित करता है । यहां, लगभग 1% लक्षित कोशिकाओं को ठीक कर रहे है जब एक 10 गुना उच्च 72NT oligonucleotide की एकाग्रता एकल एजेंट जीन संपादन प्रतिक्रिया में प्रयोग किया जाता है ।

आदेश में निर्धारित करने के लिए यदि आनुवंशिक विविधता लक्ष्य साइट पर मौजूद है-साइट पर mutagenesis प्रभाव तथाकथित-हम व्यक्तिगत कोशिकाओं में जीन संपादन गतिविधि के परिणाम की जांच का फैसला किया । जबकि कुल जनसंख्या की जांच से ज्यादा श्रमसाध्य, आनुवंशिक पदचिह्नों या घावों का एक सही उपाय पता लगाया जा सकता है जब क्लोन्ड विस्तारित कोशिकाओं के जीनोम की जांच की है । हमने चित्रा 2में वर्णित प्रयोग को दोहराया, इस बार केवल RNP कॉम्प्लेक्स के १०० pmol का उपयोग कर रहा है और 72NT oligonucleotide का २.० µmol । ऊपर के रूप में, HCT ११६ कोशिकाओं aphidicholine के साथ 24 घंटे के लिए सिंक्रनाइज़ किया गया और G1/ 4 ज बाद में, कोशिकाओं और जारी जीन संपादन उपकरण electroporation द्वारा शुरू किए गए थे । ७२ एच बाद में, कोशिकाओं FACS का उपयोग कर विश्लेषण और ९६ में व्यक्तिगत रूप से हल किया गया-well प्लेट्स (प्रयोगात्मक प्रक्रिया चित्रा 3में सचित्र है) । हरी प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करने वाले कक्ष क्लोनल विस्तार के लिए एक ९६-अच्छी प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में प्रवाह cytometry द्वारा क्रमबद्ध किए गए थे । महत्वपूर्ण बात, eGFP अभिव्यक्ति की कमी कोशिकाओं को भी अलग और एक ही परिस्थितियों के तहत विस्तार के लिए एक समान फैशन में हल किया गया ।

विकास के 14 दिनों के बाद, व्यक्तिगत क्लोन के अधिकांश पर्याप्त विस्तार किया था डीएनए अलगाव सक्षम करने के लिए । इस तरह के रूप में, eGFP के 16 क्लोन-सकारात्मक नमूनों का चयन किया गया, और आनुवंशिक अखंडता लक्ष्य साइट आसपास के डीएनए अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण किया गया था । आबादी के भीतर alleles के डीएनए अनुक्रम आसपास जानकारी एक wildtype एलील (चित्रा 4a) के अनुक्रम की तुलना करने के लिए अनुक्रम दृश्य सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इकट्ठे, सैंज अनुक्रमण का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था. RNP परिसर के कट साइट एक काले तीर से संकेत दिया है, हरे रंग की पट्टी (2c crRNA) पर स्थित है । के रूप में भी चित्रा 4aमें दिखाया गया है, सभी 16 eGFP-सकारात्मक कोशिकाओं लक्ष्य साइट पर अनुमानित न्यूक्लियोटाइड एक्सचेंज होते हैं । कनवर्ट की गई C अवशेषों लाल रंग में हाइलाइट किया गया है, और पीक प्रोफ़ाइल को प्रतिबिंबित करता है कि सटीक परिवर्तन eGFP-धनात्मक अनुक्रम के नीचे प्रदान किया गया है । इसी तरह के एक फैशन में, 15 गैर हरी क्लोनी अलग, पर्याप्त डीएनए निष्कर्षण और अनुक्रमण सक्षम विस्तार, लक्ष्य साइट पर विविधता के लिए विश्लेषण किया गया । भविष्यवाणी के रूप में, लगभग आधे नमूनों में, कोई डीएनए बेस एक्सचेंज मनाया गया । यह लक्ष्य साइट पर G अवशेषों के रखरखाव में प्रतिबिंबित होता है, जैसा कि चित्र 4Bमें दिखाया गया है । क्लोनिंग इन प्रयोगों में जांच विस्तार के शेष विलोपन उत्परिवर्तनों की एक विषम जनसंख्या प्रदर्शित, इसलिए हरी प्रतिदीप्ति की कमी के लिए लेखांकन । हटाने का आकार एक आधार से लेकर 19 कुर्सियां तक है । यह ध्यान रखें कि हम केवल eGFP-सकारात्मक कोशिकाओं के 15 नमूनों की जांच की है महत्वपूर्ण है, और जब तक हम मानते है कि यह CRISPR/Cas9 गतिविधि द्वारा पीछे छोड़ दिया आनुवंशिक घावों के प्रकार के काफी प्रतिनिधि है, वहां एक संभावना है कि अंय प्रकार या indels के रूपों लक्षित जनसंख्या में मौजूद हो सकता है ।

साथ में ले जाया गया, चित्रा 4 में प्रदर्शित परिणाम eGFP लक्ष्यीकरण प्रणाली में phenotypic readout की पुष्टि करते हैं । सी न्यूक्लियोटाइड को जी का रूपांतरण सही HCT116 कोशिकाओं में हरी प्रतिदीप्ति के उद्भव में सक्षम बनाता है । लक्ष्य स्थल के आसपास कोई आधार प्रतिस्थापन इस प्रयोग के लिए पृथक या पिछले प्रयोगों में27,28के लिए अलग क्लोन में देखा गया है । डेटा भी प्रदर्शित करता है कि कोशिकाओं को बिंदु के द्वारा जीन संपादन से गुजरना असफल उत्परिवर्तन मरंमत रह गए, लेकिन कुछ मामलों में, अनछुए नहीं, आनुवंशिक विविधता की एक सीमा के साथ लक्ष्य साइट आसपास के ।

Figure 1
चित्र 1. (क) उत्परिवर्ती eGFP जीन के जीन संपादन के लिए मॉडल प्रणाली. wildtype के उपयुक्त क्षेत्रों और लक्षित codon के साथ रूपांतरित eGFP जीन, अनुक्रम के केंद्र में स्थित, हरे और लाल रंग में क्रमशः प्रदर्शित कर रहे हैं । exchange के लिए लक्षित न्यूक्लियोटाइड बोल्ड और रेखांकित है । नीले रंग में हाइलाइट कुर्सियां 2c CRISPR protospacer अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करते हैं, और नारंगी कुर्सियां पाम साइट पर प्रकाश डाला । इन प्रयोगों में प्रयुक्त oligonucleotide की लंबाई में ७२ कुर्सियां हैं, तीन टर्मिनल ठिकानों पर असर phosphorothioate संशोधित लिंकेज; ७२-मेर लक्ष्य गैर लिखित (NT) कतरा (72NT) । (ख) CRISPR/Cas9ribonucleoprotein विधानसभा प्रतिक्रिया. crRNA tracrRNA (हरा) के साथ लक्ष्य विशिष्टता (20 कुर्सियां, लाल अनुभाग) 2c protospacer अनुक्रम और एक संपर्क डोमेन (नीला) करने के लिए इसी प्रदान करता है । crRNA और tracrRNA equimolar सांद्रता में annealed होते हैं । RNP असेंबली को पूरा करने के लिए Cas9 प्रोटीन (ग्रे) जोड़ा जाता है । गाइड RNAs (gRNAs) Cas9 endonuclease को सीधा और सक्रिय करें, जिससे टारगेट डीएनए सट जाए । चित्रा के निचले खंड 2c बीज अनुक्रम और tracrRNA अनुक्रम दिखाता है । यह आंकड़ा रिवेरा-Torres, एन. एट अल से संशोधित किया गया था । (२०१७). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. जीन संपादन खुराक निर्भर है जब RNP और ssODN द्वारा निर्देशित । सिंक्रनाइज़ और रिलीज़ किए गए HCT 116-19 कक्षों को CRISPR/Cas9 RNP और µ के 0.6-3.0 72mer m के 24-120 pmol के साथ electroporated किया गया । एक ७२-एच वसूली अवधि के बाद, जीन संपादन गतिविधि एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर मापा गया था । जीन संपादन सुधार दक्षता (%), व्यवहार्य eGFP सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या जनसंख्या में व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या से विभाजित द्वारा निर्धारित के रूप में प्रदर्शित किया जाता है । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि के मूल परिकलन का उपयोग करते हुए तीन पृथक प्रयोगों पर जनरेट किए गए डेटा बिंदुओं के तीन सेट्स से उत्पादित होती हैं । इनसेट: एकल एजेंट जीन संपादन। जीन-संपादन गतिविधि एकल असहाय oligonucleotide (72NT) द्वारा निर्देशित समान शर्तों के तहत RNP परिसर के अभाव में एकाग्रता बढ़ाने के एक समारोह के रूप में प्रस्तुत किया है । यह आंकड़ा रिवेरा-Torres, एन. एट अल से संशोधित किया गया था । (२०१७). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. एकल सेल क्लोन के अलगाव के लिए प्रयोगात्मक रणनीति । eGFP अभिव्यक्ति का प्रदर्शन कोशिकाओं के रूप में सकारात्मक बनाए गए थे और एकल कोशिकाओं के रूप में एक प्रवाह क्लोनिंग विस्तार के लिए व्यक्तिगत कुओं में cytometer का उपयोग कर हल । eGFP अभिव्यक्ति की कमी कोशिकाओं को अलग कर रहे थे और एक ही फैशन में हल और एक ही स्थिति के तहत विस्तारित । डीएनए तो अलग था और eGFP जीन परिलक्षित किया गया था और सैंज अनुक्रमण के अधीन करने के लिए लक्ष्य साइट आसपास के जीन संपादन गतिविधि का विश्लेषण । यह आंकड़ा रिवेरा-Torres, एन. एट अल से संशोधित किया गया था । (२०१७). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. (क) eGFP-धनात्मक कोशिकाओं का Allelic विश्लेषण एक क्लोनल जनसंख्या के रूप में विस्तारित. क्लोनिंग अलग और विस्तारित eGFP-सकारात्मक नमूनों (सोलह क्लोन) प्रत्येक से लक्षित आधार और डीएनए आसपास के साइट पर विश्लेषण किया गया, काटा, शुद्ध, प्रवर्धित, और अनुक्रम । Allelic विश्लेषण बाहर किया गया था, सैंज अनुक्रमण का उपयोग कर इकट्ठे अनुक्रम दृश्य सॉफ्टवेयर और एक wildtype एलील है, जो आंकड़ा के शीर्ष पर सचित्र है के अनुक्रम की तुलना में । RNP परिसर के कट साइट हरी पट्टी (2c crRNA) पर स्थित एक छोटे से काले तीर के रूप में संकेत दिया है । (ख) eGFP-नकारात्मक कोशिकाओं का Allelic विश्लेषण एक क्लोनिंग जनसंख्या के रूप में विस्तारित । पंद्रह व्यक्तिगत नमूने, सही आबादी से प्रारंभिक क्लोन से विस्तारित, बेतरतीब ढंग से चयनित और लक्ष्य न्यूक्लियोटाइड आसपास के स्थल पर indel गठन के लिए विश्लेषण किया गया । ऊपर के रूप में, allelic विश्लेषण सैंज अनुक्रमण का उपयोग कर बाहर ले जाया गया था और एक दृश्य दृश्य सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इकट्ठे हुए । एक बार फिर, एक wildtype एलील के अनुक्रम में आंकड़ा के शीर्ष पर, RNP के कट साइट के साथ प्रस्तुत कर रहे हैं । यह आंकड़ा रिवेरा-Torres, एन. एट अल से संशोधित किया गया था । (२०१७). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Discussion

जीन संपादन मुख्यतः CRISPR/Cas9 प्रणाली के उद्भव के कारण मुख्य रूप से वैज्ञानिक अनुशासन के रूप में उभरा है । यह उल्लेखनीय मार्ग है, जो बैक्टीरियल कोशिकाओं में अपनाने उन्मुक्ति की सुविधा, मानव गुणसूत्रों में जीनोमिक परिवर्तन सक्षम करने के लिए एक आणविक उपकरण के रूप में reपर्पज किया गया है । CRISPR/Cas9 के प्राकृतिक समारोह डबल-कतरा डीएनए विखंडन30,31प्रमुख के लिए अग्रणी शुरू करने के द्वारा वायरल डीएनए को निष्क्रिय करने के लिए है । exogenous डीएनए हमलावर के विनाश में इस गतिविधि का परिणाम है और एक ही वायरल कण द्वारा बाद में संक्रमण को रोकता है कि prokaryotic उन्मुक्ति की ओर जाता है. आश्चर्यजनक, इस प्रणाली फेफड़े व्यवहार दर्शाती है, कि यह विशिष्ट CRISPR पिछले संक्रमण की घटनाओं के द्वारा बनाई गई gRNA को पुनः सक्रिय कर सकते हैं ।

दक्षता और CRISPR/Cas9 द्वारा जीन व्यवधान catalyzed की सटीकता कई युकेरियोटिक आनुवंशिक प्रणाली में इस्तेमाल किया गया है, जहां उद्देश्य के लिए एक कार्य जीन३२निष्क्रिय,३३था । अपने बेसल स्तर को कम करते समय, इस प्रक्रिया में दो मूलभूत कदम होते हैं । पहला एक डबल-कतरा तोड़ है, जबकि दूसरा गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने की अंतर्निहित प्रक्रिया पर निर्भर करता है (NHEJ) को नॉकआउट पूरा करने के लिए । ज्यादातर मामलों में, कुंद के निर्माण में डबल-असहाय तोड़ परिणाम-समाप्त, गुणसूत्र खंडों, और NHEJ में शामिल एंजाइमों गुणसूत्र तोड़ने के लिए प्रतिक्रिया और टूट समाप्त होता है शामिल करने के लिए कार्य करते हैं । इस प्रक्रिया में कभी भी गंभीर साइट पर व्यक्तिगत न्यूक्लियोटाइड की हानि शामिल कर सकते हैं । यहां तक कि कुछ कुर्सियां का नुकसान एक frameshift पैदा कर सकता है, और कार्यात्मक अभिव्यक्ति रहता है । CRISPR/Cas9 का उपयोग NHEJ की प्राकृतिक प्रक्रिया को उलझाने के द्वारा आनुवंशिक नॉकआउट बनाने के लिए युकेरियोटिक आनुवंशिकी में क्रांति हुई है; लक्ष्य साइट पर डीएनए की हानि दोनों पूर्वानुमानित और उंमीद है ।

जीन नॉकआउट करने के लिए इसके विपरीत, शोधकर्ताओं की एक संख्या समरूपता की प्रक्रिया का निर्देशन मरंमत की ओर CRISPR/Cas9 गतिविधि अनुप्रेषित और पुनर्प्रयोजन के प्रयास में लगे हुए है । अध्ययन का उद्देश्य जीन सुधार है । इस रणनीति में, CRISPR/Cas9 एक दाता डीएनए टेंपलेट है कि आनुवंशिक जानकारी के लिए एक जन्मजात त्रुटि की मरंमत या स्वस्थ जीन में परिवर्तन डालने के लिए प्रदान करता है के साथ संयुक्त है । प्रारंभिक रिपोर्ट CRISPR/Cas9 की उल्लेखनीय क्षमता पर प्रकाश डाला उत्प्रेरित समरूपता-निर्देशित मरंमत (प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से) है कि इस प्रक्रिया को एक बहुत ही सटीक फैशन24,३४में हुई । हमारी प्रयोगशाला समरूपता का अध्ययन किया गया है-निर्देशित मरंमत या जीन एक तंत्र और नियामक सर्किट यह आसपास परिभाषित करने के प्रयास में एकल असहाय oligonucleotides का उपयोग कर सुधार15,17,18 ,23. हम मुख्य रूप से जीन संपादन एकल बिंदु उत्परिवर्तनों पर ध्यान केंद्रित किया है, क्योंकि यह सबसे बुनियादी आनुवंशिक उत्परिवर्तन के लिए कई वंशानुगत विकारों के लिए जिंमेदार जाना जाता है । हमारे जीन संपादन के बुनियादी ज्ञान का नेतृत्व हमें CRISPR/Cas9 गतिविधि की परिशुद्धता के लिए इन प्रतिक्रियाओं में सवाल है, CRISPR के बाद से indels के गठन में जीन नॉकआउट परिणाम में Cas9 समारोह/ हम एक अच्छी तरह से परिभाषित मॉडल प्रणाली का इस्तेमाल किया, बजाय एक गैर चयन अभी तक नैदानिक प्रासंगिक जीन, पर अध्ययन करने के लिए एक निश्चित कमी फैशन में साइट mutagenesis । एक सरल लक्ष्य जीन का उपयोग करके, जिस पर जीन सुधार दोनों genotypic और phenotypic स्तर पर मापा जा सकता है, हम कारण है कि विविधता लक्ष्य साइट पर होने वाली एक विश्वसनीय और मजबूत फैशन में पहचाना जा सकता है ।

हमारे डेटा की पुष्टि करते है कि अच्छी तरह से स्थापित जीन संपादन प्रणाली, एक उत्परिवर्ती eGFP जीन HCT116 कोशिकाओं में एकीकृत से मिलकर, आनुवंशिक घावों की पीढ़ी के संबंध में मूलभूत जानकारी प्रदान कर सकते है और पर साइट mutagenesis की प्रक्रिया । CRISPR/Cas9 और एकल-असहाय oligonucleotide दाता डीएनए मिलकर काम कर रहे अणुओं eGFP जीन में बात उत्परिवर्तन के सटीक मरंमत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हम बिंदु उत्परिवर्तनों, एक आणविक मार्ग जिसमें दाता डीएनए एक प्रतिकृति के रूप में कार्य करता है की मरंमत के लिए एक नया मॉडल प्रस्ताव के उत्परिवर्ती आधार की मरंमत के लिए टेंपलेट, एक प्रक्रिया हम सही कहा है30। लक्षित जनसंख्या, सही phenotype प्रदर्शित नहीं है, विषम और व्यापक रूप से डीएनए को लेकर लक्ष्य साइट आसपास के indels युक्त कोशिकाओं की एक किस्म प्रदर्शित करता है । लगभग आधे सुधारित जनसंख्या से पृथक क्लोन, विलोपन mutagenesis लक्ष्य स्थल पर मनाया गया । के बाद से कोई पिछली रिपोर्ट संकेत दिया है कि एकल oligonucleotides एकल एजेंट जीन के रूप में अभिनय-संपादन उपकरण लक्ष्य साइट पर indels प्रेरित कर सकते हैं, हम निष्कर्ष है कि CRISPR/Cas9 गतिविधि इन उत्परिवर्तनों के लिए जिंमेदार है ।

इस पांडुलिपि में हम एक विस्तृत कार्यप्रणाली प्रदान करते हैं ताकि लक्ष्य स्थल पर जेनेटिक विविधता को विश्वसनीय और दमदार फैशन में मापा जा सके । जबकि ध्यान का एक विशाल राशि विश्लेषण और ऑफ साइट mutagenesis के मानचित्रण के लिए भुगतान किया गया है, यह संभावना है कि एक विषम लक्ष्य साइट पर बनाया उत्परिवर्तन नैदानिक क्षेत्र में सफलता या जीन संपादन की विफलता पर अधिक प्रभाव पड़ेगा । अतिरिक्त तकनीकों या संशोधित Cas9 प्रोटीन की परिशुद्धता में सुधार करने के लिए आवश्यक हो सकता है समरूपता-निर्देशित सुधार स्तनधारी कक्ष३५में अजन्मी त्रुटियों का । इन प्रौद्योगिकियों के कुछ सहायक oligonucleotides के उपयोग के लिए एक पुल के रूप में कार्य शामिल है, गुणसूत्र धारण एक साथ समाप्त होता है और NHEJ के विनाशकारी कार्रवाई से परहेज । जीन संपादन गतिविधि का एक परिणाम के रूप में लक्ष्य साइट पर विविधता की डिग्री परिभाषित है और किसी भी चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए डिजाइन प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण हिस्सा होना चाहिए ।

Disclosures

कुछ नहीं होने का खुलासा करने वाले लेखक.

Acknowledgments

लेखकों की कोई पावती नहीं है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
McCoy’s 5A Modified medium ATCC 30-2007
Fetal Bovine Serum (FBS) ATCC 30-2020
L-glutamine ATCC 30-2214
Penicillin-Streptomycin Solution ATCC 30-2300
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline ATCC 30-2200 No Calcium or magnesium
Trypsin EDTA Solution ATCC 30-2101
Aphidicolin 1mg Thermo Fisher AC611970010
Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol IDT No catalog number since its made to your specific gene target.
CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol IDT 1072533
S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg IDT 1074182
IDTE Buffer IDT 11-01-03-01
Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm VWR 10497-474
Gene Pulser Xcell Electroporation Systems BioRad 1652660
Bovine serum albumin
lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE)		 Sigma 05470-1G
EDTA (0.5 M), pH 8.0 ThermoFisher Scientific AM9260G
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water ThermoFisher Scientific P3566
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) Qiagen 69581
6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates VWR 10062-892
Petri Dishes Fisher 12-565-90
Conical Tubes (15 mL) (racked) Thermo Fisher AM12500
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Reduced Serum Medium Thermo Fisher 31985062

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References

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आण्विक जीवविज्ञान १२६ मुद्दा Mutagenicity बिंदु उत्परिवर्तन मरंमत CRISPR/Cas9 एकल-असहाय डीएनए oligonucleotides जीन संपादन
एक मानक पद्धति पर जांच करने के लिए साइट Mutagenicity के एक समारोह के रूप में बिंदु उत्परिवर्तन मरंमत Catalyzed द्वारा CRISPR/Cas9 और SsODN मानव कोशिकाओं में
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Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. A… More

Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells. J. Vis. Exp. (126), e56195, doi:10.3791/56195 (2017).

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