该协议概述了 CRISPR/Cas9-based 基因编辑系统的工作流程, 用于修复哺乳动物细胞的点突变。在这里, 我们使用一个组合的方法来基因编辑和详细的后续实验策略, 测量 indel 形成在目标 site-in 本质, 分析现场诱变。
组合基因编辑使用 CRISPR/Cas9 和单寡核苷酸是一种有效的策略, 纠正单基点突变, 这往往是对各种人类遗传性疾病负责。使用一个完善的细胞模型系统, 单突变 eGFP 基因的点突变集成到 HCT116 单元已修复使用这种组合方法。对纠正和未矫正的细胞的分析揭示了基因编辑的精确度和基因病变的发展, 当 indels 是建立在未矫正的细胞中的 DNA 序列周围的目标站点。在这里, 具体的方法用于分析这种组合方法的基因编辑点突变, 再加上详细的实验策略, 以测量 indel 形成在目标站点, 概述。该协议概述了一个基础的方法和工作流程的调查, 旨在开发 CRISPR/Cas9-based 基因编辑的人类治疗。这项工作的结论是, on-site 突变发生在点突变修复过程中的 CRISPR/Cas9 活性的结果。这项工作建立了一个标准化的方法, 以确定的程度突变, 这应该是一个重要的和关键的方面, 任何方法的临床实施。
Mandecki (1986) 的先驱研究表明, 使用寡核苷酸转化为细菌的质粒 DNA 的永久性变化为1, 而瓦德和瓦德 (1986) 在酵母中进行了类似的研究, 如2。此后不久, 谢尔曼和他的同事发表了一系列的论文, 其中单寡核苷酸被引入酵母细胞中, 以使基因的遗传变化3。在微生物细胞的开创性工作的基础上, Kmiec 和同事开始开发独特的单寡核苷酸, 指导单个基地修复哺乳动物细胞4。这个概念是基于生物化学数据的, 它表明, 承载 RNA 的分子比完全由 DNA 基础组成的基因更紧密地束缚在目标部位。虽然有许多报告的基因编辑成功使用嵌合体寡核苷酸5,6,7, 编辑水平保持高度可变的实验之间和跨不同的目标/细胞组合.
单链的供体 dna 更倾向于双供者的 dna, 因为它不太可能在基因组8中的随机站点上集成。然而, 外部介绍的单寡核苷酸容易迅速降解细胞核酸。为了防止寡核苷酸的降解, 已采用了几种策略。包含所需序列的酶保护的单 DNA 足以在 0.1-1% 范围6中获得编辑效率。改进和更一致的转染技术, 加上表型读数, 允许更一致的编辑由多个研究组8,9,10,11, 12,13。
在过去的10年中, 有一个重要的努力, 使目标细胞更适于基因编辑。一个策略采用了单元周期的调制14,15,16。当编辑频率在正常反应条件下与单寡核苷酸 (ssODNs) 引入到培养哺乳动物细胞徘徊在0.1% 和1% 之间时, 基因编辑的频率增加 3-到5倍, 当寡核苷酸在 S 期的过渡过程中被引入细胞。在一个单独的系列实验中, Brachman 和 Kmiec (2005) 表明, 当 2 “3” dideoxycytosine (ddC) 在细胞中孵育 24 h 之前, 在添加寡核苷酸之前获得了相对较高的精确基因编辑 (3-5%) (17.ddC 降低了 DNA 复制叉运动的速率, 这表明 ssODNs 在复制单元格中的基因编辑可能涉及将寡合并到活动复制的区域11,18。在一起, 这些研究导致了一个概念, 即捐赠人的 DNA 成为一个不断增长的复制叉, 作为基因编辑的真正作用机制的一部分, 独立于是否存在双断裂或不是19。因此, 通过 dna 配对和单同化途径, 对染色体内的点突变或 dna 片段的替换进行修正。
用小分子药物诱导生长细胞中的随机双 dna 断裂创造了一个环境, 当细胞试图修复损伤2021时, dna 复制事件就会停止。复制叉的这种暂时的减速使单编辑寡核苷酸更有效地穿透染色质结构, 提高了目标辅助功能15。通过 VP16、博莱霉素或喜树碱等药物的双 DNA 断裂的产生,22,23, 已被证明可以刺激基因编辑水平近10倍, 高达6-8%。然而, 在治疗环境中, 随机双 DNA 断裂是不可取的。
基因编辑与可编程的核酸和寡核苷酸在细胞分裂期间也被刺激24,25.当在同步的小贩116细胞中使用酸传递进行同源定向修复时, 在转录激活剂样效应核酸 (TALENs被使用与单寡核苷酸, 两个被介绍入复制的细胞人口26,27 。最近, Bialk 和同事表明, 修复单一基地突变的单寡核苷酸和阵列定期 interspaced 短复发重复 Cas9 (CRISPR/Cas9) 分子发生的更高的功效当单元格填充正在遍历 S 阶段28时。CRISPR 分子由 RNA 和功能组成, 用于识别目标 DNA 序列中被指定用于解理的区域。Cas9 是一种细菌酶, 其功能是在 nucleolytic 交换反应中将双 DNA 劈裂。因此, CRISPR 在基因组目标上定位复合体, Cas9 核酸执行双断裂。林et al.(2014) 还显示了细胞周期对实现高频率基因编辑的重要性, 使用改良的 CRISPR/Cas9 ribonulceoprotien (RNP) 复合介导的分娩系统在初生的成纤维细胞、人胚胎干细胞和其他单元格行24。因此, 基因编辑和细胞周期进展之间建立的单基因编辑的关系是适用于组合基因编辑使用可编程核酸和捐赠人的 DNA 模板。虽然基因编辑的组合方法已经汇集了各种各样的合作伙伴与捐赠人脱氧核糖核酸模板, 多数工作者在领域使用 CRISPR/Cas9 提供双断裂作用。这种选择是基于这种特殊的基因工具的易用性和灵活性, 它可以用来禁用基因功能或引进一个外国的 DNA 片段到一个特定的网站。与基因置换相比, 淘汰赛的产生在技术上更容易, 如果将基因的 “正确” 或正常拷贝纳入疾病现场, 必须精确地进行。一些研究人员正在识别和研究使用特定的药物和试剂, 使突变基地的纠正和正常的基因序列在适当的位置在高频率的插入29。
最近, 维瑞-托雷斯et al.30使用组合基因编辑, 利用专门设计的 CRISPR/Cas9 系统的双断裂活动和单寡核苷酸供体 DNA 模板提供的遗传信息, 修复点突变在一个单一副本的增强绿色荧光灯蛋白 (eGFP) 基因集成到 HCT116 细胞。作者利用这种良好模型细胞系来评价靶点周围的特异性。数据显示目标站点存在异质性, 特别是在不包含更正点突变的单元格中。在这篇手稿中, 我们详细地讨论了这些工作者用来研究由 CRISPR/Cas9 基因编辑产生的 on-site 突变异质性的方法。
基因编辑已经成为主流的科学学科, 主要是因为 CRISPR/Cas9 系统的出现。这一显着的途径, 促进了细菌细胞的免疫力, 已被改成一种分子工具, 使人类染色体的基因组改变。CRISPR/Cas9 的自然功能是通过引入双 dna 片段来禁用病毒 dna, 从而导致碎片30,31。这一活动导致入侵外源 DNA 的破坏, 并导致原核免疫, 抑制随后感染相同的病毒粒子。令人惊讶的是, 这个系统表现出肺炎的行为, 因为它可以重新激活特定的 CRISPR gRNA 由以前的感染事件创建。
CRISPR/Cas9 催化的基因干扰的效率和准确性已被用于许多真核基因系统, 其目的是禁用功能性基因32,33。当其基本水平降低时, 这个过程包括两个根本步骤。第一个是双的突破, 而第二个依赖于同源端连接 (NHEJ) 的内在过程来完成淘汰赛。在大多数情况下, 双断裂导致钝端, 脱离的染色体片段, 和酶参与 NHEJ 反应的染色体断裂和行动, 以与破碎的两端。这个过程有时会涉及在被切断的站点上的单个核苷酸的丢失。即使失去几个碱基也会导致 frameshift, 而功能表达停止。利用 CRISPR/Cas9 NHEJ 的自然过程来创造基因敲除, 彻底改变了真核基因;目标站点的 DNA 丢失是可预测的, 而且是意料之中的。
与基因剔除不同的是, 一些研究人员一直致力于将 CRISPR/Cas9 的活动重新定向到同源性修复的过程中。研究的目的是基因矫正。在这个策略中, CRISPR/Cas9 结合了一个供体 DNA 模板, 它提供了基因信息来修复先天的错误或将突变植入健康的基因。早期报告突出了 CRISPR/Cas9 的显著能力, 以催化同源定向修复 (直接或间接) 表明, 该过程以高度精确的方式发生24,34。我们的实验室一直在研究同源修复或基因校正使用单寡核苷酸, 试图定义的机制和监管电路围绕它15,17,18 ,23。我们主要关注基因编辑单点突变, 因为这是已知的最基本的基因突变, 对许多遗传性疾病负责。我们对基因编辑的基本认识使我们质疑这些反应中 CRISPR/Cas9 活性的准确性, 因为基因敲除的 CRISPR/Cas9 作用导致了 indels 的形成。我们使用一个明确的模型系统, 而不是一个不可尚未临床相关的基因, 以决定性的简化的方式研究 on-site 突变。通过使用一个简单的目标基因, 在基因的校正可以被测量在型别和表型水平, 我们推断, 在目标站点发生的异质性可以被辨认以可靠和健壮的方式。
我们的数据证实, 成熟的基因编辑系统, 包括一个突变的 eGFP 基因集成到 HCT116 细胞, 可以提供基础信息有关的产生的遗传病变和过程中的 on-site 突变。CRISPR/Cas9 和单寡核苷酸供体 DNA 分子串联工作可导致精确修复的点突变的 eGFP 基因。我们提出了一个新的模型来修复点突变, 一个分子通路, 其中的供体 DNA 作为复制模板修复的突变基地, 一个过程中, 我们称之为精确的30。目标人群, 而不是显示纠正表型, 展示了各种细胞含有异构和广泛范围的 DNA indels 围绕靶点。在大约一半的克隆与未被矫正的人口隔离, 删除突变在目标地点观察。由于以前没有报告表明, 单寡核苷酸作为单基因编辑工具可以诱导 indels 在目标网站, 我们得出结论, CRISPR/Cas9 活动是对这些突变负责。
在这篇手稿中, 我们提供了一个详细的方法, 使目标站点的遗传异质性能够以可靠和健壮的方式进行测量。尽管对异地诱变的分析和制图已经给予了极大的关注, 但在靶点产生的异质突变很可能会对基因编辑在临床领域的成功或失败产生更大的影响。可能需要额外的技术或改良的 Cas9 蛋白来提高哺乳动物细胞的同源性错误修复的精确度35。其中一些技术包括使用辅助寡核苷酸作为桥梁, 将染色体末端结合在一起, 避免 NHEJ 的破坏性作用。由于基因编辑活动的结果, 确定目标地点的异质性程度是而且必须是任何治疗干预方案的重要组成部分。
The authors have nothing to disclose.
作者没有确认。
McCoy’s 5A Modified medium | ATCC | 30-2007 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
L-glutamine | ATCC | 30-2214 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | ATCC | 30-2300 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ATCC | 30-2200 | No Calcium or magnesium |
Trypsin EDTA Solution | ATCC | 30-2101 | |
Aphidicolin 1mg | Thermo Fisher | AC611970010 | |
Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol | IDT | No catalog number since its made to your specific gene target. | |
CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol | IDT | 1072533 | |
S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg | IDT | 1074182 | |
IDTE Buffer | IDT | 11-01-03-01 | |
Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm | VWR | 10497-474 | |
Gene Pulser Xcell Electroporation Systems | BioRad | 1652660 | |
Bovine serum albumin lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE) |
Sigma | 05470-1G | |
EDTA (0.5 M), pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | AM9260G | |
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69581 | |
6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates | VWR | 10062-892 | |
Petri Dishes | Fisher | 12-565-90 | |
Conical Tubes (15 mL) (racked) | Thermo Fisher | AM12500 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |