Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

منهجية موحدة لدراسة المحدثة للطفرات في الموقع كدالة لإصلاح نقطة تحور تحفزها كريسبر/Cas9 وسودن في الخلايا البشرية

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/56195
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Gene Editing Institute, Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute, Christiana Care Health Services, 2Department of Medical Sciences, University of Delaware

Summary

ويحدد هذا البروتوكول سير العمل للجين كريسبر/Cas9-على أساس تحرير النظام للإصلاح من الطفرات في خلايا الثدييات. هنا، علينا استخدام نهج اندماجي لتحرير الجينات مع استراتيجية تجريبية متابعة مفصلة لقياس تشكيل إينديل في الموقع المستهدف، في جوهرها، تحليل الطفرات في الموقع.

Abstract

تحرير الجينات اندماجي باستخدام كريسبر/Cas9 والنوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل هو استراتيجية فعالة لتصحيح الطفرات قاعدة واحدة، التي غالباً ما تكون مسؤولة عن مجموعة متنوعة من الاضطرابات الموروثة البشرية. باستخدام نظام راسخ نموذج يستند إلى الخلية، تم إصلاح نقطة تحول جينة واحدة-نسخة متحولة اجفب دمج الخلايا HCT116 استخدام هذا النهج التوافقي. ويكشف تحليل الخلايا المصححة وغير المصححة الدقة في تحرير الجينات وتطوير الآفات الوراثية، عندما يتم إنشاء إينديلس في الخلايا التي تم تصحيحها في تسلسل الحمض النووي المحيطة بالموقع المستهدف. ويرد هنا، المنهجية المحددة المستخدمة لتحليل هذا النهج التوافقي لتحرير طفرة نقطة، مقترنة باستراتيجية تجريبية مفصلة على قياس تشكيل إينديل في الموقع المستهدف، والجينات. ويوجز هذا البروتوكول إلى نهج التأسيسية وسير التحقيقات الرامية إلى تطوير الجينات كريسبر/Cas9-على أساس تحرير للعلاج البشري. اختتام هذا العمل أن الطفرات في الموقع يحدث نتيجة نشاط كريسبر/Cas9 أثناء عملية إصلاح طفرة نقطة. ويضع هذا العمل في مكان منهجية موحدة لتحديد درجة الطفرات، التي ينبغي أن تكون جانبا هاما وحاسما لأي نهج متجهة إلى تنفيذ السريرية.

Introduction

دور رائد في الدراسات قبل مانديكي (1986) أظهر تغييرات دائمة في الحمض النووي بلازميد استخدام النوكليوتيد تتحول البكتيريا1، بينما الدر والدر (1986) الاضطلاع بدراسات مماثلة في الخميرة2. بعد ذلك بقليل، شيرمان والزملاء نشر سلسلة من الورقات التي أدخلت النوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل في خلايا الخميرة إجراء تغييرات الموروثة في الجينات3. بناء على العمل المنوي في الخلايا الجرثومية، بدأ Kmiec والزملاء تطوير النوكليوتيد وكيل واحد فريدة من نوعها التي توجه إصلاح قاعدة واحدة في خلايا الثدييات4. هذا المفهوم قد استند إلى بيانات البيوكيميائية التي أظهرت أن الجزيئات التي تحمل الحمض النووي الريبي ربط شكل مشدود أكثر إلى الموقع المستهدف من تلك التي تتكون كلية من قواعد الحمض النووي. على الرغم من أن هناك تقارير عديدة عن نجاح تحرير الجينات باستخدام النوكليوتيد تشيميريك5،،من67، تحرير مستويات ظلت اختلافاً كبيرا بين تجارب وعبر مختلف/الخلية الهدف تركيبات.

الحمض النووي المانحين الذين تقطعت بهم السبل--واحد المفضل للمانحين مزدوج تقطعت الحمض النووي لأنها أقل عرضه لدمج مواقع داخل الجينوم8بشكل عشوائي. أدخلت مناشئ واحد-الذين تقطعت بهم السبل النوكليوتيد غير المعرضة للتدهور السريع قبل نوكلياسيس الخلوية. وقد استخدمت عدة استراتيجيات لحماية تيرميني النوكليوتيد من التدهور. الحمض النووي المحمية [ااكسونوكلس]، واحد-الذين تقطعت بهم السبل التي تحتوي على تسلسل المطلوب كان كافياً للحصول على كفاءة تحرير 0.1-1% مجموعة6. تحسنت وتقنيات تعداء أكثر اتساقا، مقترنة بقراءات المظهرية، يسمح لأكثر اتساقا التحرير بواسطة عدة بحوث المجموعات8،9،10،11، ،من 1213.

على مدى السنوات العشر الماضية، كان هناك جهدا كبيرا لجعل الخلايا المستهدفة أكثر قابلية لتحرير الجينات. استراتيجية واحدة توظف تحوير15،،من1416دورة الخلية. أثناء تحرير ترددات تحت شروط رد فعل طبيعي مع النوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل (سودنس) أدخلت خلايا الثدييات مثقف تراوحت بين 0.1% و 1% على الترددات الجينات تحرير زيادة عند ما بين 3 إلى 5 إضعاف في النوكليوتيد أدخلت في الخلايا أثناء انتقالها من خلال المرحلة S. أظهر Brachman و Kmiec (2005) في سلسلة منفصلة من التجارب، أنه تم الحصول على مستويات عالية نسبيا من الجينات الدقيقة تحريرها (3-5%) عندما كان المحتضنة 2 '3' ديديوكسيسيتوسيني (ddC) في الخلايا ل 24 ساعة قبل إضافة اليغنوكليوتيد17 . ddC يقلل من معدل حركة شوكة النسخ المتماثل من الحمض النووي، مما يوحي بأن التحرير الجينات بواسطة سودنس في استنساخ الخلايا يحتمل ينطوي على إدماج أودنس في مناطق من النسخ المتماثل النشط11،18. أخذت معا، هذه الدراسات أدت إلى مفهوم أن المانحين الحمض النووي يصبح تدمج شوكة النسخ متماثل المتنامي كجزء من إليه حقيقية للعمل لتحرير الجينات، مستقلة عن ما إذا كان هذا فاصل مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل أو لا19. وهكذا، تصحيح طفرة نقطة أو الاستعاضة عن جزء من الحمض النووي داخل الكروموسوم يحدث عن طريق الأقران الحمض النووي ومسار واحد-حبلا الاستيعاب.

حمل عشوائي فواصل الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في زراعة الخلايا مع وكلاء جزيء صغير يخلق بيئة التي تعطل الحمض النووي الأحداث النسخ المتماثل الخلية محاولات لإصلاح الضرر20،21. هذا التباطؤ عابرة من شوك النسخ المتماثل يمكن اختراق أكثر كفاءة هيكل الكروماتين النوكليوتيد التحرير واحد-الذين تقطعت بهم السبل، تحسين إمكانية الوصول إلى الهدف15. فواصل إنشاء الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل بالمخدرات مثل VP16، بليوميسين، أو كامبتوثيسين22،23، لقد ثبت لتحفيز الجينات تحرير مستويات بما يقارب 10 إضعاف، يصل إلى 6-8%. ومع ذلك، تكون فواصل الحمض النووي مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل عشوائية غير مرغوب فيها في أجواء علاجية.

الجينات التحرير مع نوكليسيس للبرمجة والنوكليوتيد أيضا حفز خلال انقسام الخلية24،25. عندما تستخدم التسليم على أساس الحمض النووي القيام بإصلاح الموجه من التماثل في تزامن HCT 116 الخلايا، أظهر ريفيرا-توريس والزملاء نفس الزيادة في استهداف النشاط عند النسخ المستجيب المنشط--مثل نوكليسيس (تالينس) كانوا يعملون مع النوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل، سواء أدخلت26،سكان27 خلية تكرار. في الآونة الأخيرة، أظهرت بيالك والزملاء أن إصلاح الطفرات قاعدة واحدة مع النوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل ومجموعة واسعة من مجمع يكرر المتناوب قصيرة بانتظام إينتيرسباسيد Cas9 (كريسبر/Cas9) جزيئات تجري بكفاءة أعلى عندما يتم عبور السكان خلية S المرحلة28. جزيء كريسبر يتكون من الحمض النووي الريبي والوظائف لتحديد المنطقة ضمن الهدف تسلسل الحمض النووي الذي تم تعيينه للانقسام. Cas9 هو إنزيم البكتيري الذي تتمثل وظيفته في تنشق الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في رد فعل تبادل نوكليوليتيك. وهكذا، كريسبر المواقف المعقدة على الهدف الجينوم، وينفذ نوكلياسي Cas9 كسر مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل. لين et al. (2014) كما أظهرت أهمية دورة الخلية لتحقيق الترددات العالية من الجينات التحرير، باستخدام ريبونولسيوبروتين (رنب) كريسبر/Cas9 تعديل مجمع بوساطة نظام تسليم في الابتدائي الولدان الليفية، الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، و أخرى خطوط الخلية24. وهكذا، العلاقة بين تحرير الجينات وتقدم دورة الخلية لتحرير الجينات عامل واحد ينطبق على الجينات اندماجي تحرير باستخدام نوكليسيس القابلة للبرمجة وقوالب الحمض النووي المانحين. بينما جمعت بين مجموعة متنوعة من الشركاء مع قالب الحمض النووي المانحة النهج التوافقي لتحرير الجينات، استخدم معظم العاملين في الحقل كريسبر/Cas9 لتوفير وظيفة كسر مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل. يتوقف هذا الاختيار السهولة استخدام هذه الأداة الوراثية خاصة والمرونة التي يمكن أن تستخدم لتعطيل وظيفة الجينات أو إدخال قطعة خارجية من الحمض النووي في موقع معين. من الناحية الفنية أسهل مقارنة مع توليد بالضربة القاضية لاستبدال جينات، حيث إدراج نسخ "تصحيح" أو العادي من الجينات في موقع المرض يجب أن تنفذ بدقة. تحديد عدد من الباحثين ودراسة استخدام الأدوية المحددة والمواد الكاشفة التي تمكن من تصحيح القواعد المسخ والإدراج من التسلسل الجيني العادي في الموضع المناسب في ترددات مرتفعة29.

ومؤخرا، ريفيرا-توريس et al. 30 استخدام الجينات اندماجي التحرير، مع استفادة نشاط نظام كريسبر/Cas9 مصممة خصيصا والمعلومات الوراثية المقدمة من قالب الحمض النووي مانحة اليغنوكليوتيد واحد-الذين تقطعت بهم السبل، لإصلاح كسر مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل نقطة تحول فيدمج نسخة واحدة من الجينات المحسنة الفلورسنت الأخضر البروتين (اجفب) في الخلايا HCT116. استغل أصحاب هذا الخط خلية نموذج جيد يتسم بتقييم الطابع الخاص للانقسام والمحيطة بالموقع المستهدف. وتكشف البيانات وجود عدم تجانس في الموقع المستهدف، خاصة في الخلايا التي لا تحتوي على نقطة تحور المصوبة. في هذه المخطوطة، بالتفصيل، والتركيز على المنهجية التي يستخدمها هؤلاء العمال للنظر في الموقع عدم التجانس حيث تم إنشاؤها بواسطة تحرير الجينات كريسبر/Cas9.

Protocol

البروتوكول التالي ينطوي على العمل مع خلايا الثدييات؛ والإلمام بالثقافة العقيمة تقنية/خلية ينتظر.

1. خط الخلية وشروط الثقافة

  1. جعل 500 مل من المتوسطة لاستزراع خلايا HCT 116: مكوي ' s 5A معدلة المتوسطة وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين والبنسلين 1% (اكتمال هذا المتوسطة)-
    ملاحظة: تنمو HCT 116-19 خلايا قارورة T-75 أو T-175 قبل الطلاء. عندما روافد 90%، سوف تسفر عن كل قارورة T-75 8.4 × 10 6 خلايا، ما يقرب من خمس لوحات 10 سم، وكل T-175 سوف تسفر عن 18.4 بوصة × 10 6 خلايا، خمسة عشر تقريبا 10 سم لوحات.

2. حصاد الخلايا من قارورة

  1. نضح بعيداً في المتوسط، وتغسل مع دولبيكو ' s "فوسفاتيبوفيريد المالحة" دون الكالسيوم وماجنيسيوم (PBS) (10 مل T-75 أو 25 مل ل T-175)، وأسبيراتي.
    2. التربسين
  2. إضافة dropwise إلى قارورة استخدام ماصة 2 مل (2 مل T-175 أو 1 مل ل T-75). وضع في قارورة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 لمدة 5 دقائق السماح بفصل الخلايا.
  3. اضغط قارورة للتأكد من أن كافة الخلايا يتم فكها واخماد ثم مع المتوسطة كاملة بتفريق على كامل سطح قارورة (8 مل T-175 أو 4 مل T-75)-
  4. ماصة صعودا وهبوطاً عدة مرات كسر كتل الخلايا ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل
  5. قبل الغزل الخلايا أسفل وتأخذ 10 ميليلتر من 15 مل المخروطية ودمجها مع 10 ميليلتر من تريبان الأزرق عد الخلايا. بيليه الخلايا بالغزل لمدة 5 دقائق في 125 × ز و 16 درجة مئوية.

3. عد الخلايا

  1. ميليلتر 10 نقل الخلايا مختلطة مع تريبان الأزرق إلى هيموسيتوميتير. عد 4 شبكات نحو الخارج (كل شبكة تحتوي على مربعات 16).
    1. اتخاذ عدد خلايا متوسط من كل مجموعة من ستة عشر ركن المربعات.
    2. تتكاثر ب 10 آلاف (10 4)-
      3. ضرب
    3. بالحجم الإجمالي للوسيلة المستخدمة لحصاد الخلايا لتصحيح للتخفيف من إضافة تريبان الأزرق-
      ملاحظة: يتبع شكل معادلة لحساب الحجم الخلايا ريسوسبيند:
      Equation 1
      Equation 2

4. طلاء الخلايا

  1. لكل لوح 10 سم من الخلايا التي سيتم مزامنتها، إضافة 5 مل متوسطة كاملة و 6 ميكرومتر من أفيديتشولين (12 ميليلتر من الأسهم 2.5 ملم في الإيثانول واقية من 200)-
  2. نقل 100 ميليلتر لإعادة تعليق خلية بيليه، 2.5 × 10 6 خلايا، لكل لوحة 10 سم ودوامه بلطف مزيج.
  3. احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 لح 16-24 لمزامنة الخلايا عند الحدود G1/S.

5. تحرير الخلايا من "المزامنة أفيديكولين"

  1. ح 4 قبل استهداف، نضح المتوسطة وتغسل ببرنامج تلفزيوني ونضح برنامج تلفزيوني، وإضافة 5 مل متوسطة كاملة
  2. وضعه مرة أخرى في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 لح 4

6. الجيش الملكي النيبالي إلى

  1. أدخل التسلسل الجيني اجفب متحولة إلى المختبر تشانغ ' s مولد أون لاين 25 (http://crispr.mit.edu/) واختر الدليل كريسبر تسلسلات التي تربط بالقرب من الموقع المستهدف. الحصول على دليل كريسبر متواليات من مصدر تجاري.
  2. تخزين "كريسبر الحمض النووي الريبي" (كرنا)، عبر تفعيل كرنا (تراكرنا)، والبروتين Cas9 في 20 درجة مئوية واستخدامها وفقا لاقتراحات الشركة المصنعة.
    1. ميكس الجيش الملكي النيبالي في تركيزات اكويمولار إلى 45 ميكرومتر. إضافة 6.75 ميليلتر من مخزون 200 ميكرومتر كرنا وميليلتر 6.75 مخزون 200 ميكرون من تراكرنا للطرد مركزي 1.5 مل أنبوب. إضافة 16.50 ميليلتر من "المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات" لجعل وحدة تخزين نهائي من 30 ميليلتر.
  3. الحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في كتلة الحرارة أو آلة PCR.
    تنبيه: ساخنة!
  4. السماح لتبرد بدرجة حرارة الغرفة-
    ملاحظة: إذا كان استخدام جهاز PCR، تعيين التبريد إلى 0.2 درجة مئوية/س.
  5. الخطوات التالية لكل عينة.
    1. ميليلتر 2.22 تخفف من crRNA:tracrRNA المعقدة في ميليلتر 2.78 من "المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات" (10 ملم تريس، pH 8.0 و 0.1 ملم يدتا؛ pH 8.0) لوحدة تخزين نهائي من 5 ميليلتر.
    2. ميليلتر 1.67 يضعف من البروتين Cas9 من أصل 60 ميكرومتر في 3.33 ميليلتر من المصل منخفضة متوسطة الحجم النهائي ل 5 ميليلتر.
  6. ميليلتر 5 مزيج من البروتين Cas9 مع 5 ميليلتر من الحمض النووي الريبي الرصاصية

7. حصاد الخلايا لاستهداف

  1. أسبيراتي المتوسط، يغسل مع 5 مل من برنامج تلفزيوني، نضح في برنامج تلفزيوني، وإضافة 1 مل التربسين المعالجون مسبقاً لكل لوح 10 سم. وضع اللوحات في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 للحد الأدنى 5
  2. اضغط على اللوحة 10 سم للتأكد من كافة الخلايا التي أخرجت واخماد ثم مع 4 مل متوسطة كاملة بتفريق على كامل السطح من اللوحة.
  3. ماصة صعودا وهبوطاً عدة مرات كسر كتل الخلايا ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
  4. قبل الغزل الخلايا أسفل وتأخذ 10 ميليلتر من أنبوبة مخروطية الشكل 15 مل ودمجها مع 10 ميليلتر من تريبان الأزرق عد الخلايا. بيليه الخلايا بالغزل لمدة 5 دقائق في 125 × ز ودرجة حرارة الغرفة.
  5. نضح المتوسطة ويغسل مع 5 مل من برنامج تلفزيوني. بيليه الخلايا بالغزل في 125 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة-

8. عد الخلايا

  1. ميليلتر 10 نقل الخلايا مختلطة مع تريبان الأزرق إلى هيموسيتوميتير. عد 4 شبكات نحو الخارج (كل شبكة تحتوي على مربعات ستة عشر).
    1. اتخاذ عدد خلايا متوسط من كل مجموعة من ستة عشر ركن المربعات.
    2. تتكاثر ب 10 آلاف (10 4)-
      3. ضرب
    3. بالحجم الإجمالي للوسيلة المستخدمة لحصاد الخلايا لتصحيح للتخفيف من إضافة تريبان الأزرق-
      ملاحظة: التالي هو تنسيق المعادلة لحساب الحجم الخلايا ريسوسبيند. تعليق إعادة العدد المطلوب من الخلايا في مكوي خالية من المصل ' s 5A معدلة المتوسطة-
      Equation 3
      Equation 4

9-استهداف عينات

  1. نقل 100 ميليلتر تعليق خلية (5 × 10 5 خلايا) من الخطوة 8، 1 لكل ومبومو انهانسر الفجوة 4 مم. إضافة 10 ميليلتر من رنب معقدة من الخطوة 6.7 إلى 100 ميليلتر من الخلايا في كثافة 5 × 10 5 خلية. إضافة ODN (2 ميكرومتر) لكل عينة.
    ملاحظة: عنصر تحكم إيجابية، إضافة 1 ميليلتر من اجفب في 1 ميكروغرام/ميليلتر معربا عن بلازميد
    1. تأخذ الحامل لجهاز انهانسر طفيفة نفض الغبار كل عينة ووضعها في الدائرة. اليكتروبوراتي في 250 الخامس، LV؛ 2 البقول، 1 s; 13 مرض التصلب العصبي المتعدد؛ نبض أحادي القطب.
  2. نقل الحامل إلى غطاء محرك السيارة. نقل كل عينة إلى مل 2 الذي يتضمن أيضا من المتوسطة كاملة أناn لوحة 6-جيدا. احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 لح 72 قبل التحقق من مستويات التصحيح.

10. تحليل الجينات تحرير الخلايا وكفاءة تعداء

  1. نضح المتوسطة وتغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميليلتر من التربسين المعالجون مسبقاً لكل بئر من لوحة 6-جيدا. وضع اللوحات في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 للحد الأدنى 5
  2. اضغط على اللوحة للتأكد من كافة الخلايا التي أخرجت واخماد ثم مع 1 مل متوسطة كاملة بتفريق على كامل سطح البئر.
  3. تمرير الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي وبيليه في 5,000 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
    4. نضح
  4. المتوسط. إعادة تعليق بيليه الخلية في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (0.5% جيش صرب البوسنة، يدتا 2 مم، ويوديد propidium ميكروغرام/مل 2 في برنامج تلفزيوني).
    5. قياس
  5. fluorescence الخلية (اجفب +) بالتدفق الخلوي.
    1. حساب كفاءة التصحيح كنسبة مئوية من مجموع الخلايا إيجابية اجفب يعيش على العدد الكلي للخلايا الحية في كل عينة، كما هو موضح في "ريفيرا توريس" وآخرون 30-

11. تحليل تسلسل الحمض النووي

  1. اليكتروبوراتي HCT متزامنة ويطلق خلايا 116-19 بتركيز 5 × 10 5   الخلايا/100   ميليلتر، مع رنب المعقدة في 100 بمولس و 72NT ODN في 2.0 ميكرون.
  2. نقل الخلايا إلى لوحات 6-جيدا وتسمح لهم باسترداد ل 72 ه.
  3. فرز الخلايا على حدة إلى لوحات 96-جيدا باستخدام أرز نظام مراقبة الأصول الميدانية مع ليزر (100 ميغاواط) 488 نانومتر اجفب +/--، كما هو موضح في ريفيرا-توريس وآخرون 30-
    ملاحظة: ليست جميع الآبار بنجاح سوف تنمو.
  4. توسيع نطاق الخلايا ما يزيد على 6 أسابيع وحصاد كما هو موضح في الخطوة 7.
  5. مجموعة من الآبار التي يكون النمو، وعزل جدنا الخلوية التي تستخدم عزل الحمض النووي متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد)، وتضخيم المنطقة المحيطة بالهدف الأساسي عن طريق PCR (718 bp؛ وإلى الأمام التمهيدي 5 '- ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ' وعكس التمهيدي 5 '-أكتجتاكاجكتكجتككاتجك-3 ')-
  6. "الحمض النووي إجراء" تسلسل التحليل على العينات.

Representative Results

استخدمنا نظام نموذجي لدراسة الجينات التحرير في خلايا الثدييات، الذي يعتمد على تصحيح طفرة نقطة مضمنة داخل الجين اجفب المتكاملة كنسخة واحدة في الخلايا HCT116. من المهم أن نلاحظ أن هذا جين نسخة واحدة؛ وهكذا، يمكن أن يتم عرض أقل تعقيداً لتغييرات الحمض النووي أو الطفرات. يعرض الشكل 1A التسلسل الجيني اجفب متحولة مع قاعدة المستهدفة، القاعدة الثالثة من كودون وقف الوسم، وأبرزت باللون الأحمر. ويتضح أيضا اليغنوكليوتيد 72-قاعدة، الذي يكمل جزئيا حبلا غير نسخها من الجينات اجفب (72NT) ويهدف إلى الحث على تبادل قاعدة من غ إلى ج،. وباﻹضافة إلى ذلك، كريسبر، عينت ج 2، مع تسلسل بروتوسباسير المشار إليها في 5 '3' التوجه، كما يرد في الشكل 1A. للقيام برد الفعل هذا التحرير الجينات، استخدمنا ريبونوكليوبروتين (رنب) تتألف من كريسبر الحمض النووي الريبي (cr)، والجيش الملكي النيبالي تراكر (tr) بالإضافة إلى تنقية Cas9 البروتين (الشكل 1B)، بدلاً من استخدام ناقل تعبير الثدييات تتكون من الجينات Cas9 و الدليل محددة مناسبة تسلسل الحمض النووي الريبي.

عندما يتم تسليم الجسيمات رنب مصممة خصيصا مع اليغنوكليوتيد واحد-الذين تقطعت بهم السبل في خلايا HCT116 انهانسر، الجينات التحرير، يتجلى في إصلاح الطفرة قاعدة واحدة في اجفب، ولوحظ بعد 72 ساعة حضانة باستخدام تدفق سيتوميتير. هو إصلاح وظيفي يمكن ملاحظتها بظهور الفلورية الخضراء في الخلايا المستهدفة، والخلايا التي لا يمكن أيضا فصلها عن جميع السكان بالفرز بسبب هذه الأسفار. كما هو مبين في الشكل 2، يمكن اعتبار جرعة تدريجيا استجابة منسقة مستويات الزيادة رنب و 72NT. نسبة الجزيئية، بيكوموليس رنب، وتركيز ميكرومولار من 72NT كما هو معروض في الشكل، تستند إلى أفضل الجرعات المستخدمة في تحرير الجينات ردود الفعل التي تعتمد على إدخال دليل محدد الحمض النووي الريبي من التعبير ترانسفيكتيد و Cas9 ناقلات الأمراض. اقحم في الشكل 2 يعرض رد فعل تحرير الجينات الاضطلاع بها في غياب الجسيمات رنب. هنا، يتم تصحيح ما يقرب من 1 في المائة الخلايا المستهدفة عندما يستخدم بتركيز أعلى إذ اليغنوكليوتيد 72NT في رد فعل تحرير الجينات عامل واحد.

لتحديد إذا كان التغاير الوراثي موجوداً في تأثير الطفرات في الموقع ما يسمى الموقع المستهدف-قررنا أن تدرس نتائج الجينات تحرير النشاط في الخلايا الفردية. وفي حين شاقة أكثر بكثير من دراسة السكان عموما، مقياسا صحيحاً للبصمات الجينية أو الآفات يمكن التأكد منها عند دراسة جينوم الخلايا كلونالي الموسع. كررنا التجربة المبينة في الشكل 2، هذه المرة فقط باستخدام بمول 100 من رنب المعقدة و µmol 2.0 من اليغنوكليوتيد 72NT. أعلاه، HCT 116 الخلايا كانت مزامنة ل 24 ساعة مع أفيديتشوليني والقبض على الحدود G1/S. 4 ح بعد ذلك، أفرج عن الخلايا وأدخلت أدوات تحرير الجينات التي انهانسر. ح 72 في وقت لاحق، تم تحليل الخلايا باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية وفرزها على حدة إلى لوحات 96-جيدا (ويتضح أن عملية تجريبية في الشكل 3). تم فرز الخلايا عرض الفلورية الخضراء بالتدفق الخلوي في الآبار الفردية من لوحة 96-جيدا للتوسع في الاستنساخ. الأهم من ذلك، كانت الخلايا التي تفتقر إلى التعبير اجفب أيضا معزولة وفرزها بطريقة مماثلة للتوسع نفس الظروف.

وبعد 14 يوما نمو، وسعت معظم المستنسخين الفردية بما فيه الكفاية تمكين عزل الحمض النووي. على هذا النحو، اختيرت استنساخ 16 من العينات الإيجابية اجفب، وكان تحليل سلامة الوراثية المحيطة بموقع الهدف بواسطة تسلسل الحمض النووي. المعلومات المحيطة بتسلسل الحمض النووي من الآليلات داخل السكان من أجله استخدام سانغر التسلسل، وتجميعها باستخدام البرمجيات التصور تسلسل مقارنة تسلسل اليل wildtype (الشكل 4 أ). يتم الإشارة إلى الموقع قطع من مجمع رنب سهم أسود، يقع على الأخضر بار (كررنا ج 2). كما هو موضح في الشكل 4A، يتضمن كافة الخلايا إيجابية اجفب 16 تبادل النوكليوتيدات المتنبأ بها في الموقع المستهدف. هو أبرز بقايا ج المحولة باللون الأحمر، ويتم توفير التشكيل الجانبي ذروة يعكس هذا التغيير المحدد أسفل التسلسل اجفب إيجابية. بطريقة مماثلة، 15 غير الأخضر الاستنساخ يعزل، بما فيه الكفاية الموسع لتمكين استخراج الحمض النووي وتسلسلها، وجرى تحليل لعدم التجانس في الموقع المستهدف. وكما هو متوقع، في حوالي نصف العينات، لوحظ لا تبادل قاعدة الحمض النووي. وينعكس هذا في الحفاظ على بقايا ز في الموقع المستهدف، وكما هو موضح في الشكل 4 باء. عرض ما تبقى التوسعات الاستنساخ التي درست في هذه التجارب سكان غير متجانسة من طفرات الحذف، المحاسبة لذلك لعدم وجود الفلورية الخضراء. حجم الحذف تراوحت من قاعدة واحدة لقواعد 19. من المهم أن نلاحظ أنه قد درسنا فقط 15 عينة من الخلايا اجفب-إيجابية، وفي حين أننا نعتقد أن هذا هو الممثل تماما من هذا نوع الآفات الوراثية التي تركها النشاط كريسبر/Cas9، وهناك احتمال أن أنواع أو أشكال إينديلس أخرى ويمكن أن تكون موجودة في السكان المستهدفين.

أخذت معا، تؤكد النتائج المعروضة في الشكل 4 قراءات المظهرية في اجفب نظام الاستهداف. تحويل ز إلى النوكليوتيدات ج يتيح ظهور الفلورية الخضراء في تصحيح HCT116 الخلايا. وقد لوحظ لا استبدال قاعدة المحيطة بالموقع المستهدف في استنساخ معزولة لهذه التجربة أو التجارب السابقة27،28. وتظهر البيانات أيضا أن تظل الخلايا عدم الخضوع للتحرير عن طريق إصلاح نقطة تحور الجينات التي تم تصحيحها، لكن في بعض الحالات، لا دون تغيير، مع مجموعة من التغاير الوراثي المحيطة بالموقع المستهدف.

Figure 1
رقم 1. (أ) نموذج النظام لتحرير الجينات الجينات متحولة اجفب. يتم عرض شرائح مناسبة wildtype واجفب تحور الجينات مع كودون المستهدفة، يقع في مركز التسلسل، الأخضر والأحمر، على التوالي. النوكليوتيدات المستهدفة للصرف هو الغامق وأكد. القواعد أبرزت في الزرقاء تمثل تسلسل بروتوسباسير كريسبر ج 2، وأسس البرتقال تسليط الضوء على الموقع بام. اليغنوكليوتيد المستخدمة في هذه التجارب قواعد 72 في الطول، إذ تضع الروابط فوسفوروثيواتي تعديل في القواعد الطرفية الثلاث؛ 72-مير أهداف ستراند (NT) نسخها من غير (72NT). (ب) كريسبر/Cas9رد فعل الجمعية ريبونوكليوبروتين. ويوفر كرنا الهدف خصوصية (الباب 20 القواعد، أحمر) المقابلة للتسلسل بروتوسباسير 2 (ج) وفي مجال تفاعل (أزرق) مع تراكرنا (أخضر). يتم تعتيق تراكرنا وكررنا في تركيزات اكويمولار. بروتين Cas9 (رمادي) إضافة إلى استكمال الجمعية رنب. دليل الكشف (جرناس) مباشرة وتفعيل اندونوكليسي Cas9، الذي تنشق ثم الهدف الحمض النووي. ويبين الجزء السفلي من الشكل ج 2 البذور تسلسل وتتابع تراكرنا. تم تعديل هذا الرقم من ريفيرا-توريس، أ. وآخرون (2017). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. الجينات التحرير تعتمد على الجرعة عند إخراج رنب وسودن. مزامنة وأفرج عنه HCT 116-19 خلايا تم اليكتروبوراتيد مع بمول 24-120 من "رنب" كريسبر/Cas9 و 0.6-3.0 ميكرون من 72mer. بعد فترة نقاهة ح 72، تم قياس نشاط الجينات--تحرير cytometer تدفق استخدام. يتم عرض الجينات تحرير كتصحيح كفاءة (%)، يحددها عدد الخلايا اجفب-إيجابية قابلة للتطبيق مقسوماً على العدد الكلي لخلايا قابلة للتطبيق في عدد السكان. ويتم إنتاج أشرطة الخطأ من ثلاث مجموعات من نقاط البيانات المتولدة على مدى ثلاث تجارب منفصلة باستخدام العمليات الحسابية الأساسية من الخطأ القياسي. داخلي: تحرير الجينات عامل واحد. ويقدم نشاط الجينات تحرير إخراج واحد-الذين تقطعت بهم السبل اليغنوكليوتيد (72NT) في غياب رنب المعقدة في ظروف مماثلة كدالة لزيادة تركيز. تم تعديل هذا الرقم من ريفيرا-توريس، أ. وآخرون (2017). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. استراتيجية تجريبية لعزل استنساخ الخلايا المفردة. وسجل الخلايا العارضة التعبير اجفب كانت إيجابية وفرزها باستخدام سيتوميتير تدفق كخلايا مفردة في الآبار الفردية للتوسع في الاستنساخ. الخلايا التي تفتقر إلى التعبير اجفب كانت معزولة وفرزها بطريقة مماثلة وتوسيعها بموجب نفس الشروط. كان الحمض النووي ثم معزولة وتم تضخيم الجين اجفب وتعرض سانغر التسلسل لتحليل نشاط الجينات تحرير المحيطة بالموقع المستهدف. تم تعديل هذا الرقم من ريفيرا-توريس، أ. وآخرون (2017). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. (A) توسيع نطاق التحليل الاليلي اجفب-إيجابية الخلايا كعدد سكان الاستنساخ. كلونالي معزولة والموسعة اجفب إيجابية العينات (استنساخ ستة عشر) تم تحليلها في موقع المحيطة بقاعدة هادفة والحمض النووي من كل حصاد، تنقية، تضخيم ومتسلسلة. تحليل الاليلي أجريت باستخدام سانغر التسلسل وتجميعها باستخدام البرمجيات التصور التسلسل ومقارنة بتسلسل اليل wildtype، الذي يتضح في الجزء العلوي من هذا الرقم. يتم الإشارة إلى الموقع قطع من مجمع رنب كسهم أسود صغير يقع على الأخضر بار (كرنا ج 2). (ب) توسيع التحليل الاليلي الخلايا اجفب السلبية كعدد سكان الاستنساخ. عشوائياً تحديد خمسة عشر عينات الفردية، وتوسع من الحيوانات المستنسخة التي تنشأ من السكان التي لم يتم تصحيحها، وتحليلها لتكوين إينديل في موقع المحيطة النوكليوتيدات المستهدفة. كما أعلاه، الاليلي أجرى تحليل استخدام سانغر التسلسل وتجميعها باستخدام برمجيات تصور تسلسل. مرة أخرى، يتم عرض تسلسل اليل wildtype في الجزء العلوي من هذا الرقم، جنبا إلى جنب مع موقع رنب، قطع. تم تعديل هذا الرقم من ريفيرا-توريس، أ. وآخرون (2017). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

وبرز الجينات تحرير انضباط علمي السائد أساسا بسبب ظهور نظام كريسبر/Cas9. هذا المسار ملحوظا، مما يسهل الحصانة التبني في الخلايا البكتيرية، قد تم إعادة توجيه الغرض منه كأداة جزيئية لتمكين تغيير الجينوم في الكروموسومات البشرية. الوظيفة الطبيعية كريسبر/Cas9 لتعطيل الحمض النووي الفيروسي بإدخال فواصل الحمض النووي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل المؤدية إلى تجزئة30،31. هذا النشاط يؤدي إلى تدمير الغازية خارجية الحمض النووي ويؤدي إلى حصانة بدائية أن يمنع الإصابة اللاحقة بالجسيمات الفيروسية نفسها. مثير للدهشة، أن هذا النظام يسلك سلوك الرئوي، في ذلك فإنه يمكن إعادة تنشيط جرنا كريسبر معينة تم إنشاؤها بواسطة أحداث الإصابة السابقة.

كفاءة ودقة من تعطيل الجينات التي تحفزها كريسبر/Cas9 قد استخدمت في العديد من النظم الوراثية حقيقية النواة حيث كان الهدف تعطيل32،جينات عاملة33. عندما خفضت إلى مستوى القاعدية، العملية تتكون من اثنين من الخطوات الأساسية. الأول كسر مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، بينما الثاني يعتمد على عملية المتأصلة لنهاية غير المتجانسة الالتحاق بالعمل (نج) لإتمام الدفع. في معظم الحالات، نتائج كسر مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في إيجاد بلانت-انتهى، أجزاء الكروموسومات المخلاة، والأنزيمات المشاركة في نج الرد على كسر الصبغية والعمل على ضم نهايات مكسورة. يمكن أن تشمل هذه العملية في بعض الأحيان فقدان النيوكليوتيدات فردية في موقع مقطوعة. يمكن أن يسبب فقدان قواعد قليلة حتى فراميشيفت، وتوقف عن التعبير الوظيفي. استخدام كريسبر/Cas9 لإنشاء الوراثية بالضربة القاضية بالانخراط في عملية طبيعية من نج ثورة حقيقية النواة علم الوراثة؛ فقدان الحمض النووي في موقع الهدف المتوقع ويمكن التنبؤ به على حد سواء.

وعلى النقيض من الجينات بالضربة القاضية، انخرطت عدد من الباحثين في محاولة لإعادة توجيه وإعادة توظيفها النشاط كريسبر/Cas9 تجاه عملية الإصلاح الموجه من التماثل. والهدف من هذه الدراسات تصحيح الجينات. في هذه الاستراتيجية، هو كريسبر/Cas9 جنبا إلى جنب مع قالب الحمض النووي الجهات مانحة التي توفر المعلومات الوراثية لإصلاح خطأ خلقي أو لإدراج الطفرات في جينات صحية. وأفادت التقارير المبكر تسليط الضوء على قدرة كريسبر/Cas9 ملحوظة حفز إصلاح موجه التماثل (مباشرة أو غير مباشرة) أن العملية وقعت في24،أزياء عالية دقة34. المختبر بدراسة الإصلاح الموجه بالتماثل أو تصحيح الجينات باستخدام النوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل في محاولة لتحديد الآلية والتنظيمية الدوائر المحيطة به15،17،18 ،23. وقد ركزنا أساسا على الجينات تحرير الطفرات نقطة واحدة، لأن هذا هو الطفرات الوراثية الأساسية المعروفة لتكون مسؤولة عن العديد من الاضطرابات الموروثة. لدينا المعرفة الأساسية لتحرير الجينات أدت بنا إلى سؤال دقة النشاط كريسبر/Cas9 في ردود الفعل هذه، منذ الدالة كريسبر/Cas9 في الجينات نتائج خروج المغلوب في تشكيل إينديلس. استخدمنا نظام نموذجي واضحة المعالم، بدلاً من جينات ذات الصلة سريرياً بعد غير انتقائية، لدراسة الطفرات في الموقع بطريقة اختزالية بلا ريب. باستخدام جينات مستهدفة بسيطة، بناء على الجينات التي يمكن أن يقاس التصويب على الصعيدين أوضح والمظهرية، نحن مسبب أن التغاير التي تحدث في الموقع المستهدف يمكن تحديدها بطريقة موثوقة وقوية.

البيانات المتوفرة لدينا تؤكد أن الجينات راسخة تحرير النظام، تتألف من اجفب متحولة الجينات دمج الخلايا HCT116، يمكن معلومات التأسيسية فيما يتعلق بتوليد الآفات الوراثية والعملية من الطفرات في الموقع. جزيئات الحامض النووي المانحة اليغنوكليوتيد كريسبر/Cas9 والذين تقطعت بهم السبل--واحدة تعمل في ترادف يمكن أن يؤدي إلى إصلاح نقطة الطفرة في الجين اجفب دقيقة. نحن نقترح نموذجا جديداً لإصلاح الطفرات، طريقا جزيئية التي يعمل الحمض النووي المانحة كقالب النسخ متماثل لإصلاح قاعدة متحولة، عملية ونحن قد وصف الدقيقة30. السكان المستهدفين، لا العارضة النمط الظاهري المصوبة، يعرض مجموعة متنوعة من الخلايا التي تحتوي على غير متجانسة وعلى نطاق واسع بدءاً من الحمض النووي إينديلس المحيطة بالموقع المستهدف. في ما يقرب من نصف المستنسخين معزولة عن السكان التي لم يتم تصحيحها، لوحظ الطفرات الحذف في الموقع المستهدف. أبدت لا تقرير سابق أن النوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل بوصفها أدوات تحرير الجينات عامل واحد يمكن أن يستحث إينديلس في الموقع المستهدف، نستنتج أن النشاط كريسبر/Cas9 المسؤولة عن هذه التحولات.

في هذه المخطوطة، نحن نقدم منهجية مفصلة حيث أنه يمكن أن يقاس التغاير الوراثي في الموقع المستهدف بطريقة موثوقة وقوية. وفي حين يولي قدرا كبيرا من الاهتمام للتحليل ورسم الخرائط من الطفرات خارج الموقع، فمن المرجح أن طفرة غير متجانسة التي تم إنشاؤها في موقع الهدف سوف يكون لها تأثير أكبر على النجاح أو الفشل للجينات التحرير في الساحة السريرية. قد تكون تقنيات إضافية أو معدلة Cas9 البروتينات المطلوبة لتحسين دقة إصلاح أخطاء وراثي في خلايا الثدييات35الموجه من التماثل. بعض هذه التقنيات تشمل استخدام النوكليوتيد الإضافية يكون بمثابة جسر، عقد نهايات الكروموسومات معا، وتجنب الإجراءات المدمرة من نج. تحديد درجة التباين في الموقع المستهدف نتيجة نشاط الجينات--تحرير ويجب أن تكون جزءا هاما من أي بروتوكول مصمم للتدخل العلاجي.

Disclosures

الكتاب لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

المؤلفين قد لا إعلامات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
McCoy’s 5A Modified medium ATCC 30-2007
Fetal Bovine Serum (FBS) ATCC 30-2020
L-glutamine ATCC 30-2214
Penicillin-Streptomycin Solution ATCC 30-2300
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline ATCC 30-2200 No Calcium or magnesium
Trypsin EDTA Solution ATCC 30-2101
Aphidicolin 1mg Thermo Fisher AC611970010
Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol IDT No catalog number since its made to your specific gene target.
CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol IDT 1072533
S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg IDT 1074182
IDTE Buffer IDT 11-01-03-01
Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm VWR 10497-474
Gene Pulser Xcell Electroporation Systems BioRad 1652660
Bovine serum albumin
lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE)		 Sigma 05470-1G
EDTA (0.5 M), pH 8.0 ThermoFisher Scientific AM9260G
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water ThermoFisher Scientific P3566
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) Qiagen 69581
6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates VWR 10062-892
Petri Dishes Fisher 12-565-90
Conical Tubes (15 mL) (racked) Thermo Fisher AM12500
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Reduced Serum Medium Thermo Fisher 31985062

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandecki, W. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci. 83 (19), 7177-7181 (1986).
  2. Walder, R. Y., Walder, J. A. Oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis using the yeast transformation system. Gene. 42 (2), 133-139 (1986).
  3. Moerschell, R. P., Tsunasawa, S., Sherman, F. Transformation of yeast with synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci. 85 (2), 524-528 (1988).
  4. Yoon, K., Cole-Strauss, A., Kmiec, E. B. Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNADNA oligonucleotide. Genetics. 93, 2071-2076 (1996).
  5. Beetham, P. R., Kipp, P. B., Sawycky, X. L., Arntzen, C. J., May, G. D. A tool for functional plant genomics: chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-specific mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8774-8778 (1999).
  6. Bertoni, C., Morris, G. E., Rando, T. A. Strand bias in oligonucleotide-mediated dystrophin gene editing. Hum Mol Gen. 14 (2), 221-233 (2004).
  7. Alexeev, V., Yoon, K. Stable and inheritable changes in genotype and phenotype of albino melanocytes induced by an RNA-DNA oligonucleotide. Nat Biotechnol. 16 (13), 1343-1346 (1998).
  8. Zorin, B., Hegemann, P., Sizova, I. Nuclear-gene targeting by using single-stranded DNA avoids illegitimate DNA integration in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot Cell. 4 (7), 1264-1272 (2005).
  9. Brachman, E. E., Kmiec, E. B. DNA replication and transcription direct a DNA strand bias in the process of targeted gene repair in mammalian cells. J Cell Sci. 117 (Pt 17), 3867-3874 (2004).
  10. Pierce, E. A., et al. Oligonucleotide-directed single-base DNA alterations in mouse embryonic stem cells. Gene Ther. 10 (1), 24-33 (2003).
  11. Radecke, S., Radecke, F., Peter, I., Schwarz, K. Physical incorporation of a single-stranded oligodeoxynucleotide during targeted repair of a human chromosomal locus. J Gene Med. 8 (2), 217-228 (2006).
  12. Bertoni, C., Rustagi, A., Rando, T. A. Enhanced gene repair mediated by methyl-CpG-modified single-stranded oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7468-7482 (2009).
  13. Andrieu-Soler, C., et al. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33 (12), 3733-3742 (2005).
  14. Olsen, P. A., Randol, M., Krauss, S. Implications of cell cycle progression on functional sequence correction by short single-stranded DNA oligonucleotides. Gene Ther. 12 (6), 546-551 (2005).
  15. Engstrom, J. U., Kmiec, E. B. DNA replication, cell cycle progression and the targeted gene repair reaction. Cell Cycle. 7 (10), 1402-1414 (2008).
  16. Aarts, M., te Riele, H. Parameters of oligonucleotide-mediated gene modification in mouse ES cells. J Cell Mol Med. 14 (6b), 1657-1667 (2010).
  17. Brachman, E. E., Kmiec, E. B. Gene repair in mammalian cells is stimulated by the elongation of S phase and transient stalling of replication forks. DNA Repair. 4 (4), 445-457 (2005).
  18. Engstrom, J. U., Suzuki, T., Kmiec, E. B. Regulation of targeted gene repair by intrinsic cellular processes. BioEssays. 31 (2), 159-168 (2009).
  19. Parekh-Olmedo, H., Ferrara, L., Brachman, E., Kmiec, E. B. Gene therapy progress and prospects: targeted gene repair. Gene Ther. 12 (8), 639-646 (2005).
  20. Olsen, P. A., Randol, M., Luna, L., Brown, T., Krauss, S. Genomic sequence correction by single-stranded DNA oligonucleotides: role of DNA synthesis and chemical modifications of the oligonucleotide ends. J Gene Med. 7 (12), 1534-1544 (2005).
  21. Wang, Z., Zhou, Z. -J., Liu, D. -P., Huang, J. -D. Double-stranded break can be repaired by single-stranded oligonucleotides via the ATM/ATR pathway in mammalian cells. Oligonucleotides. 18 (1), 21-32 (2008).
  22. Ferrara, L., Kmiec, E. B. Camptothecin enhances the frequency of oligonucleotide-directed gene repair in mammalian cells by inducing DNA damage and activating homologous recombination. Nucleic Acids Res. 32 (17), 5239-5248 (2004).
  23. Ferrara, L., Parekh-Olmedo, H., Kmiec, E. B. Enhanced oligonucleotide-directed gene targeting in mammalian cells following treatment with DNA damaging agents. Exp Cell Res. 300 (1), 170-179 (2004).
  24. Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
  25. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  26. Rivera-Torres, N., et al. The position of DNA cleavage by TALENs and cell synchronization influences the frequency of gene editing directed by single-stranded oligonucleotides. PLoS One. 9 (5), (2014).
  27. Strouse, B., Bialk, P., Niamat, R. a, Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. Combinatorial gene editing in mammalian cells using ssODNs and TALENs. Sci Rep. 4 (ii), 3791 (2014).
  28. Bialk, P., Rivera-Torres, N., Strouse, B., Kmiec, E. B. Regulation of Gene Editing Activity Directed by Single-Stranded Oligonucleotides and CRISPR/Cas9 Systems. PloS One. 10 (6), e0129308 (2015).
  29. Yu, C., et al. Small Molecules Enhance CRISPR Genome Editing in Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 16 (2), 142-147 (2015).
  30. Rivera-Torres, N., Banas, K., Bialk, P., Bloh, K. M., Kmiec, E. B. Insertional Mutagenesis by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Gene Editing in Cells Targeted for Point Mutation Repair Directed by Short Single-Stranded DNA Oligonucleotides. PLoS One. 12 (1), e0169350 (2017).
  31. Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 31 (9), 833-838 (2013).
  32. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  33. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  34. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
  35. Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).

Tags

إصلاح البيولوجيا الجزيئية، العدد 126، المحدثة للطفرات، طفرة نقطة، كريسبر/Cas9، النوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي والجينات تحرير
منهجية موحدة لدراسة المحدثة للطفرات في الموقع كدالة لإصلاح نقطة تحور تحفزها كريسبر/Cas9 وسودن في الخلايا البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. A… More

Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells. J. Vis. Exp. (126), e56195, doi:10.3791/56195 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter