Summary
Ce protocole décrit le flux de travail d’un gène CRISPR/Cas9-base de montage pour la réparation des mutations ponctuelles dans les cellules de mammifères. Ici, nous utilisons une approche combinatoire de gène avec une stratégie expérimentale suivie détaillée pour mesurer la formation indel au site cible — analyse essentiellement, mutagenèse sur place.
Abstract
Gène combinatoire édition utilisant CRISPR/Cas9 et oligonucléotides monocaténaires est une stratégie efficace pour la correction des mutations ponctuelles de base unique, qui sont souvent responsables d’une variété de maladies héréditaires humaines. À l’aide d’un système de modèle de base de cellules bien établi, la mutation ponctuelle d’un gène simple copie eGFP mutant intégré dans les cellules HCT116 a été réparée en utilisant cette approche combinatoire. L’analyse des cellules corrigées et non corrigées révèle aussi bien la précision de la modification génétique et le développement des lésions génétiques, lorsque indels sont créées dans des cellules non corrigées dans la séquence d’ADN qui entourent le site cible. Ici, la méthodologie spécifique utilisée pour analyser cette approche combinatoire à la rédaction de gène d’une mutation ponctuelle, couplée à une stratégie expérimentale détaillée à mesure indel formation au site cible, est décrite. Ce protocole décrit une approche fondamentale et un "workflow" pour les enquêtes visant à développer le gène CRISPR/Cas9-basée d’édition pour la thérapie humaine. La conclusion de ce travail est que mutagenèse sur place se déroule à la suite de l’activité CRISPR/Cas9 pendant le processus de réparation de mutation ponctuelle. Ce travail met en place une méthodologie standardisée afin de déterminer le degré de la mutagénèse, qui devrait être un aspect important et crucial de toute approche destiné à l’application clinique.
Introduction
Pionnier des études de Mandecki (1986) ont montré des changements permanents dans l’ADN de plasmide utilisant des oligonucléotides transformés en bactéries1, tandis que Walder et Walder (1986), réalisé des études similaires chez la levure2. Peu après, Sherman et collègues publient une série de documents dans laquelle oligonucléotides monocaténaires ont été introduits dans des cellules de levure pour apporter des modifications héréditaires à gènes3. S’appuyant sur l’ouvrage en cellules microbiennes, Kmiec et collègues commencent à développer des oligonucléotides de monothérapie uniques qui réalisé seul surmoulage en cellules mammifères4. Ce concept a été basé sur des données biochimiques qui ont montré que des molécules comportant RNA lient plus étroitement vers le site cible que celles composées entièrement de bases d’ADN. Bien qu’il y a de nombreux rapports de réussite gène-montage utilisant des oligonucléotides chimérique5,6,7, les niveaux d’édition est resté très variables entre les expériences et à travers différente cibles/cellule combinaisons.
ADN simple brin donneur est préféré au donateur bicaténaire ADN parce qu’il est moins susceptible d’intégrer au hasard des sites à l’intérieur du génome8. Cependant, introduite de façon exogène oligonucléotides monocaténaires sont sujettes à la rapide dégradation par les nucléases cellulaires. Plusieurs stratégies visant à protéger les terminus des oligonucléotides de dégradation ont été employées. Une exonucléase protégé, simple brin de l’ADN contenant la séquence souhaitée ne suffisait pas obtenir une efficacité édition dans le 0,1-1 % rang6. Améliorée et plus cohérentes techniques de transfection, associées phénotypiques lectures, prévoyait plus cohérents d’édition de multiples recherche groupes8,9,10,11, 12,13.
Au cours des 10 dernières années, il y a eu un effort significatif pour fabriquer des cellules de cible plus propices à la modification des gènes. Une stratégie utilise la modulation du cycle cellulaire14,15,16. Alors que la modification des fréquences dans des conditions de réaction normale avec des oligonucléotides monocaténaires (ssODNs) introduits dans des cellules de mammifères a oscillé entre 0,1 % et 1 %, la fréquence du gène édition accrue 3 à 5 fois quand les oligonucléotides ont été introduits dans les cellules lors de leur passage dans la phase S. Dans une autre série d’expériences, Brachman et Kmiec (2005) ont démontré que des concentrations relativement élevées des gènes précis édition (3-5 %) ont été obtenues lorsque 2'3 ' dideoxycytosine (ddC) est incubée dans les cellules pendant 24 h avant l’ajout de l’oligonucléotide17 . ddC a réduit la vitesse de mouvement de fourche de réplication ADN, suggérant que le gène édition de ssODNs dans la reproduction de cellules susceptibles implique l’incorporation d’ODN dans les régions de réplication active11,18. Pris ensemble, ces études ont conduit à la notion que l’ADN donneur devient incorporé dans une fourche de réplication croissante dans le cadre du mécanisme d’action du gène édition, vrai indépendamment de savoir si une pause bicaténaire est présente ou pas19. Ainsi, la correction d’une mutation ponctuelle ou le remplacement d’un segment d’ADN dans les chromosomes s’effectue via un appariement d’ADN et la voie d’assimilation monocaténaire.
Induire des cassures de l’ADN double-brin aléatoires dans la croissance des cellules avec des agents de petit-molécule crée un environnement dans lequel les événements de réplication de l’ADN sont au point mort comme la cellule tente de réparer le dommage20,21. Ce ralentissement transitoire de la fourche de réplication permet une pénétration plus efficace de la structure de la chromatine par oligonucléotides édition simple brin, amélioration de l’accessibilité de cibles15. La création d’ADN bicaténaire pénètre par effraction par les drogues comme le VP16, bléomycine, ou camptothécine22,23, a été montré pour stimuler le gène édition niveaux de près de 10 fois, jusqu'à 6-8 %. Cependant, les cassures de l’ADN double-brin aléatoires sont indésirables dans un cadre thérapeutique.
Gène édition avec les oligonucléotides et nucléases programmables est également stimulé pendant la division cellulaire24,25. Lorsque livraison à base d’acide nucléique servait à réparation axés sur l’homologie dans les cellules HCT 116 synchrones, Rivera-Torres et ses collègues ont démontré l’augmentation même de cibler l’activité lorsque nucléases effecteur comme activateur de transcription (TAPS) travaillaient avec des oligonucléotides monocaténaires, tous deux introduits dans une réplication cellulaire population26,27 . Plus récemment, blavette et ses collègues ont montré que la réparation de simples mutations de base avec des oligonucléotides monocaténaires et un tableau de groupés régulièrement dois‑je courtes palindromes répétitions Cas9 (CRISPR/Cas9) molécules se déroule avec une efficacité plus élevée Quand la population cellulaire parcourt S phase28. La molécule CRISPR est composée d’ARN et de fonctions pour identifier la zone au sein de l’objectif de la séquence d’ADN qui est désigné pour le clivage. Cas9 est une enzyme bactérienne dont la fonction est de cliver l’ADN bicaténaire dans une réaction d’échange nucléolytiques. Ainsi, CRISPR positionne le complexe sur la cible de la génomique et la nucléase Cas9 exécute la cassure double brin. Lin et al. (2014) a également démontré l’importance du cycle cellulaire pour la réalisation des hautes fréquences du gène édition, en utilisant un système livraison induite par le complexe de ribonulceoprotien (RNP) de CRISPR/Cas9 modifié dans les fibroblastes néonatales primaires, les cellules souches embryonnaires humaines, et autres lignes de cellules24. Ainsi, la relation établie entre l’édition de gène et de progression du cycle cellulaire pour l’édition de gène de la monothérapie est applicable aux combinatoire gène édition utilisant des nucléases programmables et matrices d’ADN donneur. Alors que l’approche combinatoire de gène édition a rassemblé divers partenaires avec la matrice d’ADN de donateurs, la plupart des travailleurs dans le domaine utilisent CRISPR/Cas9 pour fournir la fonction pause bicaténaire. Ce choix repose sur la facilité d’utilisation de cet outil génétique particulière et la flexibilité avec laquelle il peut être utilisé pour désactiver la fonction du gène ou pour introduire un fragment étranger d’ADN dans un site spécifique. La génération d’un masquage est techniquement plus facile par rapport à un remplacement de gènes, où l’incorporation de « correctes » ou normales des copies d’un gène dans le site de la maladie doit être effectuée avec précision. Un certain nombre de chercheurs est identifier et étudier l’utilisation de certains médicaments et réactifs qui permettent la correction des bases mutants et l’insertion de séquences génétiques normales dans la bonne position à des fréquences élevées,29.
Récemment, Rivera-Torres et al. 30 utilisée combinatoire gène édition, profitant de l’activité de saut double brin d’un système CRISPR/Cas9 spécialement conçu et les informations génétiques fournies par une matrice d’ADN du donneur oligonucléotides monocaténaires, pour réparer un mutation ponctuelle dans unseule copie du gène de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) intégrés dans les cellules HCT116. Les auteurs ont profité de cette lignée de cellules de modèle bien caractérisés pour évaluer la spécificité de clivage qui entourent le site cible. Les données révèlent que l’hétérogénéité à l’emplacement cible existe, surtout dans les cellules qui ne contiennent pas d’une mutation ponctuelle a été corrigée. Dans ce manuscrit, nous détailler et mettre l’accent sur la méthodologie utilisée par ces travailleurs d’examiner sur place hétérogénéité mutationnelle créée en éditant de gène CRISPR/Cas9.
Protocol
le protocole suivant implique de travailler avec des cellules mammaliennes ; familiarité avec la culture technique stérile/cellulaire devrait.
1. lignée cellulaire et des Conditions de Culture
- faire 500 mL de milieu de culture cellulaire HCT 116 : McCoy ' s 5 a modifié additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 2 mM de L-glutamine et la pénicilline de 1 % (c’est complet moyennement).
Remarque : La croissance HCT 116-19 cellules dans une fiole de T-75 ou T-175 avant la culture. Lorsque 90 % anastomosé, chaque fiole T-75 produira 8,4 x 10 6 cellules, à peu près cinq plaques de 10 cm, et chaque T-175 donneront 18,4 x 10 6 cellules, environ quinze plaques de 10 cm.
2. Récolte des cellules de la fiole
- aspirer à la moyenne, laver avec Dulbecco ' s Phosphate-Buffered Saline sans calcium et Inde (PBS) (10 mL pour T-75 ou 25 mL pour T-175) et aspirer. Trypsine
- Ajouter goutte à goutte dans le ballon à l’aide d’une pipette de 2 mL (2 mL pour T-175 ou 1 mL pour T-75). Placer la fiole dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO 2 pendant 5 min permettre les cellules à se détacher.
- Taper le ballon pour s’assurer que toutes les cellules sont délogés et puis étancher avec support complet de disperser sur toute la surface du ballon (8 mL pour T-175 ou 4 mL T-75).
- Pipette de monter et descendre plusieurs fois pour briser les agrégats cellulaires et transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL
- Avant de faire tourner les cellules vers le bas, prendre 10 µL de la 15 mL conique et combinez-le avec 10 µL de trypan blue pour compter les cellules. Les cellules de granule par rotation pendant 5 min à 125 x g et 16 ° C.
3. Compter les cellules
- transférer 10 µL de cellules mélangé avec le bleu à l’hémocytomètre trypan. Compter les 4 grilles autour de l’extérieur (chaque grille contient 16 places).
- Prendre le nombre moyen de cellules de chaque ensemble de seize carrés coin.
- Multiplier par 10 000 (10 4).
- Multiplier par le volume total du support utilisé pour récolter les cellules afin de corriger la dilution de l’ajout de bleu trypan.
Remarque : Le format de l’équation pour calculer le volume pour remettre en suspension les cellules suit :
4. Les cellules de placage
- pour chaque plaque de 10 cm de cellules que vous voulez synchroniser, ajouter 5 mL de milieu complet et 6 µM d’aphidicholin (12 µL d’un stock de 2,5 mM dans l’éthanol à l’épreuve du 200).
- Transférer 100 µL de remises en suspension cellulaire-pellet, 2,5 x 10 6 cellules, pour chaque plaque de 10 cm et agiter doucement pour mélanger.
- Incuber les plaques à 37 ° C et 5 % de CO 2 pendant 16 à 24 heures synchroniser des cellules à la frontière de G1/S.
5. Libérer les cellules de la synchronisation de l’aphidicoline
- 4 h avant le ciblage, aspirer le milieu, laver avec du PBS, aspirer le PBS et ajouter 5 mL de milieu complet
- Placez-le dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO 2 pendant 4 h
6. Complexants ARN
- Enter la séquence du gène mutant eGFP dans le laboratoire de Zhang ' s générateur en ligne 25 (http:// crispr.mit.edu/) et choisissez le guide CRISPR séquences qui se lient à proximité vers le site cible. Obtenir le guide CRISPR séquences provenant d’une source commerciale.
- Utilisez selon les suggestions du fabricant et conservez la RNA CRISPR (crRNA), activation de trans crRNA (tracrRNA) et des protéines de Cas9 à 20 ° C.
Tube
- Mix l’ARN en concentration équimolaire à 45 µM. Ajouter 6,75 µL d’un stock de 200 µM de crRNA et 6,75 µL d’un stock de 200 µM de tracrRNA d’une centrifugeuse de 1,5 mL. Ajouter 16.50 µL de tampon de TE faire un volume final de 30 µL.
- Chaleur à 95 ° C pendant 5 min dans un bloc chauffant ou une machine PCR.
ATTENTION : Chaud ! - Laisser refroidir à température ambiante.
Remarque : Si vous utilisez une machine PCR, régler le refroidissement à 0,2 ° C/s. - Effectuez les opérations suivantes pour chaque échantillon.
- 2.22 diluer µL de crRNA:tracrRNA complexe dans 2,78 µL de tampon TE (10 mM Tris, pH 8,0 et 0,1 mM EDTA ; pH 8,0) pour un volume final de 5 µL.
- 1.67 diluer µL de Cas9 protéine provenant d’un stock de 60 µM à 3,33 µL de sérum-faible moyen pour un volume final de 5 µL.
- Mix 5 µL de Cas9 protéine 5 µl d’ARN complexé
7. Les cellules de récolte pour le ciblage
- aspirer le milieu, laver avec 5 mL de PBS, aspirer le PBS et ajouter 1 mL de trypsine préchauffée dans chaque plaque de 10cm. Mettre les plaques dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO 2 pendant 5 min.
- Appuyez sur la plaque de 10 cm pour s’assurer que toutes les cellules sont délogés et puis étancher avec 4 mL de milieu complet de disperser sur toute la surface de la plaque.
- Pipette de monter et descendre plusieurs fois pour briser les agrégats cellulaires et transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL.
- Avant de faire tourner les cellules vers le bas, prendre 10 µL du tube 15 mL conique et combinez-le avec 10 µL de trypan blue pour compter les cellules. Les cellules de granule par rotation pendant 5 min à 125 x g et à température ambiante.
- Aspirer le milieu et laver avec 5 mL de PBS. Les cellules de granule de filature à 125 x g pendant 5 min à température ambiante.
8. Compter les cellules
- transférer 10 µL de cellules mélangé avec le bleu à l’hémocytomètre trypan. Compter les 4 grilles autour de l’extérieur (chaque grille contient seize carrés).
- Prendre le nombre moyen de cellules de chaque ensemble de seize carrés coin.
- Multiplier par 10 000 (10 4).
- Multiplier par le volume total du support utilisé pour récolter les cellules afin de corriger la dilution de l’ajout de bleu trypan.
NOTE : Voici le format de l’équation pour calculer le volume pour remettre en suspension les cellules. Remettre en suspension le nombre requis de cellules sans sérum McCoy ' milieu modifié de 5 a s.
9. ciblage des échantillons
- transfert 100 µL de la suspension de cellules (5 x 10 5 cellules) de l’étape 8.1 à chaque cuvette de 4 mm écart d’électroporation. Ajouter 10 µL de RNP complexe d’étape 6,7 à 100 µL de cellules à une densité cellulaire de 5 x 10, 5. Ajouter ODN (2 µM) pour chaque échantillon.
Remarque : Pour un contrôle positif, ajouter 1 µL d’eGFP à 1 µg/µL exprimant le plasmide- prendre la grille à une machine d’électroporation, légèrement effleurer chaque échantillon et placez-les dans la chambre. Oligonucléotides à 250 V, LV ; 2 impulsions, 1 s ; 13 ms ; impulsion unipolaire.
- Transférer le support à la hotte. Transférer chaque échantillon dans un bien contenant 2 mL de milieu complet j’ain une plaque 6 puits. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO 2 pendant 72 h avant de vérifier les niveaux de correction.
10. Analyse du gène modifié des cellules et l’efficacité de Transfection
- aspirer le milieu et laver les cellules avec 2 mL de PBS. Aspirer le PBS et ajouter 500 µL de trypsine préchauffée à chaque puits de la plaque 6 puits. Mettre les plaques dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO 2 pendant 5 min.
- Taper la plaque pour s’assurer que toutes les cellules sont délogés et étancher puis 1 ml de milieu complet de disperser sur toute la surface du puits.
- Passer les cellules dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et pellet à 5 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirer le milieu. Resuspendre le culot dans 500 µL de tampon de FACS (0,5 % de BSA, EDTA de 2 mM et l’iodure de propidium 2 µg/mL dans du PBS).
- Mesurer la fluorescence de la cellule (eGFP +) par cytométrie en flux.
- Calculez le rendement de correction sous forme de pourcentage des cellules eGFP positif direct totales sur le nombre total de cellules vivantes dans chaque échantillon, à Rivera Torres et coll. 30.
11. Analyse de séquences d’ADN
- Electroporate le HCT synchronisé et libéré 116-19 cellules à une concentration de 5 x 10 5 cellules/100 µL, avec RNP complexe à 100 pmols et 72NT ODN à 2,0 µM.
- Les cellules à plaques 6 puits de transfert et de leur permettre de récupérer pendant 72 h.
- Trier les cellules individuellement dans des plaques à 96 puits à l’aide d’un trieur de FACS avec un laser à 488 nm (100 mw) pour eGFP +/-, comme décrit dans Rivera-Torres et coll. 30.
Remarque : Pas tous les puits seront développera avec succès. - Étendre les cellules plus de 6 semaines et récolte tel que décrit à l’étape 7.
- Des puits qui ont une croissance, isoler ADNg cellulaire à l’aide d’un isolement d’ADN disponible dans le commerce nécessaire (voir la Table des matières) et amplifier la région qui entoure la cible de base par PCR (718 bp ; avant apprêt 5 '- ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ' et inverser l’apprêt 5 ' - ACTTGTACAGCTCGTCCATGC - 3 ').
- Analyse de séquençage ADN à effectuer sur les échantillons.
Representative Results
Nous avons utilisé un système modèle pour étudier l’édition de gène dans les cellules de mammifères, qui repose sur la correction d’une mutation ponctuelle dans le gène eGFP intégré en tant qu’un seul exemplaire dans les cellules HCT116. Il est important de noter qu’il s’agit d’un simple copie gène ; ainsi, une vue moins compliquée d’altérations de l’ADN ou de mutagenèse sont possibles. Figure 1 a affiche la séquence du gène mutant eGFP avec la base ciblée, la troisième base du codon stop TAG, surligné en rouge. L’oligonucléotide 72-base, qui est partiellement complémentaires pour le brin non-transcrit du gène eGFP (72NT) et est conçu pour induire l’échange de base entre un G et un C, est aussi illustrée. En outre, un CRISPR, désigné comme 2C, avec la séquence protospacer indiquée dans un 5'-3' orientation, est également représenté dans la Figure 1 a. Pour effectuer cette réaction de gène-édition, nous avons utilisé une ribonucléoprotéine (RNP) consistant en la CRISPR RNA (cr) et l’ARN tracr (tr) couplés à la protéine purifiée de Cas9 (Figure 1 b), au lieu d’utiliser un vecteur d’expression de mammifères comprenant le gène Cas9 et le guide spécifique approprié séquence d’ARN.
Quand la particule de RNP spécialement conçue est livrée avec les oligonucléotides monocaténaires en cellules HCT116 par électroporation, gène édition, témoigne de la réparation de la base seule mutation dans eGFP, est observée après 72 h d’incubation à l’aide d’un flux cytomètre. Réparation fonctionnelle est observable par l’émergence de la fluorescence verte dans les cellules ciblées, qui peuvent également être séparés de l’ensemble de la population par un tri à cause de cette fluorescence. Comme illustré à la Figure 2, une réponse progressive de dose peut considérer comme les niveaux coordonnés d’augmentation RNP et 72NT. Le rapport moléculaire, picomoles de RNP et micromolaire concentration de le 72NT comme indiqué dans la figure, reposent sur des dosages optimales utilisés dans les réactions édition de gène qui dépendent de l’introduction de Cas9 et guide spécifique RNA d’expression transfectée vecteurs. L’encart dans la Figure 2 affiche une réaction de gène-montage effectuée en l’absence de la particule RNP. Ici, environ 1 % des cellules ciblées sont corrigées lorsqu’une concentration 10 fois plus élevée de l’oligonucléotide 72NT est utilisée dans la réaction de gène-édition de monothérapie.
Afin de déterminer si une hétérogénéité génétique existe à l’effet de mutagenèse sur place ce qu’on appelle le site cible-nous avons décidé d’examiner les résultats du gène édition activité dans des cellules individuelles. Bien que beaucoup plus laborieux que d’examiner l’ensemble de la population, une vraie mesure des empreintes génétiques ou de lésions peut être déterminée lorsque le génome des cellules par clonage élargis est examiné. Nous avons réitéré l’expérience décrite à la Figure 2, cette fois en utilisant uniquement 100 pmol de RNP complexe et 2,0 µmol de l’oligonucléotide 72NT. Comme ci-dessus, HCT 116 cellules ont été synchronisés pendant 24 h avec aphidicholine et arrêtés à la frontière de G1/S. 4 h plus tard, les cellules ont été libérés et les outils d’édition de gènes ont été introduits par électroporation. 72 h plus tard, les cellules ont été analysées à l’aide de FACS et classées individuellement en plaques à 96 puits (le processus expérimental est illustré à la Figure 3). Cellules affichant une fluorescence verte ont été triés par cytométrie en flux dans chaque puits d’une plaque de 96 puits pour expansion clonale. Ce qui est important, cellules dépourvues d’expression eGFP ont été également isolées et triés de façon similaire pour l’expansion dans les mêmes conditions.
Après 14 jours de croissance, la plupart des clones individuels s’était étendue suffisamment pour permettre l’isolement d’ADN. Ainsi, 16 clones des échantillons positifs eGFP ont été sélectionnés, et l’intégrité génétique qui entourent le site cible a été analysée par séquençage de l’ADN. Informations entourant la séquence d’ADN des allèles au sein de la population a été générées à l’aide de Sanger sequencing, assemblés à l’aide de logiciel de visualisation de séquence pour comparer la séquence d’un allèle de type sauvage (Figure 4 a). Le site Coupe du complexe RNP est indiqué par une flèche noire, située sur la barre (2C crRNA) verte. Comme également indiqué dans la Figure 4 a, tous les 16 eGFP positive cellules contiennent l’échange de nucléotide prévue sur le site cible. Le résidu C converti est surligné en rouge, et le profil de pointe reflétant ce changement précis est fourni sous la séquence eGFP séropositifs. De manière similaire, 15 non-vert clonale isole, suffisamment étendu pour permettre l’extraction d’ADN et séquençage, ont été analysés pour l’hétérogénéité à l’emplacement cible. Comme l’avait prédit, dans environ la moitié des échantillons, sans échange de base d’ADN a été observée. Cela se reflète dans le maintien du résidu G sur le site cible, comme illustré à la Figure 4 b. Le reste de l’expansion clonale examinés dans ces expériences affiche une population hétérogène des mutations de délétion, représente donc l’absence de fluorescence verte. La taille de la délétion varie entre une base et 19 bases. Il est important de noter que nous avons examiné seulement 15 échantillons des cellules eGFP séropositifs, et alors que nous pensons que c’est tout à fait représentatif du type de lésions génétiques laissées par activité CRISPR/Cas9, il est possible que d’autres types ou formes d’indels pouvant être présentes dans la population ciblée.
Pris ensemble, les résultats affichés dans la Figure 4 confirment la lecture phénotypique dans l’eGFP système de ciblage. Conversion du G au nucléotide C permet l’émergence de la fluorescence verte dans les cellules HCT116 corrigées. Aucune substitution de base entourant le site de la cible n’a été observée chez les clones isolés pendant cette expérience ou dans précédentes expériences27,28. Les données montrent également que les cellules ne pas subir une gène édition via réparation de mutation ponctuelle demeurent non corrigé, mais, dans certains cas, ne pas telles quelles, avec un éventail d’hétérogénéité génétique qui entourent le site cible.
Figure 1. (A) système de modèle pour le montage de gène du gène mutant eGFP. Les segments appropriés du type sauvage et gène muté eGFP avec le codon ciblé, situé dans le centre de la séquence, sont affichent en vert et rouge, respectivement. Le nucléotide destiné à un échange apparaît en caractères gras et soulignés. Fonde l’en surbrillance en bleu représentent la séquence de protospacer CRISPR 2C, et les bases orange mettre en valeur le site de PAM. L’oligonucléotide utilisée dans ces expériences est 72 bases de longueur, portant des liens phosphorothioate modifiée aux trois bases de connexion ; le 72-mer cible le brin non-transcrit de (NT) (72NT). (B) CRISPR/Cas9réaction de ribonucléoprotéine de l’Assemblée. crRNA fournit la spécificité de cible (section 20 bases, rouge) correspondant à la séquence de protospacer 2C et un domaine d’interaction (bleu) avec le tracrRNA (vert). crRNA et tracrRNA sont recuits en concentration équimolaire. Protéine Cas9 (gris) est ajouté pour compléter l’assemblage du RNP. ARN Guide (gRNAs) direct et activer l’endonucléase Cas9, qui clivent ensuite l’ADN cible. La partie inférieure de la figure montre la séquence de graine de 2C et la séquence tracrRNA. Ce chiffre a été modifié de Rivera-Torres, N. et al. (2017). s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Gène d’édition est dose-dépendante lorsque réalisé par le RNP et le ssODN. Synchronisé et libéré HCT 116-19 cellules étaient électroporation avec 24-120 pmol de CRISPR/Cas9 RNP et 0,6 à 3,0 µM de 72mer. Après une période de 72 h de récupération, activité édition de gène a été mesurée à l’aide d’un cytomètre en flux. Gène d’édition s’affiche comme l’efficacité de la correction (%), déterminée par le nombre de cellules viables d’eGFP positif divisé par le nombre total de cellules viables dans la population. Barres d’erreur sont issus de trois séries de points de données générées au cours de trois expériences distinctes à l’aide de calculs de base de l’écart-type. Médaillon : monothérapie gène édition. Activité de gène-montage réalisée par les oligonucléotides monocaténaires (72NT) en l’absence de la RNP complexe dans des conditions identiques est présentée en fonction de l’augmentation de la concentration. Ce chiffre a été modifié de Rivera-Torres, N. et al. (2017). s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Une stratégie expérimentale pour l’isolement des clones monocellulaires. Cellules exhibant expression eGFP ont été marqués comme positifs et triée à l’aide un cytomètre en flux comme cellules individuelles dans les puits individuels pour expansion clonale. Cellules dépourvues d’expression eGFP ont été isolés et triés de façon similaire et étendus dans les mêmes conditions. L’ADN est ensuite isolé et le gène eGFP a été amplifié et soumis à Sanger séquençage d’analyser l’activité d’édition de gène qui entourent le site cible. Ce chiffre a été modifié de Rivera-Torres, N. et al. (2017). s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. (A) allélique analyse de cellules positives eGFP étendue comme une population clonale. Par clonage isolé et élargis eGFP séropositifs échantillons (seize clones) ont été analysées sur le site entourant la base ciblé et l’ADN de chacun, récoltés, purifiés, amplifiés et séquencés. Allélique analyse a été réalisée à l’aide de Sanger sequencing, assemblés à l’aide du logiciel de visualisation de séquence et par rapport à la séquence d’un allèle de type sauvage, ce qui est illustré dans la partie supérieure de la figure. Le site Coupe du complexe RNP est indiqué par une petite flèche noire située sur la barre (2C crRNA) verte. (B) Analyse allélique des cellules négatives eGFP élargi comme une population clonale. Quinze échantillons individuels, élargis des clones provenant de la population non corrigée, ont été aléatoirement sélectionnés et analysés pour indel formation au site entourant le nucléotide de la cible. Comme ci-dessus, allélique analyse a été réalisée à l’aide de Sanger sequencing et assemblés à l’aide d’un logiciel de visualisation de séquence. Une fois de plus, la séquence d’un allèle de type sauvage en haut de la figure, ainsi que le site coupé de la RNP, sont présentés. Ce chiffre a été modifié de Rivera-Torres, N. et al. (2017). s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Gène d’édition est devenue une discipline scientifique grand public principalement en raison de l’émergence du système CRISPR/Cas9. Ce sentier remarquable, ce qui facilite l’immunité adoptif dans des cellules bactériennes, a été réaffecté comme un outil moléculaire pour permettre des altérations génomiques dans les chromosomes humains. La fonction naturelle des CRISPR/Cas9 consiste à désactiver l’ADN viral en introduisant des cassures de l’ADN double-brin menant à fragmentation30,31. Cette activité se traduit par la destruction de l’invasion de l’ADN exogène et conduit à immunité procaryote qui supprime une infection ultérieure par la même particule virale. Étonnamment, ce système présente un comportement pneumonique, en ce qu’il peut se réactiver spécifiques CRISPR gRNA créée par les événements précédents de l’infection.
L’efficacité et la précision de la perturbation de gène catalysée par CRISPR/Cas9 a été utilisé dans de nombreux systèmes génétiques eucaryotes dont l’objectif était de désactiver un fonctionnement génique32,33. Lorsque réduite à son niveau basal, le processus se compose de deux étapes fondamentales. Le premier est un saut double-brin, tandis que le second s’appuie sur le processus inhérent de fin non homologue rejoindre (NHEJ) pour compléter la partie détachable. Dans la plupart des cas, les résultats de double-brin pause dans la création d’émoussé-terminée, débrayage de segments chromosomiques et enzymes impliquées dans la NHEJ réagissent à la cassure chromosomique et agissent pour se conjuguent les extrémités brisées. Ce processus peut parfois impliquer la perte de nucléotides individuels sur le site dissociée. La perte de même quelques bases peut provoquer un changement de phase, et cesse d’expression fonctionnelle. L’utilisation de CRISPR/Cas9 pour créer masquage génétique en engageant le processus naturel de NHEJ a révolutionné la génétique eucaryote ; la perte de l’ADN sur le site cible est prévisible et attendue.
À la différence de knock-out du gène, un certain nombre de chercheurs se sont engagé pour tenter de rediriger et de réutiliser une activité CRISPR/Cas9 envers le processus de réparation axés sur l’homologie. Le but des études est correction génique. Dans cette stratégie, CRISPR/Cas9 est combinée avec une matrice d’ADN de donateurs qui fournit de l’information génétique de réparer une erreur innée ou d’insérer des mutations dans des gènes sains. Les premiers rapports mettant en évidence la capacité remarquable de CRISPR/Cas9 pour catalyser axés sur l’homologie de réparation indiquent (directement ou indirectement) que le processus s’est produite dans un mode très précis24,34. Notre laboratoire étudie axés sur l’homologie de réparation ou de correction de gène en utilisant des oligonucléotides monocaténaires pour tenter de définir le mécanisme et les circuits réglementaires qui l’entourent15,17,18 ,,23. Nous nous sommes concentrés principalement sur le gène édition mutations uniques, car il s’agit de la plus simple mutation génétique connue pour être responsable de nombreuses maladies héréditaires. Nos connaissances fondamentales de la modification génétique nous a conduit à remettre en question la précision de l’activité CRISPR/Cas9 dans ces réactions, depuis la fonction CRISPR/Cas9 dans les résultats de knock-out du gène dans la formation des indels. Nous avons utilisé un système modèle bien défini, et non un gène non sélectionnable encore cliniquement pertinent, pour étudier la mutagenèse sur place dans un mode décidément réductionniste. En utilisant un gène cible simple, sur quel gène correction peut être mesurée aux niveaux génotypiques et phénotypiques, nous avons pensé que l’hétérogénéité qui se produisent sur le site cible pouvait être identifiée de manière fiable et robuste.
Nos résultats confirment que le gène bien établi, système de montage, consistant en un mutant eGFP gène intégré dans les cellules HCT116, peut fournir des informations fondamentales en ce qui concerne la génération des lésions génétiques et du processus de mutagenèse sur place. Molécules d’ADN donneur oligonucléotide CRISPR/Cas9 et simple brin travaillant en tandem peuvent entraîner la réparation précise de la mutation ponctuelle dans le gène eGFP. Nous vous proposons un nouveau modèle pour la réparation des mutations ponctuelles, une voie moléculaire dans laquelle l’ADN du donneur agit comme un modèle de réplication pour la réparation de la base de mutant, un processus que nous avons appelé exacte30. La population ciblée, ne montrait le phénotype corrigé, affiche une variété de cellules contenant hétérogènes et allant largement ADN indels entourant le site cible. Dans environ la moitié des clones isolés de la population non corrigée, mutagénèse de suppression a été observée sur le site cible. Puisque aucun précédent rapport n’a indiqué que les oligonucléotides monocaténaires agissant en tant qu’outils d’édition gène monothérapie peuvent induire des indels sur le site cible, nous concluons que l’activité CRISPR/Cas9 est responsable de ces mutations.
Dans ce manuscrit, nous proposons une méthodologie détaillée afin que l’hétérogénéité génétique sur le site cible peut être mesurée de façon fiable et robuste. Tandis qu’énormément d’attention a été accordée à l’analyse et cartographie de mutagenèse hors site, il est probable qu’une mutation hétérogène créés à l’emplacement de la cible aura un effet plus important sur la réussite ou l’échec du gène d’édition dans le domaine clinique. Technologies complémentaires ou protéines Cas9 modifiées peuvent être nécessaires pour améliorer la précision de la réparation axés sur l’homologie des erreurs innées dans les cellules de mammifères,35. Certaines de ces technologies incluent l’utilisation des oligonucléotides auxiliaires d’agir comme un pont, tenant les extrémités chromosomiques ensemble et d’éviter l’action destructrice des NHEJ. Définir le degré d’hétérogénéité du site de la cible en raison de l’activité édition de gène est et doit être un élément important de tout protocole conçu pour une intervention thérapeutique.
Disclosures
Les auteurs n’ayant rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs n’ont aucuns accusés de réception.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy’s 5A Modified medium | ATCC | 30-2007 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
| L-glutamine | ATCC | 30-2214 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | ATCC | 30-2300 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ATCC | 30-2200 | No Calcium or magnesium |
| Trypsin EDTA Solution | ATCC | 30-2101 | |
| Aphidicolin 1mg | Thermo Fisher | AC611970010 | |
| Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol | IDT | No catalog number since its made to your specific gene target. | |
| CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol | IDT | 1072533 | |
| S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg | IDT | 1074182 | |
| IDTE Buffer | IDT | 11-01-03-01 | |
| Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm | VWR | 10497-474 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporation Systems | BioRad | 1652660 | |
| Bovine serum albumin lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE) |
Sigma | 05470-1G | |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | AM9260G | |
| Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69581 | |
| 6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates | VWR | 10062-892 | |
| Petri Dishes | Fisher | 12-565-90 | |
| Conical Tubes (15 mL) (racked) | Thermo Fisher | AM12500 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
References
- Mandecki, W. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci. 83 (19), 7177-7181 (1986).
- Walder, R. Y., Walder, J. A. Oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis using the yeast transformation system. Gene. 42 (2), 133-139 (1986).
- Moerschell, R. P., Tsunasawa, S., Sherman, F. Transformation of yeast with synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci. 85 (2), 524-528 (1988).
- Yoon, K., Cole-Strauss, A., Kmiec, E. B. Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNADNA oligonucleotide. Genetics. 93, 2071-2076 (1996).
- Beetham, P. R., Kipp, P. B., Sawycky, X. L., Arntzen, C. J., May, G. D. A tool for functional plant genomics: chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-specific mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8774-8778 (1999).
- Bertoni, C., Morris, G. E., Rando, T. A. Strand bias in oligonucleotide-mediated dystrophin gene editing. Hum Mol Gen. 14 (2), 221-233 (2004).
- Alexeev, V., Yoon, K. Stable and inheritable changes in genotype and phenotype of albino melanocytes induced by an RNA-DNA oligonucleotide. Nat Biotechnol. 16 (13), 1343-1346 (1998).
- Zorin, B., Hegemann, P., Sizova, I. Nuclear-gene targeting by using single-stranded DNA avoids illegitimate DNA integration in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot Cell. 4 (7), 1264-1272 (2005).
- Brachman, E. E., Kmiec, E. B. DNA replication and transcription direct a DNA strand bias in the process of targeted gene repair in mammalian cells. J Cell Sci. 117 (Pt 17), 3867-3874 (2004).
- Pierce, E. A., et al. Oligonucleotide-directed single-base DNA alterations in mouse embryonic stem cells. Gene Ther. 10 (1), 24-33 (2003).
- Radecke, S., Radecke, F., Peter, I., Schwarz, K. Physical incorporation of a single-stranded oligodeoxynucleotide during targeted repair of a human chromosomal locus. J Gene Med. 8 (2), 217-228 (2006).
- Bertoni, C., Rustagi, A., Rando, T. A. Enhanced gene repair mediated by methyl-CpG-modified single-stranded oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7468-7482 (2009).
- Andrieu-Soler, C., et al. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33 (12), 3733-3742 (2005).
- Olsen, P. A., Randol, M., Krauss, S. Implications of cell cycle progression on functional sequence correction by short single-stranded DNA oligonucleotides. Gene Ther. 12 (6), 546-551 (2005).
- Engstrom, J. U., Kmiec, E. B. DNA replication, cell cycle progression and the targeted gene repair reaction. Cell Cycle. 7 (10), 1402-1414 (2008).
- Aarts, M., te Riele, H. Parameters of oligonucleotide-mediated gene modification in mouse ES cells. J Cell Mol Med. 14 (6b), 1657-1667 (2010).
- Brachman, E. E., Kmiec, E. B. Gene repair in mammalian cells is stimulated by the elongation of S phase and transient stalling of replication forks. DNA Repair. 4 (4), 445-457 (2005).
- Engstrom, J. U., Suzuki, T., Kmiec, E. B. Regulation of targeted gene repair by intrinsic cellular processes. BioEssays. 31 (2), 159-168 (2009).
- Parekh-Olmedo, H., Ferrara, L., Brachman, E., Kmiec, E. B. Gene therapy progress and prospects: targeted gene repair. Gene Ther. 12 (8), 639-646 (2005).
- Olsen, P. A., Randol, M., Luna, L., Brown, T., Krauss, S. Genomic sequence correction by single-stranded DNA oligonucleotides: role of DNA synthesis and chemical modifications of the oligonucleotide ends. J Gene Med. 7 (12), 1534-1544 (2005).
- Wang, Z., Zhou, Z. -J., Liu, D. -P., Huang, J. -D. Double-stranded break can be repaired by single-stranded oligonucleotides via the ATM/ATR pathway in mammalian cells. Oligonucleotides. 18 (1), 21-32 (2008).
- Ferrara, L., Kmiec, E. B. Camptothecin enhances the frequency of oligonucleotide-directed gene repair in mammalian cells by inducing DNA damage and activating homologous recombination. Nucleic Acids Res. 32 (17), 5239-5248 (2004).
- Ferrara, L., Parekh-Olmedo, H., Kmiec, E. B. Enhanced oligonucleotide-directed gene targeting in mammalian cells following treatment with DNA damaging agents. Exp Cell Res. 300 (1), 170-179 (2004).
- Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
- Rivera-Torres, N., et al. The position of DNA cleavage by TALENs and cell synchronization influences the frequency of gene editing directed by single-stranded oligonucleotides. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Strouse, B., Bialk, P., Niamat, R. a, Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. Combinatorial gene editing in mammalian cells using ssODNs and TALENs. Sci Rep. 4 (ii), 3791 (2014).
- Bialk, P., Rivera-Torres, N., Strouse, B., Kmiec, E. B. Regulation of Gene Editing Activity Directed by Single-Stranded Oligonucleotides and CRISPR/Cas9 Systems. PloS One. 10 (6), e0129308 (2015).
- Yu, C., et al. Small Molecules Enhance CRISPR Genome Editing in Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 16 (2), 142-147 (2015).
- Rivera-Torres, N., Banas, K., Bialk, P., Bloh, K. M., Kmiec, E. B. Insertional Mutagenesis by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Gene Editing in Cells Targeted for Point Mutation Repair Directed by Short Single-Stranded DNA Oligonucleotides. PLoS One. 12 (1), e0169350 (2017).
- Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 31 (9), 833-838 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
