Summary
Dit protocol beschrijft de workflow van een CRISPR/Cas9 gebaseerde gen bewerken systeem voor de reparatie van puntmutaties in zoogdiercellen. Hier, gebruiken wij een combinatorische benadering voor het gen bewerken met een gedetailleerde opvolgzuigelingenvoeding experimentele strategie voor het meten van indel vorming op de doelsite — Kortom, het analyseren van on-site mutagenese.
Abstract
Combinatorische gene bewerken met behulp van CRISPR/Cas9 en single-stranded oligonucleotides is een effectieve strategie voor de correctie van single-base puntmutaties, die vaak verantwoordelijk voor allerlei menselijke erfelijke aandoeningen zijn. Met behulp van een reeds lang gevestigde van cel-gebaseerde modelsysteem, is het punt mutatie van een gen van de single-kopie mutant eGFP geïntegreerd in de HCT116 cellen gerepareerd met behulp van deze combinatorische aanpak. De analyse van gecorrigeerd en ongecorrigeerd cellen blijkt zowel de precisie van het gen bewerken en de ontwikkeling van genetische laesies, wanneer microdeleties worden gemaakt in niet-gecorrigeerde cellen in de opeenvolging van DNA, rond de doelsite. Hier, wordt de specifieke methoden gebruikt voor het analyseren van deze combinatorische benadering van het gen bewerken van een punt mutatie, in combinatie met een gedetailleerde experimentele strategie te meten indel vorming op de doelsite, geschetst. Dit protocol beschrijft een fundamentele aanpak en workflow voor onderzoek gericht op het ontwikkelen van CRISPR/Cas9 gebaseerde gene bewerken voor menselijke therapie. De conclusie van dit werk is dat on-site mutagenese plaatsvindt als gevolg van CRISPR/Cas9 activiteit tijdens het proces van punt mutatie reparatie. Dit werk zet in plaats van een gestandaardiseerde methodologie ter identificatie van de mate van mutagenese, die een belangrijke en kritische aspect van een benadering die bestemd zijn voor klinische toepassing moet.
Introduction
Baanbrekende studies van Mandecki (1986) blijkt permanente veranderingen in plasmide DNA oligonucleotides omgevormd tot bacteriën1, terwijl Walder en Walder (1986) soortgelijke studies in gist2uitgevoerde gebruiken. Kort daarna, publiceerde Sherman en collega's een reeks documenten die single-stranded oligonucleotides gistcellen om erfelijke veranderingen in genen3werden binnengebracht. Voortbouwend op de baanbrekende werk in microbiële cellen, begon Kmiec en collega's te ontwikkelen unieke single-agent oligonucleotides dat één basis reparatie in zoogdiercellen4gericht. Dit concept was gebaseerd op biochemische gegevens waaruit bleek dat de moleculen RNA met meer strak naar de doelsite dan die bestaan geheel uit DNA-basen binden. Hoewel er talrijke rapporten bewerken van gene succes met behulp van chimeer oligonucleotides5,6,7, bleef de editing niveaus zeer variabel tussen experimenten en over verschillende doelcel / combinaties.
Single-stranded donor DNA is aangenamer zijn wanneer u donor van de double-stranded DNA omdat het minder waarschijnlijk te integreren op willekeurige sites binnen het genoom8is. Exogenously geïntroduceerde single-stranded oligonucleotides zijn echter gevoelig voor snelle afbraak door cellulaire nucleasen. Verschillende strategieën aan de termini van oligonucleotides behoeden voor degradatie zijn tewerkgesteld. Een exonuclease-beschermd, single-stranded DNA met de gewenste volgorde was voldoende om het verkrijgen van een editing-efficiëntie in de 0,1-1% bereik6. Verbeterd en meer consistente transfectie technieken, in combinatie met fenotypische uitlezingen, waarbinnen meer consistente bewerken door meerdere onderzoek groepen8,9,10,11, 12,,13.
In de afgelopen 10 jaar, is er een aanzienlijke inspanning om de doelcellen meer vatbaar voor gene bewerken. Een strategie maakt gebruik van de modulatie van de celcyclus14,15,16. Terwijl editing frequenties onder normale omstandigheden met single-stranded oligonucleotides (ssODNs) ingevoerd in zweefde gekweekte zoogdiercellen tussen 0,1% en 1%, de frequenties van gen bewerken verhoogde 3 - tot 5 keer wanneer de oligonucleotides cellen werden binnengebracht tijdens hun overgang via de S-fase. In een aparte reeks experimenten blijkt Brachman en Kmiec (2005) dat de relatief hoge niveaus van precieze gen bewerken (3-5%) werden verkregen wanneer 2'3 ' dideoxycytosine (ddC) was geïncubeerd in cellen gedurende 24 uur voordat het prestatiemeteritembestand van de oligonucleotide17 . ddC verlaagt het aantal DNA replicatie vork beweging, suggereren dat gene bewerken door ssODNs bij het repliceren van cellen waarschijnlijk gaat om de opneming van ODNs in regio's van de actieve replicatie11,18. Samen genomen, deze studies geleid tot het concept dat donor DNA wordt opgenomen in een groeiende replicatie (DNA) als onderdeel van de ware werkingsmechanisme van gene bewerken, onafhankelijk van of een double-stranded pauze is aanwezig of niet19. Dus, de correctie van een mutatie van de punt of de vervanging van een segment van DNA in de chromosomen optreedt via een DNA in paren rangschikken en single-strand assimilatie traject.
Willekeurige double-stranded DNA-einden in het kweken van cellen met kleine-molecuul agenten inducerende creëert een omgeving waarin DNA replicatiegebeurtenissen zijn vastgelopen als de cel probeert te herstellen van de schade20,21. Deze tijdelijke vertraging van de replicatie vorken maakt een efficiëntere penetratie van de structuur van de chromatine door single-stranded bewerken oligonucleotides, verbetering van de doel toegankelijkheid15. De oprichting van double-stranded DNA breekt door drugs zoals VP16, bleomycine, of camptothecine22,23, is aangetoond dat het stimuleren van gene schrijven validatieniveaus door bijna 10-fold, maximaal 6-8%. Willekeurige double-stranded DNA-einden zijn echter ongewenste in een therapeutische setting.
Gene bewerken met programmeerbare nucleasen en oligonucleotides wordt ook gestimuleerd tijdens de celdeling24,25. Toen nucleïnezuur gebaseerde levering werd gebruikt voor het verrichten van reparatie homologie-geregisseerd in gesynchroniseerde HCT 116 cellen, Rivera-Torres- en collega's aangetoond de dezelfde toename van de activiteit richten wanneer transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALENs) werkten met single-stranded oligonucleotides, beide opgenomen in een replicerende cel bevolking26,27 . Meer recent, Bialk en collega's bleek dat de reparatie van enkele basis mutaties met single-stranded oligonucleotides en een scala aan regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt Cas9 geclusterd (CRISPR/Cas9) moleculen plaatsvindt met grotere werkzaamheid Wanneer is de celpopulatie S fase28doorlopen. Het CRISPR molecuul bestaat uit RNA en functies te identificeren van de regio binnen het doeldocument DNA-sequentie dat bestemd is voor decollete. Cas9 is een bacteriële enzym waarvan de functie is te klieven double-stranded DNA in een nucleolytic uitwisseling reactie. Dus, CRISPR posities het complex op de genomic doelgroep, en Cas9 nuclease voert de double-stranded pauze. Lin et al. (2014) ook blijk gegeven van het belang van de celcyclus voor het bereiken van hoge frequenties van gen bewerken, met behulp van een gemodificeerde CRISPR/Cas9 ribonulceoprotien (RNP) complex-gemedieerde expresbezorgingssysteem in primaire neonatale fibroblasten, menselijke embryonale stamcellen, en andere cel lijnen24. Dus, is de relatie tussen gene bewerken en celcyclus voor het bewerken van de single-agent gene geldt voor combinatorische gene bewerken met behulp van programmeerbare nucleasen en donor DNA sjablonen. Terwijl de combinatorische benadering voor het bewerken van gene een scala aan partners met de donor DNA sjabloon samengebracht heeft, gebruiken de meeste werknemers op het gebied CRISPR/Cas9 zodat de double-stranded pauze functie. Deze keuze is gebaseerd op het gemak-of-gebruik van dit bepaalde genetische instrument en de flexibiliteit waarmee het kan uitschakelen van de genfunctie of dienst te introduceren van een buitenlandse stuk van DNA in een specifieke site. De generatie van een knock-out is technisch gemakkelijker in vergelijking met de vervanging van een gen, waar de opneming van de "juiste" of normale kopieën van een gen in de ziekte-site moet worden uitgevoerd met precisie. Een aantal onderzoekers zijn identificeren en het gebruik van bepaalde drugs en reagentia waarmee de correctie van mutant grondslagen en de invoeging van normale genetische sequenties in de juiste positie op de verhoogde frequenties29studeren.
Onlangs, Rivera-Torres et al. 30 gebruikt combinatorische gene bewerken, profiteren van de activiteit van de double-stranded pauze van een speciaal ontworpen CRISPR/Cas9-systeem en de genetische informatie geboden door een single-stranded oligonucleotide donor DNA sjabloon, om te herstellen een punt mutatie in eenéén exemplaar van het verbeterde groen TL proteïne (eGFP) gen geïntegreerd in de HCT116 cellen. De auteurs profiteerde van dit goed gekarakteriseerd model cellijn te evalueren van de specificiteit van decollete rondom de doelsite. De gegevens blijkt dat heterogeniteit in de doelsite bestaat, vooral in cellen die een gecorrigeerde punt mutatie niet bevatten. In dit manuscript, we detail en focus op de methodologie die wordt gebruikt door deze werknemers te onderzoeken ter plaatse vogelgriepvirus heterogeniteit gemaakt door het bewerken van CRISPR/Cas9-gen.
Protocol
het volgende protocol omvat werken met zoogdiercellen; vertrouwdheid met steriele techniek/celkweek verwachting.
1. cellijn en kweekomstandigheden
- maken 500 mL medium voor de cultuur van HCT 116 cellen: McCoy ' s 5A bewerkt medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine en 1% penicilline (dit is voltooid medium).
Opmerking: Groeien HCT 116-19 cellen in de kolf van een T-75 of T-175 voordat plating. Wanneer 90% heuvels, elke T-75 kolf zal opleveren 8.4 x 10 6 cellen, ongeveer vijf 10-cm platen, en elke T-175 18.4 x 10 6 cellen, ongeveer vijftien 10-cm platen zal opleveren.
2. Oogsten van cellen van de kolf
- gecombineerd weg het medium, wassen met Dulbecco ' s Phosphate-Buffered zout zonder calcium en magniesium (PBS) (10 mL voor T-75 respectievelijk 25 ml bedraagt voor T-175) en aspirate.
- Toevoegen trypsine dropwise aan op de maatkolf met behulp van een precisiepipet 2-mL (2 mL of 1 mL voor T-75 voor T-175). Plaats de kolf in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 5 min naar de cellen loskoppelen toestaan.
- Tik op de kolf om ervoor te zorgen dat alle cellen zijn verdreven en vervolgens met volledige medium doven door het te verspreiden over het gehele oppervlak van de kolf (8 mL of 4 mL T-75 voor T-175).
- Pipetteer op en neer meerdere keren breken cel bosjes en de overdracht van de cellen tot een conische buis 15 mL
- Vóór het spinnen van de cellen naar beneden, nemen 10 µL van de 15-mL conische en combineren met 10 µL van trypan blauw aan de cellen tellen. Pellet de cellen door spinnen voor 5 min op 125 x g en 16 ° C.
3. De cellen tellen
- Transfer 10 µL van de cellen gemengd met trypan blauw aan de hemocytometer. Tellen de 4 rasters rond de buitenkant (elk raster bevat 16 vierkantjes).
- Nemen de gemiddelde cel-telling uit elke verzameling van zestien hoek pleinen.
- Vermenigvuldigt met 10.000 (10 4).
- Te vermenigvuldigen met het totale volume van medium gebruikt om te oogsten van de cellen om te corrigeren voor de verdunning van de toevoeging van blauwe trypan.
Opmerking: De indeling van de vergelijking voor het berekenen van het volume resuspendeer de cellen volgt:
4. De cellen plating
- voor elke 10-cm plaat van cellen die moeten worden gesynchroniseerd, voeg 5 mL van volledige medium en 6 µM van aphidicholin (12 µL van een 2.5 mM voorraad in 200-proof ethanol).
- Transfer 100 µL van cel opnieuw gesuspendeerde pellet, 2.5 x 10 6 cellen, elke 10-cm plaat en swirl voorzichtig te mengen.
- Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 16-24 uur om te synchroniseren van cellen aan de G1/S grens.
5. Het vrijgeven van de cellen van Aphidicolin synchronisatie
- 4 h voorafgaand aan richt, gecombineerd het medium, wassen met PBS, gecombineerd de PBS, en voeg 5 mL van volledige medium
- plaats deze terug in de incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 4 h
6. RNA complexvormers
- Enter de mutant eGFP gensequentie in het Lab van Zhang ' s online generator 25 (http:// crispr.mit.edu/) en kies de CRISPR gids sequenties die zich met de nabijheid van de doelsite binden. De CRISPR gids sequenties aanvragen bij een commerciële bron.
- Slaan de CRISPR RNA (crRNA), trans-activeren crRNA (tracrRNA) en Cas9 eiwit bij 20 ° C en gebruiken volgens fabrikant suggesties.
- Mix het RNA in mengsel concentraties tot 45 µM. toevoegen 6,75 µL van een voorraad van 200 µM van crRNA en 6.75 µL van een voorraad van 200 µM van tracrRNA naar een 1.5-mL centrifuge buis. Voeg 16.50 µL van TE Buffer te maken een eindvolume van 30 µL.
- Bij 95 ° C gedurende 5 minuten in een warmte blok of PCR machine warmte.
Let op: Hot! - Laat afkoelen tot kamertemperatuur.
Opmerking: Als het gebruik van een PCR-machine, stel de koeling tot 0,2 ° C/s. - Voer de volgende stappen uit voor elk monster.
- Verdun 2.22 µL van crRNA:tracrRNA complex in 2,78 µL van TE Buffer (10 mM Tris, pH 8.0 en 0.1 mM EDTA; pH 8,0) tot een eindvolume van 5 µL.
- Verdund 1,67 µL van Cas9 eiwit uit een voorraad van 60 µM in 3,33 µL van lage-serum medium tot het eindvolume van 5 µL.
- Mix 5 µL van Cas9 eiwit met 5 µL van complexvorm RNA
7. Het oogsten van de cellen voor het richten van de
- Aspirate het medium, wassen met 5 mL PBS, gecombineerd de PBS en voeg 1 mL voorverwarmde trypsine tot elke 10-cm plaat. Zet de platen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 5 min.
- Op de 10-cm plaat om te controleren of alle cellen zijn verdreven en vervolgens doven met 4 mL van volledige medium door het te verspreiden over het gehele oppervlak van de plaat onttrekt.
- Pipetteer op en neer meerdere keren breken cel klontjes en overbrengen van de cellen naar een conische buis 15 mL.
- Vóór het spinnen van de cellen naar beneden, nemen 10 µL van de conische tube van 15 mL en combineren met 10 µL van trypan blauw aan de cellen tellen. De cellen door spinnen voor 5 min op 125 x g en kamertemperatuur pellet.
- Het medium gecombineerd en wassen met 5 mL PBS. De cellen door spinnen bij 125 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur pellet.
8. De cellen tellen
- Transfer 10 µL van de cellen gemengd met trypan blauw aan de hemocytometer. Tellen de 4 rasters rond de buitenkant (elk raster bevat zestien kwadraten).
- Nemen de gemiddelde cel-telling uit elke verzameling van zestien hoek pleinen.
- Vermenigvuldigt met 10.000 (10 4).
- Te vermenigvuldigen met het totale volume van medium gebruikt om te oogsten van de cellen om te corrigeren voor de verdunning van de toevoeging van blauwe trypan.
Nota: Het volgende is het formaat van de vergelijking voor het berekenen van het volume resuspendeer de cellen. Resuspendeer de vereiste aantal cellen in serumvrij McCoy ' s 5A bewerkt middellange.
9. gericht op monsters
- overbrengen van 100 µL celsuspensie (5 x 10 5 cellen) uit stap 8.1 naar elke electroporation 4-mm gat cuvette. Voeg 10 µL van RNP complexe uit stap 6,7 tot 100 µL van de cellen bij een celdichtheid van 5 x 10, 5. ODN toevoegen (2 µM) aan elk monster.
Opmerking: Voor een positieve controle, voeg 1 µL van eGFP op 1 µg/µL uiten plasmide- nemen het rek op een machine electroporation, lichtjes flick van elk monster, en plaats ze in de zaal. Electroporate bij 250 V, LV; 2 pulsen, 1 s; 13 ms; unipolaire puls.
- Het rack ook terug overzetten naar de kap. Elk monster overbrengen in een goed met 2 mL van volledige medium ikn een plaat van 6-well. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 gedurende 72 uur vóór correctie niveaus controleren.
10. Analyse van Gene bewerkt cellen en efficiëntie van de transfectie
- gecombineerd van het medium en wassen van de cellen met 2 mL PBS. De PBS gecombineerd en 500 µL voorverwarmde trypsine toe te voegen aan elk putje van de plaat 6-well. Zet de platen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 5 min.
- Tik op de plaat om te controleren of alle cellen zijn verdreven en vervolgens doven met 1 mL van volledige medium door het te verspreiden over het gehele oppervlak van de put.
- De cellen overgaan in een centrifugebuis 1.5-mL en pellet bij 5.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Gecombineerd het medium. Resuspendeer de pellet cel in 500 µL van FACS buffer (0,5% BSA, 2 mM EDTA en 2 µg/mL propidium jodide in PBS).
- Meten de cel fluorescentie (eGFP +) door stroom cytometry.
- Berekenen van de efficiëntie van de correctie als het percentage van het totale levende eGFP-positieve cellen over het totale aantal levende cellen in elk monster, zoals beschreven in Rivera Torres et al. 30.
11. DNA sequentieanalyse
- Electroporate de gesynchroniseerde en vrijgegeven HCT 116-19 cellen bij een concentratie van 5 x 10, 5 cellen/100 µL, met RNP complex op 100 pmols en 72NT ODN op 2,0 µM.
- Transfer van de cellen te 6-Wells-platen en laten herstellen voor 72 h.
- Sorteren de cellen individueel in 96-wells-platen met behulp van een sorter FACS met een laser (100 mw) 488-nm voor eGFP +/-, zoals beschreven in Rivera-Torres et al. 30.
Opmerking: Niet alle putjes zal met succes groeien. - Breiden de cellen meer dan 6 weken en oogst zoals beschreven in stap 7.
- Uit de putten die groei, isoleren van cellulaire gDNA met behulp van een commercieel beschikbare DNA-isolatie kit (Zie de Tabel van materialen) en versterken de regio rondom het doel basis via PCR (718 bp; voorwaartse primer 5 '- ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ' en omgekeerde primer 5 ' - ACTTGTACAGCTCGTCCATGC - 3 ').
- Uitvoeren DNA sequencing analyse van de monsters.
Representative Results
We gebruikten een modelsysteem om studeren gene bewerken in cellen van zoogdieren, die op de correctie van een mutatie van de punt ingebed binnen het eGFP gen geïntegreerd als een enkel exemplaar in de HCT116 cellen berust. Het is belangrijk op te merken dat dit een single-kopie-gen is; dus kan een minder ingewikkelde weergave van DNA wijzigingen of mutagenese worden gemaakt. Figuur 1A wordt de mutant eGFP germinale genetische identiteit met de gerichte base, het derde honk van de stop codon TAG, gemarkeerd in het rood weergegeven. De 72-base oligonucleotide, dat gedeeltelijk complementair is aan het niet-getranscribeerd onderdeel van het gen van eGFP (72NT) en is ontworpen voor het opwekken van de uitwisseling van de base van een G tot een C, wordt ook geïllustreerd. Daarnaast wordt ook een CRISPR, uitgeroepen tot 2C, met de volgorde van de aangegeven protospacer in een 5' naar 3' oriëntatie, afgebeeld in figuur 1A. Om uit te voeren deze reactie van gene-bewerken, gebruikten we een ribonucleoprotein (RNP) die bestaat uit de CRISPR (cr) RNA en de tracr (tr) RNA gekoppeld aan gezuiverde Cas9 eiwit (figuur 1B), in plaats van met behulp van een vector van de zoogdieren expressie die bestaat uit het Cas9-gen en de passende specifieke gids sequentie van het RNA.
Wanneer het speciaal ontworpen RNP deeltje wordt geleverd met de single-stranded oligonucleotide in HCT116 cellen door electroporation, gene bewerken, blijkt uit de reparatie van de interne basis mutatie in eGFP, wordt waargenomen na 72 uur incubatie met behulp van een stroom cytometer. Functionele reparatie is waarneembaar door de opkomst van groene fluorescentie in gerichte cellen, cellen die ook kunnen worden losgekoppeld van de gehele bevolking vanwege deze fluorescentie wordt gesorteerd. Zoals blijkt uit Figuur 2, kan een geleidelijke dosis-respons worden gezien als de gecoördineerde niveaus van verhoging van de RNP en 72NT. De moleculaire ratio, de picomoles van RNP, en concentratie van de micromolar van de 72NT zoals weergegeven in de afbeelding zijn gebaseerd op optimale dosering gebruikt in gen-bewerken reacties die afhankelijk van de invoering van Cas9 en specifieke gids RNA van transfected expressie zijn vectoren. De inzet in Figuur 2 toont een gen-bewerken reactie in de afwezigheid van het deeltje RNP uitgevoerd. Hier, wordt ongeveer 1% van de gerichte cellen gecorrigeerd wanneer een 10-fold hogere concentratie van de 72NT-oligonucleotide wordt gebruikt in de single-agent gene-bewerken reactie.
Om te bepalen of genetische heterogeniteit het doel site-de zogenaamde on-site mutagenese effect bestaat-hebben we besloten om te onderzoeken het resultaat van gene activiteit in afzonderlijke cellen bewerken. Terwijl veel meer moeizaam dan onderzoeken van de totale bevolking, een ware maatregel van genetische voetafdrukken of laesies kan worden vastgesteld wanneer het genoom van klonaal uitgebreide cellen wordt onderzocht. We herhaald het experiment beschreven in Figuur 2, deze keer alleen met behulp van 100 pmol van RNP complexe en 2.0 µmol van de 72NT-oligonucleotide. Als werden boven, HCT 116 cellen gesynchroniseerd gedurende 24 uur met aphidicholine en gearresteerd bij de G1/S-grens. 4 uur daarna, de cellen werden uitgebracht en de gen-bewerkingsgereedschap werden geïntroduceerd door electroporation. 72 h later, de cellen werden geanalyseerd met behulp van FACS en individueel gesorteerd in 96-wells-platen (het experimentele proces wordt geïllustreerd in Figuur 3). Cellen weergeven van groene fluorescentie waren stroom cytometry gesorteerd in individuele wells van een 96-wells-plaat voor klonen expansie. Belangrijker, werden cellen expressie van eGFP ontbreekt ook geïsoleerd en gesorteerd op een soortgelijke manier voor uitbreiding onder dezelfde voorwaarden.
Na 14 dagen van de groei, had de meeste van de individuele klonen voldoende uitgebreid zodat DNA isolatie. Zo, 16 klonen van de eGFP-positieve monsters werden geselecteerd, en de genetische integriteit rondom de doelsite werd geanalyseerd door DNA sequentiebepaling. Informatie rondom de opeenvolging van DNA van allelen binnen de bevolking werd gegenereerd met behulp van Sanger sequencing, geassembleerd met behulp van reeks visualisatie software te vergelijken van de volgorde van een wildtype allel (figuur 4A). De geknipte site van het complex RNP wordt aangegeven door een zwarte pijl, gelegen op de groene bar (crRNA 2C). Zoals ook blijkt uit figuur 4Abevatten alle 16 eGFP-positieve cellen de voorspelde nucleotide uitwisseling op de doelsite. Het geconverteerde C residu is gemarkeerd in het rood, en het profiel van de piek als gevolg van die nauwkeurige verandering wordt verstrekt onder de reeks van eGFP-positief. Op een gelijkaardige manier, 15 niet-groen klonale isoleert, voldoende uitgebreid zodat DNA-extractie en sequencing, werden geanalyseerd voor de heterogeniteit in de doelsite. Zoals voorspeld, in ongeveer de helft van de monsters, werd geen DNA base exchange waargenomen. Dit wordt weerspiegeld in het onderhoud van de G-residu op de doelsite, zoals weergegeven in figuur 4B. De rest van de klonen uitbreidingen onderzocht in deze experimenten weergegeven een heterogene populatie van schrapping mutaties, dus goed voor het gebrek aan groene fluorescentie. De grootte van de schrapping, varieerden van een base 19 bases. Het is belangrijk op te merken dat wij slechts 15 monsters van de eGFP-positieve cellen hebben bestudeerd, en terwijl wij zijn van mening dat dit heel representatief is voor het soort genetische beschadigingen achtergelaten door CRISPR/Cas9 activiteit, er een mogelijkheid dat andere soorten of soorten microdeleties is bij de gerichte populatie aanwezig kon zijn.
Samen genomen, bevestigen de resultaten weergegeven in Figuur 4 de fenotypische uitlezing in de eGFP targeting systeem. Conversie van G naar C nucleotide in staat stelt de opkomst van groene fluorescentie in gecorrigeerde HCT116 cellen. Geen basis substitutie rondom de doelsite geconstateerd in het klonen geïsoleerd voor dit experiment of in eerdere experimenten27,28. De gegevens tonen ook aan dat cellen niet ondergaan gene bewerken via punt-mutatie reparatie blijven ongecorrigeerd, maar in sommige gevallen niet ongewijzigd, met een scala van genetische heterogeniteit rondom de doelsite.
Figuur 1. (A) modelsysteem voor de gene bewerking van het gen mutant eGFP. De passende segmenten van de wildtype en gemuteerde eGFP gen met de gerichte codon, gelegen in het centrum van de reeks, worden weergegeven in groen en rood, respectievelijk. De nucleotide gericht voor uitwisseling is vet en onderstreept. De gemarkeerde baseert in blauwe vertegenwoordigen de volgorde 2C CRISPR protospacer en de oranje honken Markeer de PAM-site. De oligonucleotide gebruikt in deze experimenten is 72 bases in lengte, rekening houdend met phosphorothioate bewerkt verbanden op de drie terminal bases; de 72-mer richt zich op de niet-getranscribeerd (NT) strand (72NT). (B) CRISPR/Cas9ribonucleoprotein vergadering reactie. crRNA biedt doel specificiteit (20 basen, rode sectie) overeenkomt met de volgorde van de protospacer 2C en een interactie-domein (blauw) met de tracrRNA (groen). crRNA en tracrRNA zijn in een concentratie die mengsel gegloeid. Cas9 eiwit (grijs) is toegevoegd aan de RNP opbouw. Gids RNAs (gRNAs) direct en activeren de Cas9-endonuclease, die vervolgens doelDNA klieven. Het onderste gedeelte van de figuur toont de volgorde 2C zaad en de tracrRNA volgorde. Dit cijfer is bewerkt vanaf Rivera-Torres, N. e.a. (2017). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Gen bewerken is dosisafhankelijk wanneer geregisseerd door de RNP en de ssODN. Gesynchroniseerd en vrijgegeven HCT 116-19 cellen waren electroporated met 24-120 pmol van CRISPR/Cas9 RNP en 0.6-3.0 µM van 72mer. Na een herstelperiode van 72-uur, werd gene bewerken activiteit gemeten met behulp van een cytometer van de stroom. Gene bewerken wordt weergegeven als de correctie rendement (%), bepaald door het aantal levensvatbare eGFP-positieve cellen gedeeld door het totale aantal levensvatbare cellen in de bevolking. Foutbalken worden geproduceerd uit drie sets van gegevenspunten gegenereerd over drie aparte experimenten met behulp van eenvoudige berekeningen van de standaardfout. Inzet: Single-agent gene bewerken. Bewerken van Gene activiteit geregisseerd door de single-stranded oligonucleotide (72NT) bij gebrek aan de complexe onder identieke omstandigheden RNP wordt gepresenteerd als een functie van toenemende concentratie. Dit cijfer is bewerkt vanaf Rivera-Torres, N. e.a. (2017). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Experimentele strategie voor de isolatie van eencellige klonen. Cellen exposeren expressie van eGFP werden gescoord als positief en gesorteerd met behulp van een stroom cytometer als afzonderlijke cellen in individuele putten om klonen uit te breiden. Cellen ontbreekt de expressie van eGFP werden geïsoleerd en gesorteerd op een soortgelijke manier en uitgebreid onder dezelfde voorwaarden. Het DNA werd dan geïsoleerd en het eGFP gen werd versterkt en onderworpen aan Sanger sequencing voor het analyseren van de gen-bewerken activiteit rond de doelsite. Dit cijfer is bewerkt vanaf Rivera-Torres, N. e.a. (2017). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. (A) allèlique analyse van eGFP-positieve cellen uitgebreid als een klonale populatie. Klonaal geïsoleerd en uitgebreide eGFP-positieve monsters (zestien klonen) werden geanalyseerd op de site rond de gerichte base en het DNA van elk, geoogst, gezuiverd, versterkt en sequenced. Allèlique analyse werd uitgevoerd met behulp van Sanger sequencing, geassembleerd met behulp van reeks visualisatie software en vergeleken met de volgorde van een wildtype-allel, die aan de bovenkant van de afbeelding wordt geïllustreerd. De geknipte site van het complex RNP wordt aangegeven als een kleine zwarte pijl, gelegen op de groene bar (crRNA 2C). (B) Allèlique analyse van eGFP-negatieve cellen uitgebreid als een klonale populatie. Vijftien afzonderlijke monsters, uitgebreid van klonen die afkomstig zijn van de niet-gecorrigeerde bevolking, werden willekeurig geselecteerd en geanalyseerd voor indel vorming op de site rond de nucleotide doel. Als boven, allèlique analyse werd uitgevoerd met behulp van Sanger sequencing en geassembleerd met behulp van een reeks visualisatie software. Nogmaals, de volgorde van een allel wildtype aan de bovenkant van de figuur, samen met de gesneden site van de RNP, worden gepresenteerd. Dit cijfer is bewerkt vanaf Rivera-Torres, N. e.a. (2017). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Gene bewerken heeft ontpopt als een mainstream wetenschappelijke discipline voornamelijk vanwege de opkomst van de CRISPR/Cas9-systeem. Dit opmerkelijke traject, dat adoptief immuniteit in bacteriecellen vergemakkelijkt, heeft geweest voorzien als een moleculaire instrument om genomic wijziging in menselijke chromosomen. De natuurlijke functie van CRISPR/Cas9 is het uitschakelen van viraal DNA door de invoering van de double-stranded DNA-einden leidt tot versnippering30,31. Deze activiteit leidt tot de vernietiging van een invasie van exogene DNA en leidt tot prokaryote immuniteit dat latere infectie door de dezelfde virale deeltjes onderdrukt. Verbazingwekkend, dit systeem vertoont de gedrag, in die zin dat het specifieke CRISPR gRNA gemaakt door eerdere infectie gebeurtenissen kunt activeren.
De efficiëntie en nauwkeurigheid van verstoring van de gene gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 is gebruikt in diverse eukaryotic genetische systemen waar het doel was om te schakelen van een goed functionerend gen32,33. Wanneer gereduceerd tot het basale niveau, bestaat het proces uit twee fundamentele stappen. De eerste is een double-stranded pauze, terwijl de tweede op de inherente proces van niet-homologe einde deelname aan (NHEJ berust) voltooi de knock-out. In de meeste gevallen, de resultaten van de double-stranded pauze in de oprichting van het bot-eindigde, onthechte chromosomale segmenten, en enzymen die betrokken zijn bij NHEJ op de chromosomale pauze reageren en handelen om het samenvoegen van de gebroken uiteinden. Dit proces kan soms betrekking hebben op het verlies van individuele nucleotiden op de afgehakte site. Het verlies van nog een paar grondslagen kan leiden tot een frameshift en functionele expressie ophoudt. Het gebruik van CRISPR/Cas9 te creëren van genetische knock-out door het boeiende van het natuurlijke proces van NHEJ heeft een revolutie teweeggebracht in eukaryote genetica; het verlies van DNA op de doelsite is zowel voorspelbaar als verwachte.
In tegenstelling tot de gene knock-out, hebben een aantal onderzoekers in wilt omleiden en hergebruiken van CRISPR/Cas9 activiteit naar het proces van reparatie homologie-gericht bezig gehouden. Het doel van de studies is gene correctie. In deze strategie, is CRISPR/Cas9 gecombineerd met een sjabloon met donor DNA de genetische informatie bevat te herstellen van een aangeboren fout of invoegen van mutaties in gezonde genen. Vroege rapporten benadrukken het opmerkelijke vermogen van CRISPR/Cas9 te katalyseren homologie geleide reparatie aangegeven (direct of indirect) dat het proces vond plaats in een zeer nauwkeurige mode24,34. Ons laboratorium heeft bestudeerd homologie geleide reparatie of gene correctie met behulp van single-stranded oligonucleotides in een poging om te definiëren van het mechanisme en de regelgevende circuits eromheen15,17,18 ,23. We hebben was vooral gericht op het gen bewerken van één punt mutaties, want dit is de meest elementaire genetische mutatie bekend met veel erfelijke aandoeningen worden belast. Onze fundamentele kennis van gene bewerken leidde ons naar de vraag van de precisie van CRISPR/Cas9 activiteit in deze reacties, sinds de CRISPR/Cas9-functie gene knockout resulteert in de vorming van microdeleties. We gebruikten een welomschreven modelsysteem, in plaats van een niet-selecteerbare nog klinisch relevante gen, te bestuderen ter plaatse mutagenese in een uitgesproken reductionistische mode. Met behulp van een eenvoudig doel-gen, van welke gen correctie kan worden gemeten op zowel de genotypische en de fenotypische niveau, redeneerde wij dat heterogeniteit plaatsvinden op de doelsite op een betrouwbare en robuuste wijze kon worden geïdentificeerd.
Onze gegevens bevestigen dat de gevestigde gen bewerken systeem, bestaande uit een mutant eGFP gen geïntegreerd in de HCT116 cellen, kan bieden fundamentele informatie met betrekking tot de generatie van genetische laesies en het proces van on-site mutagenese. CRISPR/Cas9 en single-stranded oligonucleotide donor DNA moleculen werken in tandem kunnen leiden tot de precieze reparatie van de punt-mutatie in het gen eGFP. Wij stellen een nieuw model voor de reparatie van puntmutaties, een moleculaire traject waarin de donor DNA fungeert als een replicatie-sjabloon voor de reparatie van de mutant base, een proces dat wij hebben ExACT30genoemd. De gerichte bevolking, niet het tentoonstellen van het gecorrigeerde fenotype, toont een verscheidenheid van cellen met heterogene en sterk variërend DNA microdeleties rondom de doelsite. In ongeveer de helft de klonen van de niet-gecorrigeerde bevolking werd geïsoleerd, werd schrapping mutagenese waargenomen op de doelsite. Aangezien geen vorige verslag heeft aangegeven dat single-stranded oligonucleotides handelend als single-agent gene-bewerkingsgereedschap microdeleties op de doelsite induceren kunnen, we concluderen dat CRISPR/Cas9 activiteit verantwoordelijk voor deze mutaties is.
In dit manuscript bieden wij een gedetailleerde methodologie, zodat genetische heterogeniteit op de doelsite op een betrouwbare en robuuste wijze kan worden gemeten. Terwijl een enorme hoeveelheid aandacht heeft besteed aan de analyse en in kaart brengen van off-site mutagenese, het is waarschijnlijk dat een heterogene mutatie gemaakt op de doelsite een groter effect op het slagen of mislukken van gen bewerken in de klinische arena zal hebben. Het is mogelijk dat aanvullende technologieën of gemodificeerd Cas9 eiwit vereist ter verbetering van de precisie van de homologie-geleide reparatie van aangeboren fouten in zoogdiercellen35. Sommige van deze technologieën omvatten het gebruik van ondersteunende oligonucleotides te fungeren als een brug, de chromosomale einden bij elkaar te houden en het vermijden van de destructieve werking van NHEJ. Vaststelling van de mate van heterogeniteit in de doelsite als gevolg van gen-bewerking activiteit is en moet een belangrijk onderdeel van elk protocol dat is ontworpen voor therapeutische interventie.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs hebben geen bevestigingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy’s 5A Modified medium | ATCC | 30-2007 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
| L-glutamine | ATCC | 30-2214 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | ATCC | 30-2300 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ATCC | 30-2200 | No Calcium or magnesium |
| Trypsin EDTA Solution | ATCC | 30-2101 | |
| Aphidicolin 1mg | Thermo Fisher | AC611970010 | |
| Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol | IDT | No catalog number since its made to your specific gene target. | |
| CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol | IDT | 1072533 | |
| S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg | IDT | 1074182 | |
| IDTE Buffer | IDT | 11-01-03-01 | |
| Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm | VWR | 10497-474 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporation Systems | BioRad | 1652660 | |
| Bovine serum albumin lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE) |
Sigma | 05470-1G | |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | AM9260G | |
| Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69581 | |
| 6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates | VWR | 10062-892 | |
| Petri Dishes | Fisher | 12-565-90 | |
| Conical Tubes (15 mL) (racked) | Thermo Fisher | AM12500 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
References
- Mandecki, W. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci. 83 (19), 7177-7181 (1986).
- Walder, R. Y., Walder, J. A. Oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis using the yeast transformation system. Gene. 42 (2), 133-139 (1986).
- Moerschell, R. P., Tsunasawa, S., Sherman, F. Transformation of yeast with synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci. 85 (2), 524-528 (1988).
- Yoon, K., Cole-Strauss, A., Kmiec, E. B. Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNADNA oligonucleotide. Genetics. 93, 2071-2076 (1996).
- Beetham, P. R., Kipp, P. B., Sawycky, X. L., Arntzen, C. J., May, G. D. A tool for functional plant genomics: chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-specific mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8774-8778 (1999).
- Bertoni, C., Morris, G. E., Rando, T. A. Strand bias in oligonucleotide-mediated dystrophin gene editing. Hum Mol Gen. 14 (2), 221-233 (2004).
- Alexeev, V., Yoon, K. Stable and inheritable changes in genotype and phenotype of albino melanocytes induced by an RNA-DNA oligonucleotide. Nat Biotechnol. 16 (13), 1343-1346 (1998).
- Zorin, B., Hegemann, P., Sizova, I. Nuclear-gene targeting by using single-stranded DNA avoids illegitimate DNA integration in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot Cell. 4 (7), 1264-1272 (2005).
- Brachman, E. E., Kmiec, E. B. DNA replication and transcription direct a DNA strand bias in the process of targeted gene repair in mammalian cells. J Cell Sci. 117 (Pt 17), 3867-3874 (2004).
- Pierce, E. A., et al. Oligonucleotide-directed single-base DNA alterations in mouse embryonic stem cells. Gene Ther. 10 (1), 24-33 (2003).
- Radecke, S., Radecke, F., Peter, I., Schwarz, K. Physical incorporation of a single-stranded oligodeoxynucleotide during targeted repair of a human chromosomal locus. J Gene Med. 8 (2), 217-228 (2006).
- Bertoni, C., Rustagi, A., Rando, T. A. Enhanced gene repair mediated by methyl-CpG-modified single-stranded oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7468-7482 (2009).
- Andrieu-Soler, C., et al. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33 (12), 3733-3742 (2005).
- Olsen, P. A., Randol, M., Krauss, S. Implications of cell cycle progression on functional sequence correction by short single-stranded DNA oligonucleotides. Gene Ther. 12 (6), 546-551 (2005).
- Engstrom, J. U., Kmiec, E. B. DNA replication, cell cycle progression and the targeted gene repair reaction. Cell Cycle. 7 (10), 1402-1414 (2008).
- Aarts, M., te Riele, H. Parameters of oligonucleotide-mediated gene modification in mouse ES cells. J Cell Mol Med. 14 (6b), 1657-1667 (2010).
- Brachman, E. E., Kmiec, E. B. Gene repair in mammalian cells is stimulated by the elongation of S phase and transient stalling of replication forks. DNA Repair. 4 (4), 445-457 (2005).
- Engstrom, J. U., Suzuki, T., Kmiec, E. B. Regulation of targeted gene repair by intrinsic cellular processes. BioEssays. 31 (2), 159-168 (2009).
- Parekh-Olmedo, H., Ferrara, L., Brachman, E., Kmiec, E. B. Gene therapy progress and prospects: targeted gene repair. Gene Ther. 12 (8), 639-646 (2005).
- Olsen, P. A., Randol, M., Luna, L., Brown, T., Krauss, S. Genomic sequence correction by single-stranded DNA oligonucleotides: role of DNA synthesis and chemical modifications of the oligonucleotide ends. J Gene Med. 7 (12), 1534-1544 (2005).
- Wang, Z., Zhou, Z. -J., Liu, D. -P., Huang, J. -D. Double-stranded break can be repaired by single-stranded oligonucleotides via the ATM/ATR pathway in mammalian cells. Oligonucleotides. 18 (1), 21-32 (2008).
- Ferrara, L., Kmiec, E. B. Camptothecin enhances the frequency of oligonucleotide-directed gene repair in mammalian cells by inducing DNA damage and activating homologous recombination. Nucleic Acids Res. 32 (17), 5239-5248 (2004).
- Ferrara, L., Parekh-Olmedo, H., Kmiec, E. B. Enhanced oligonucleotide-directed gene targeting in mammalian cells following treatment with DNA damaging agents. Exp Cell Res. 300 (1), 170-179 (2004).
- Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
- Rivera-Torres, N., et al. The position of DNA cleavage by TALENs and cell synchronization influences the frequency of gene editing directed by single-stranded oligonucleotides. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Strouse, B., Bialk, P., Niamat, R. a, Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. Combinatorial gene editing in mammalian cells using ssODNs and TALENs. Sci Rep. 4 (ii), 3791 (2014).
- Bialk, P., Rivera-Torres, N., Strouse, B., Kmiec, E. B. Regulation of Gene Editing Activity Directed by Single-Stranded Oligonucleotides and CRISPR/Cas9 Systems. PloS One. 10 (6), e0129308 (2015).
- Yu, C., et al. Small Molecules Enhance CRISPR Genome Editing in Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 16 (2), 142-147 (2015).
- Rivera-Torres, N., Banas, K., Bialk, P., Bloh, K. M., Kmiec, E. B. Insertional Mutagenesis by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Gene Editing in Cells Targeted for Point Mutation Repair Directed by Short Single-Stranded DNA Oligonucleotides. PLoS One. 12 (1), e0169350 (2017).
- Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 31 (9), 833-838 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
