Dit protocol beschrijft de workflow van een CRISPR/Cas9 gebaseerde gen bewerken systeem voor de reparatie van puntmutaties in zoogdiercellen. Hier, gebruiken wij een combinatorische benadering voor het gen bewerken met een gedetailleerde opvolgzuigelingenvoeding experimentele strategie voor het meten van indel vorming op de doelsite — Kortom, het analyseren van on-site mutagenese.
Combinatorische gene bewerken met behulp van CRISPR/Cas9 en single-stranded oligonucleotides is een effectieve strategie voor de correctie van single-base puntmutaties, die vaak verantwoordelijk voor allerlei menselijke erfelijke aandoeningen zijn. Met behulp van een reeds lang gevestigde van cel-gebaseerde modelsysteem, is het punt mutatie van een gen van de single-kopie mutant eGFP geïntegreerd in de HCT116 cellen gerepareerd met behulp van deze combinatorische aanpak. De analyse van gecorrigeerd en ongecorrigeerd cellen blijkt zowel de precisie van het gen bewerken en de ontwikkeling van genetische laesies, wanneer microdeleties worden gemaakt in niet-gecorrigeerde cellen in de opeenvolging van DNA, rond de doelsite. Hier, wordt de specifieke methoden gebruikt voor het analyseren van deze combinatorische benadering van het gen bewerken van een punt mutatie, in combinatie met een gedetailleerde experimentele strategie te meten indel vorming op de doelsite, geschetst. Dit protocol beschrijft een fundamentele aanpak en workflow voor onderzoek gericht op het ontwikkelen van CRISPR/Cas9 gebaseerde gene bewerken voor menselijke therapie. De conclusie van dit werk is dat on-site mutagenese plaatsvindt als gevolg van CRISPR/Cas9 activiteit tijdens het proces van punt mutatie reparatie. Dit werk zet in plaats van een gestandaardiseerde methodologie ter identificatie van de mate van mutagenese, die een belangrijke en kritische aspect van een benadering die bestemd zijn voor klinische toepassing moet.
Baanbrekende studies van Mandecki (1986) blijkt permanente veranderingen in plasmide DNA oligonucleotides omgevormd tot bacteriën1, terwijl Walder en Walder (1986) soortgelijke studies in gist2uitgevoerde gebruiken. Kort daarna, publiceerde Sherman en collega’s een reeks documenten die single-stranded oligonucleotides gistcellen om erfelijke veranderingen in genen3werden binnengebracht. Voortbouwend op de baanbrekende werk in microbiële cellen, begon Kmiec en collega’s te ontwikkelen unieke single-agent oligonucleotides dat één basis reparatie in zoogdiercellen4gericht. Dit concept was gebaseerd op biochemische gegevens waaruit bleek dat de moleculen RNA met meer strak naar de doelsite dan die bestaan geheel uit DNA-basen binden. Hoewel er talrijke rapporten bewerken van gene succes met behulp van chimeer oligonucleotides5,6,7, bleef de editing niveaus zeer variabel tussen experimenten en over verschillende doelcel / combinaties.
Single-stranded donor DNA is aangenamer zijn wanneer u donor van de double-stranded DNA omdat het minder waarschijnlijk te integreren op willekeurige sites binnen het genoom8is. Exogenously geïntroduceerde single-stranded oligonucleotides zijn echter gevoelig voor snelle afbraak door cellulaire nucleasen. Verschillende strategieën aan de termini van oligonucleotides behoeden voor degradatie zijn tewerkgesteld. Een exonuclease-beschermd, single-stranded DNA met de gewenste volgorde was voldoende om het verkrijgen van een editing-efficiëntie in de 0,1-1% bereik6. Verbeterd en meer consistente transfectie technieken, in combinatie met fenotypische uitlezingen, waarbinnen meer consistente bewerken door meerdere onderzoek groepen8,9,10,11, 12,,13.
In de afgelopen 10 jaar, is er een aanzienlijke inspanning om de doelcellen meer vatbaar voor gene bewerken. Een strategie maakt gebruik van de modulatie van de celcyclus14,15,16. Terwijl editing frequenties onder normale omstandigheden met single-stranded oligonucleotides (ssODNs) ingevoerd in zweefde gekweekte zoogdiercellen tussen 0,1% en 1%, de frequenties van gen bewerken verhoogde 3 – tot 5 keer wanneer de oligonucleotides cellen werden binnengebracht tijdens hun overgang via de S-fase. In een aparte reeks experimenten blijkt Brachman en Kmiec (2005) dat de relatief hoge niveaus van precieze gen bewerken (3-5%) werden verkregen wanneer 2’3 ‘ dideoxycytosine (ddC) was geïncubeerd in cellen gedurende 24 uur voordat het prestatiemeteritembestand van de oligonucleotide17 . ddC verlaagt het aantal DNA replicatie vork beweging, suggereren dat gene bewerken door ssODNs bij het repliceren van cellen waarschijnlijk gaat om de opneming van ODNs in regio’s van de actieve replicatie11,18. Samen genomen, deze studies geleid tot het concept dat donor DNA wordt opgenomen in een groeiende replicatie (DNA) als onderdeel van de ware werkingsmechanisme van gene bewerken, onafhankelijk van of een double-stranded pauze is aanwezig of niet19. Dus, de correctie van een mutatie van de punt of de vervanging van een segment van DNA in de chromosomen optreedt via een DNA in paren rangschikken en single-strand assimilatie traject.
Willekeurige double-stranded DNA-einden in het kweken van cellen met kleine-molecuul agenten inducerende creëert een omgeving waarin DNA replicatiegebeurtenissen zijn vastgelopen als de cel probeert te herstellen van de schade20,21. Deze tijdelijke vertraging van de replicatie vorken maakt een efficiëntere penetratie van de structuur van de chromatine door single-stranded bewerken oligonucleotides, verbetering van de doel toegankelijkheid15. De oprichting van double-stranded DNA breekt door drugs zoals VP16, bleomycine, of camptothecine22,23, is aangetoond dat het stimuleren van gene schrijven validatieniveaus door bijna 10-fold, maximaal 6-8%. Willekeurige double-stranded DNA-einden zijn echter ongewenste in een therapeutische setting.
Gene bewerken met programmeerbare nucleasen en oligonucleotides wordt ook gestimuleerd tijdens de celdeling24,25. Toen nucleïnezuur gebaseerde levering werd gebruikt voor het verrichten van reparatie homologie-geregisseerd in gesynchroniseerde HCT 116 cellen, Rivera-Torres- en collega’s aangetoond de dezelfde toename van de activiteit richten wanneer transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALENs) werkten met single-stranded oligonucleotides, beide opgenomen in een replicerende cel bevolking26,27 . Meer recent, Bialk en collega’s bleek dat de reparatie van enkele basis mutaties met single-stranded oligonucleotides en een scala aan regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt Cas9 geclusterd (CRISPR/Cas9) moleculen plaatsvindt met grotere werkzaamheid Wanneer is de celpopulatie S fase28doorlopen. Het CRISPR molecuul bestaat uit RNA en functies te identificeren van de regio binnen het doeldocument DNA-sequentie dat bestemd is voor decollete. Cas9 is een bacteriële enzym waarvan de functie is te klieven double-stranded DNA in een nucleolytic uitwisseling reactie. Dus, CRISPR posities het complex op de genomic doelgroep, en Cas9 nuclease voert de double-stranded pauze. Lin et al. (2014) ook blijk gegeven van het belang van de celcyclus voor het bereiken van hoge frequenties van gen bewerken, met behulp van een gemodificeerde CRISPR/Cas9 ribonulceoprotien (RNP) complex-gemedieerde expresbezorgingssysteem in primaire neonatale fibroblasten, menselijke embryonale stamcellen, en andere cel lijnen24. Dus, is de relatie tussen gene bewerken en celcyclus voor het bewerken van de single-agent gene geldt voor combinatorische gene bewerken met behulp van programmeerbare nucleasen en donor DNA sjablonen. Terwijl de combinatorische benadering voor het bewerken van gene een scala aan partners met de donor DNA sjabloon samengebracht heeft, gebruiken de meeste werknemers op het gebied CRISPR/Cas9 zodat de double-stranded pauze functie. Deze keuze is gebaseerd op het gemak-of-gebruik van dit bepaalde genetische instrument en de flexibiliteit waarmee het kan uitschakelen van de genfunctie of dienst te introduceren van een buitenlandse stuk van DNA in een specifieke site. De generatie van een knock-out is technisch gemakkelijker in vergelijking met de vervanging van een gen, waar de opneming van de “juiste” of normale kopieën van een gen in de ziekte-site moet worden uitgevoerd met precisie. Een aantal onderzoekers zijn identificeren en het gebruik van bepaalde drugs en reagentia waarmee de correctie van mutant grondslagen en de invoeging van normale genetische sequenties in de juiste positie op de verhoogde frequenties29studeren.
Onlangs, Rivera-Torres et al. 30 gebruikt combinatorische gene bewerken, profiteren van de activiteit van de double-stranded pauze van een speciaal ontworpen CRISPR/Cas9-systeem en de genetische informatie geboden door een single-stranded oligonucleotide donor DNA sjabloon, om te herstellen een punt mutatie in eenéén exemplaar van het verbeterde groen TL proteïne (eGFP) gen geïntegreerd in de HCT116 cellen. De auteurs profiteerde van dit goed gekarakteriseerd model cellijn te evalueren van de specificiteit van decollete rondom de doelsite. De gegevens blijkt dat heterogeniteit in de doelsite bestaat, vooral in cellen die een gecorrigeerde punt mutatie niet bevatten. In dit manuscript, we detail en focus op de methodologie die wordt gebruikt door deze werknemers te onderzoeken ter plaatse vogelgriepvirus heterogeniteit gemaakt door het bewerken van CRISPR/Cas9-gen.
Gene bewerken heeft ontpopt als een mainstream wetenschappelijke discipline voornamelijk vanwege de opkomst van de CRISPR/Cas9-systeem. Dit opmerkelijke traject, dat adoptief immuniteit in bacteriecellen vergemakkelijkt, heeft geweest voorzien als een moleculaire instrument om genomic wijziging in menselijke chromosomen. De natuurlijke functie van CRISPR/Cas9 is het uitschakelen van viraal DNA door de invoering van de double-stranded DNA-einden leidt tot versnippering30,31. Deze activiteit leidt tot de vernietiging van een invasie van exogene DNA en leidt tot prokaryote immuniteit dat latere infectie door de dezelfde virale deeltjes onderdrukt. Verbazingwekkend, dit systeem vertoont de gedrag, in die zin dat het specifieke CRISPR gRNA gemaakt door eerdere infectie gebeurtenissen kunt activeren.
De efficiëntie en nauwkeurigheid van verstoring van de gene gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 is gebruikt in diverse eukaryotic genetische systemen waar het doel was om te schakelen van een goed functionerend gen32,33. Wanneer gereduceerd tot het basale niveau, bestaat het proces uit twee fundamentele stappen. De eerste is een double-stranded pauze, terwijl de tweede op de inherente proces van niet-homologe einde deelname aan (NHEJ berust) voltooi de knock-out. In de meeste gevallen, de resultaten van de double-stranded pauze in de oprichting van het bot-eindigde, onthechte chromosomale segmenten, en enzymen die betrokken zijn bij NHEJ op de chromosomale pauze reageren en handelen om het samenvoegen van de gebroken uiteinden. Dit proces kan soms betrekking hebben op het verlies van individuele nucleotiden op de afgehakte site. Het verlies van nog een paar grondslagen kan leiden tot een frameshift en functionele expressie ophoudt. Het gebruik van CRISPR/Cas9 te creëren van genetische knock-out door het boeiende van het natuurlijke proces van NHEJ heeft een revolutie teweeggebracht in eukaryote genetica; het verlies van DNA op de doelsite is zowel voorspelbaar als verwachte.
In tegenstelling tot de gene knock-out, hebben een aantal onderzoekers in wilt omleiden en hergebruiken van CRISPR/Cas9 activiteit naar het proces van reparatie homologie-gericht bezig gehouden. Het doel van de studies is gene correctie. In deze strategie, is CRISPR/Cas9 gecombineerd met een sjabloon met donor DNA de genetische informatie bevat te herstellen van een aangeboren fout of invoegen van mutaties in gezonde genen. Vroege rapporten benadrukken het opmerkelijke vermogen van CRISPR/Cas9 te katalyseren homologie geleide reparatie aangegeven (direct of indirect) dat het proces vond plaats in een zeer nauwkeurige mode24,34. Ons laboratorium heeft bestudeerd homologie geleide reparatie of gene correctie met behulp van single-stranded oligonucleotides in een poging om te definiëren van het mechanisme en de regelgevende circuits eromheen15,17,18 ,23. We hebben was vooral gericht op het gen bewerken van één punt mutaties, want dit is de meest elementaire genetische mutatie bekend met veel erfelijke aandoeningen worden belast. Onze fundamentele kennis van gene bewerken leidde ons naar de vraag van de precisie van CRISPR/Cas9 activiteit in deze reacties, sinds de CRISPR/Cas9-functie gene knockout resulteert in de vorming van microdeleties. We gebruikten een welomschreven modelsysteem, in plaats van een niet-selecteerbare nog klinisch relevante gen, te bestuderen ter plaatse mutagenese in een uitgesproken reductionistische mode. Met behulp van een eenvoudig doel-gen, van welke gen correctie kan worden gemeten op zowel de genotypische en de fenotypische niveau, redeneerde wij dat heterogeniteit plaatsvinden op de doelsite op een betrouwbare en robuuste wijze kon worden geïdentificeerd.
Onze gegevens bevestigen dat de gevestigde gen bewerken systeem, bestaande uit een mutant eGFP gen geïntegreerd in de HCT116 cellen, kan bieden fundamentele informatie met betrekking tot de generatie van genetische laesies en het proces van on-site mutagenese. CRISPR/Cas9 en single-stranded oligonucleotide donor DNA moleculen werken in tandem kunnen leiden tot de precieze reparatie van de punt-mutatie in het gen eGFP. Wij stellen een nieuw model voor de reparatie van puntmutaties, een moleculaire traject waarin de donor DNA fungeert als een replicatie-sjabloon voor de reparatie van de mutant base, een proces dat wij hebben ExACT30genoemd. De gerichte bevolking, niet het tentoonstellen van het gecorrigeerde fenotype, toont een verscheidenheid van cellen met heterogene en sterk variërend DNA microdeleties rondom de doelsite. In ongeveer de helft de klonen van de niet-gecorrigeerde bevolking werd geïsoleerd, werd schrapping mutagenese waargenomen op de doelsite. Aangezien geen vorige verslag heeft aangegeven dat single-stranded oligonucleotides handelend als single-agent gene-bewerkingsgereedschap microdeleties op de doelsite induceren kunnen, we concluderen dat CRISPR/Cas9 activiteit verantwoordelijk voor deze mutaties is.
In dit manuscript bieden wij een gedetailleerde methodologie, zodat genetische heterogeniteit op de doelsite op een betrouwbare en robuuste wijze kan worden gemeten. Terwijl een enorme hoeveelheid aandacht heeft besteed aan de analyse en in kaart brengen van off-site mutagenese, het is waarschijnlijk dat een heterogene mutatie gemaakt op de doelsite een groter effect op het slagen of mislukken van gen bewerken in de klinische arena zal hebben. Het is mogelijk dat aanvullende technologieën of gemodificeerd Cas9 eiwit vereist ter verbetering van de precisie van de homologie-geleide reparatie van aangeboren fouten in zoogdiercellen35. Sommige van deze technologieën omvatten het gebruik van ondersteunende oligonucleotides te fungeren als een brug, de chromosomale einden bij elkaar te houden en het vermijden van de destructieve werking van NHEJ. Vaststelling van de mate van heterogeniteit in de doelsite als gevolg van gen-bewerking activiteit is en moet een belangrijk onderdeel van elk protocol dat is ontworpen voor therapeutische interventie.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs hebben geen bevestigingen.
McCoy’s 5A Modified medium | ATCC | 30-2007 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
L-glutamine | ATCC | 30-2214 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | ATCC | 30-2300 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ATCC | 30-2200 | No Calcium or magnesium |
Trypsin EDTA Solution | ATCC | 30-2101 | |
Aphidicolin 1mg | Thermo Fisher | AC611970010 | |
Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol | IDT | No catalog number since its made to your specific gene target. | |
CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol | IDT | 1072533 | |
S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg | IDT | 1074182 | |
IDTE Buffer | IDT | 11-01-03-01 | |
Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm | VWR | 10497-474 | |
Gene Pulser Xcell Electroporation Systems | BioRad | 1652660 | |
Bovine serum albumin lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE) |
Sigma | 05470-1G | |
EDTA (0.5 M), pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | AM9260G | |
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69581 | |
6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates | VWR | 10062-892 | |
Petri Dishes | Fisher | 12-565-90 | |
Conical Tubes (15 mL) (racked) | Thermo Fisher | AM12500 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |