Denne protokol beskriver arbejdsgangen i et CRISPR/Cas9-baserede gen redigering system til reparation af punktmutationer i pattedyrsceller. Her bruger vi en kombinatorisk tilgang til gen redigering med en detaljeret opfølgende eksperimentelle strategi for måling indel dannelse på destinationsstedet — i det væsentlige, analysere onsite mutagenese.
Kombinatorisk gen redigering bruger CRISPR/Cas9 og enkeltstrenget oligonukleotider er en effektiv strategi for korrektion af enkelt-base punkt mutationer, som ofte er ansvarlig for en lang række menneskelige arvelige sygdomme. Ved hjælp af en veletableret celle-baseret modelsystem, er punkt mutation af en enkelt-kopi mutant eGFP gen integreret i HCT116 celler blevet repareret ved hjælp af denne kombinatorisk tilgang. En analyse af korrigeret og ukorrigeret celler afslører både præcision af gen redigering og udviklingen af genetiske læsioner, når indels er lavet i ukorrigeret celler i DNA-sekvens omkring mål-webstedet. Her, er den specifikke metode brugt til at analysere denne kombinatorisk tilgang til gen redigering af et punkt mutation, kombineret med en detaljeret eksperimentelle strategi at måle indel dannelse på destinationsstedet, skitseret. Denne protokol beskriver en foundational tilgang og arbejdsgangen for undersøgelser med henblik på at udvikle CRISPR/Cas9-baserede gen redigering for behandling af mennesker. Afslutning af dette arbejde er, at ejendommen mutagenese finder sted som følge af CRISPR/Cas9 aktivitet i løbet af processen af punkt mutation reparation. Dette arbejde sætter i stedet en standardiseret metode til at identificere graden af mutagenese, som bør være et vigtigt og afgørende aspekt af enhver tilgang, der er bestemt til klinisk gennemførelse.
Banebrydende undersøgelser af Mandecki (1986) påvist permanente ændringer i plasmid DNA ved hjælp af oligonukleotider omdannet til bakterier1, mens Walder og Walder (1986) foretaget tilsvarende undersøgelser i gær2. Kort tid derefter, offentliggjort Sherman og kolleger en række papirer, hvor enkeltstrenget oligonukleotider indført gærceller foretage arvelige ændringer i gener3. Med udgangspunkt i den skelsættende arbejde i mikrobiel celler, begyndte Kmiec og kolleger at udvikle unikke single-agent oligonukleotider, der rettet enkelt base reparation i pattedyrceller4. Dette koncept var baseret på biokemiske data, der viste, at molekyler bærer RNA binde mere stramt til målwebsted end de består udelukkende af DNA-baser. Selv om der var talrige rapporter om gen-redigering succes ved hjælp af kimære oligonukleotider5,6,7, forblev de redigering niveauer meget varierende mellem eksperimenter og på tværs af forskellige målcellen kombinationer.
Enkeltstrenget donor DNA foretrækkes til dobbelt-strenget donor DNA, fordi det er mindre tilbøjelige til at integrere på tilfældige steder i genomet8. Dog er eksogent indførte enkeltstrenget oligonukleotider udsat for hurtig forringelse af cellulære nukleaser. Flere strategier til at beskytte termini af oligonukleotider fra nedbrydning er blevet ansat. En exonuclease-beskyttet, enkeltstrenget DNA, der indeholder den ønskede sekvens var tilstrækkelig til at opnå en redigering effektivitet i 0,1-1% række6. Forbedret og mere ensartet Transfektion teknikker, kombineret med fænotypisk udlæsninger, tilladt for mere konsekvent, redigering af flere forskning grupper8,9,10,11, 12,13.
I de sidste 10 år, har der været en betydelig indsats for at gøre target-cellerne mere medgørlige gen redigering. Én strategi beskæftiger graduering af cellecyklus14,15,16. Mens redigering frekvenser under normale reaktionsbetingelser med enkeltstrenget oligonukleotider (ssODNs) føres ind i svævede kulturperler pattedyrceller mellem 0,1% og 1%, frekvenserne af genet redigering øget 3 til 5 gange når oligonukleotider blev introduceret i celler under deres overgang gennem S fase. I en særskilt serie af eksperimenter viste Brachman og Kmiec (2005), at relativt høje niveauer af præcise gen redigering (3-5%) blev indhentet når 2’3 ‘ dideoxycytosine (ddC) blev udruget i celler i 24 timer før tilsætning af oligonukleotid17 . ddC reducerer antallet af DNA replikation gaffel bevægelse, tyder på, at genet redigering af ssODNs i replikerende celler sandsynligvis indebærer inkorporeringen af ODNs i regioner af aktiv replikering11,18. Taget sammen, disse undersøgelser førte til det koncept, at donor DNA bliver indarbejdet i en voksende replikering gaffel som en del af den sande virkningsmekanisme af genet redigering, uafhængigt af om en dobbelt-strenget pause er til stede eller ikke19. Således sker korrektion af et punkt mutation eller udskiftning af et segment af DNA i kromosomet via en DNA parring og enkelt-strenget assimilation pathway.
Inducerende tilfældig dobbelt-strenget DNA pauser i voksende celler med små-molekyle agenter skaber et miljø, hvor DNA replikation begivenheder er gået i stå som cellen forsøg på at reparere skader20,21. Denne forbigående nedgang af replikering gafler giver mulighed for en mere effektiv penetration af kromatin struktur af enkeltstrenget redigering oligonukleotider, forbedre målet tilgængelighed15. Oprettelsen af dobbelt-strenget DNA bryder af stoffer som VP16, bleomycin, eller camptothecin22,23, har vist sig at stimulere gen redigering niveauer af næsten 10-fold, op til 6-8%. Men tilfældigt dobbelt-strenget DNA pauser er uønsket i en terapeutisk indstilling.
Gen redigering med programmerbare nukleaser og oligonukleotider er også stimuleret under celledeling24,25. Når nukleinsyre-baserede levering blev brugt til at udføre homologi-instrueret reparation i synkroniseret HCT 116 celler, Rivera-Torres og kolleger vist den samme stigning i målrettet aktivitet når transkription aktivere-lignende effektor nukleaser (TALENs) var beskæftiget med enkeltstrenget oligonukleotider, begge tilføres en replicerer celle befolkning26,27 . For nylig, Bialk og kolleger viste, at reparation af enkelt base mutationer med enkeltstrenget oligonukleotider og en bred vifte af grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentager Cas9 (CRISPR/Cas9) molekyler finder sted med højere effektivitet Hvornår den celle befolkning gennemkører S fase28. CRISPR molekyle består af RNA og funktioner til at identificere region inden for target DNA-sekvens, der er udpeget for kavalergang. Cas9 er en bakteriel enzym, hvis funktion er at kløve dobbelt-strenget DNA i et nucleolytic exchange reaktion. Således CRISPR positioner komplekset genomisk målsystemet, og Cas9 nukleasen udfører dobbelt-strenget pause. Lin et al. (2014) viste også betydningen af cellecyklus for at opnå høje frekvenser af genet redigering, bruger en modificeret CRISPR/Cas9 ribonulceoprotien (RNP) kompleks-medieret leveringssystem i primære neonatal fibroblaster, humane embryonale stamceller, og andre cell linjer24. Forholdet mellem gen redigering og cellecyklus progression til single-agent gen redigering er således gældende for kombinatorisk gen redigering bruger programmerbare nukleaser og donor DNA skabeloner. Mens den kombinatoriske tilgang til gen redigering har samlet en lang række partnere med donor DNA skabelon, bruger de fleste arbejdstagere i feltet CRISPR/Cas9 til at give den dobbelt-strenget pause funktion. Dette valg er baseret på lethed-i-brugen af denne særlige genetiske værktøj og den fleksibilitet, som det kan være ansat til at deaktivere genfunktion eller at indføre en fremmed stykke DNA i et bestemt websted. Generation af en knockout er teknisk lettere i forhold til et gen udskiftning, hvor inkorporering af “korrekte” eller normale kopier af et gen i webstedet sygdom skal udføres med præcision. En række forskere at identificere og studere brugen af specifikke lægemidler og reagenser, der aktiverer korrektion af mutant baser og indsættelse af normale genetiske sekvenser i den korrekte position på forhøjede frekvenser29.
For nylig, Rivera-Torres et al. 30 brugt kombinatorisk gen redigering, at drage fordel af den dobbelt-strenget pauseaktivitet af et specielt designet CRISPR/Cas9-system og af genetiske oplysninger fra et enkeltstrenget oligonukleotid donor DNA skabelon, at reparere en punkt mutation i etenkelt kopi af forbedrede grøn fluorescerende proteiner (eGFP) genet integreret i HCT116 celler. At forfatterne benyttede sig af denne godt karakteriseret model cellelinie at vurdere specificiteten af kavalergang omkring mål-webstedet. Dataene, der afslører heterogenitet på målwebstedet findes især i celler, der ikke indeholder en korrigeret punkt mutation. I dette manuskript, vi detalje og fokusere på den metode, der bruges af disse arbejdstagere til at undersøge ejendommen mutationsmønstre heterogenitet lavet af CRISPR/Cas9 gen redigering.
Gen redigering er blevet mainstream videnskabelig disciplin primært på grund af fremkomsten af CRISPR/Cas9-system. Denne bemærkelsesværdige pathway, som letter adoptiv immunitet i bakterieceller, har været repurposed som en molekylær værktøj hen til muliggøre genomisk ændring i menneskelige kromosomer. CRISPR/Cas9 naturlige funktion er at forhindre virale DNA ved at indføre dobbelt-strenget DNA pauser fører til fragmenteringen30,31. Denne aktivitet resulterer i ødelæggelse af invaderende eksogene DNA og fører til prokaryote immunitet, der undertrykker efterfølgende infektion ved den samme viral partikel. Utroligt, dette system udstiller lungerne adfærd, idet det kan genaktivere specifikke CRISPR gRNA lavet af tidligere infektion begivenheder.
Effektiviteten og nøjagtigheden af genet forstyrrelser katalyseret af CRISPR/Cas9 har været brugt i mange eukaryote genetiske systemer hvor målet var at forhindre en fungerende gen32,33. Når reduceret til dens basale niveau, består processen af to grundlæggende skridt. Først er en dobbelt-strenget pause, mens andet er baseret på de iboende proces af ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) for at fuldføre knockout. I de fleste tilfælde, de dobbelt-strenget pause resultater i skabelsen af blunt-ended, uengagerede kromosomale segmenter og enzymer involveret i NHEJ reagere på den kromosomale pause og handle for at forbinde brudt enderne. Denne proces kan undertiden indebære tab af individuelle nukleotider på webstedet afhuggede. Tabet af endnu et par baser kan forårsage en frameshift, og funktionelle udtryk ophører. Brug af CRISPR/Cas9 at skabe genetisk knockout af engagerende den naturlige proces af NHEJ har revolutioneret Eukaryot genetik; tabet af DNA på målwebstedet er både forudsigelig og forventede.
I modsætning til gen knockout, har en række forskere været engageret i forsøget på at omdirigere og genbruge CRISPR/Cas9 aktivitet mod processen med homologi-instrueret reparation. Formålet med undersøgelserne er gen korrektion. I denne strategi, er CRISPR/Cas9 kombineret med en donor DNA-skabelon, der indeholder genetiske oplysninger, til at reparere en medfødt fejl eller til at indsætte mutationer i sund gener. Tidlige rapporter fremhæve CRISPR/Cas9 bemærkelsesværdig evne til at katalysere homologi-instrueret reparation angivet (direkte eller indirekte) at processen opstod i en meget præcis mode24,34. Vores laboratorium har studeret homologi-instrueret reparation eller gen korrektionen ved hjælp af enkeltstrenget oligonukleotider i et forsøg på at definere mekanisme og regulerende kredsløb omkring det15,17,18 ,23. Vi har fokuseret primært på genet redigering enkelt punkt mutationer, da dette er den mest grundlæggende genetiske mutation kendt for at være ansvarlig for mange arvelige sygdomme. Vores grundlæggende viden om gen redigering førte os at sætte spørgsmålstegn ved nøjagtigheden af CRISPR/Cas9 aktivitet i disse reaktioner, siden CRISPR/Cas9 funktion i gen knockout resulterer i dannelsen af indels. Vi brugte en veldefineret modelsystem, snarere end en ikke-valgbar endnu klinisk relevante gen, for at studere on-site mutagenese i en decideret reduktionistiske mode. Ved hjælp af et simpelt mål gen, ved hvilken gene korrektion kan måles på begge genotypiske og fænotypiske niveauer, begrundet vi at heterogenitet forekommende på destinationsstedet kunne identificeres på en pålidelig og robust måde.
Vores data bekræfter, at det veletablerede gen redigering system, bestående af en mutant eGFP gen integreret i HCT116 celler, kan give grundlæggende oplysninger om generation over genetiske læsioner og processen med on-site mutagenese. CRISPR/Cas9 og enkeltstrenget oligonukleotid donor DNA molekyler arbejder i tandem kan føre til den præcise reparation af punkt mutation i eGFP-genet. Vi foreslår en ny model for reparation af punktmutationer, en molekylær pathway som donor-DNA fungerer som en replikering skabelon til reparation af mutant basen, en proces, vi har kaldt nøjagtige30. Målgruppen, ikke udviser den korrigerede fænotype, viser en bred vifte af celler der indeholder heterogene og bredt spænder DNA indels omkring mål-webstedet. I cirka halvdelen kloner isoleret fra befolkningens ukorrigeret, blev sletning mutagenese observeret på destinationsstedet. Da ingen tidligere betænkning har tilkendegivet, at enkeltstrenget oligonukleotider fungerer som enkelt-agent gen-redigeringsværktøjer kan fremkalde indels på destinationsstedet, vi konkludere, at CRISPR/Cas9 aktivitet er ansvarlig for disse mutationer.
I dette manuskript leverer vi en detaljeret metode, så genetisk heterogenitet på mål-webstedet kan måles på en pålidelig og robust måde. Mens en enorm mængde af opmærksomhed er blevet betalt til analysen og kortlægning af off-site mutagenese, er det sandsynligt, at en heterogen mutation lavet på mål-webstedet vil have en større effekt på succes eller fiasko af genet redigering i den kliniske arena. Yderligere teknologier eller modificerede Cas9 proteiner kan være nødvendig at forbedre præcisionen af homologi-instrueret reparation af medfødte fejl i pattedyrceller35. Nogle af disse teknologier omfatter brugen af hjælpeansatte oligonukleotider til at fungere som en bro, holde de kromosomale ender sammen og at undgå den ødelæggende virkning af NHEJ. Definere graden af heterogenitet på målwebstedet som følge af gen-redigering aktivitet er og skal være en vigtig del af enhver protokol designet for terapeutisk intervention.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne har ingen anerkendelser.
McCoy’s 5A Modified medium | ATCC | 30-2007 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
L-glutamine | ATCC | 30-2214 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | ATCC | 30-2300 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ATCC | 30-2200 | No Calcium or magnesium |
Trypsin EDTA Solution | ATCC | 30-2101 | |
Aphidicolin 1mg | Thermo Fisher | AC611970010 | |
Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol | IDT | No catalog number since its made to your specific gene target. | |
CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol | IDT | 1072533 | |
S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg | IDT | 1074182 | |
IDTE Buffer | IDT | 11-01-03-01 | |
Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm | VWR | 10497-474 | |
Gene Pulser Xcell Electroporation Systems | BioRad | 1652660 | |
Bovine serum albumin lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE) |
Sigma | 05470-1G | |
EDTA (0.5 M), pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | AM9260G | |
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69581 | |
6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates | VWR | 10062-892 | |
Petri Dishes | Fisher | 12-565-90 | |
Conical Tubes (15 mL) (racked) | Thermo Fisher | AM12500 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |