Summary
Denne protokollen beskriver arbeidsflyten med et CRISPR/Cas9-basert redigering system for reparasjon av punkt mutasjoner i pattedyrceller. Her bruker vi en kombinasjon tilnærming til genet redigering med en detaljert etterarbeid eksperimentelle strategi for å måle indel formasjon på målområdet-i hovedsak analysere stedet mutagenese.
Abstract
Kombinasjon genet redigering med CRISPR/Cas9 og enkelt-strandet oligonucleotides er en effektiv strategi for korrigering av ett-base punkt mutasjoner, som ofte er ansvarlig for en rekke menneskelige arvet lidelser. Bruker en veletablert cellen-basert modell, er punkt mutasjon med et enkelt-kopi mutant eGFP integrert i HCT116 celler reparert bruker denne kombinasjon. Analyse av korrigert og uncorrected celler avslører både presisjonen av genet redigering og utvikling av genetiske lesjoner, når indeler opprettes i uncorrected celler i DNA sekvensen rundt målområdet. Her, markeres bestemte metodene som er brukt til å analysere denne kombinasjon tilnærming til genet redigering av en punkt mutasjon, kombinert med en detaljert eksperimentelle strategi for å måle indel formasjon på målområdet. Denne protokollen skisserer en grunnleggende tilnærming og arbeidsflyt for undersøkelser rettet mot utvikling av CRISPR/Cas9-baserte genet redigering for menneskelig behandling. Konklusjonen av dette arbeidet er som stedets mutagenese foregår som følge av CRISPR/Cas9 aktivitet under prosessen med punkt mutasjon reparasjon. Dette arbeidet setter på plass en standardisert metode for å identifisere graden av mutagenese, som bør være en viktig og kritisk del av alle tilnærming til kliniske implementering.
Introduction
Banebrytende studier av Mandecki (1986) vist permanente endringer i plasmider DNA oligonucleotides forvandlet til bakterier1, mens Walder og Walder (1986) utført lignende studier i gjær2. Kort tid etter publiserte Sherman og kolleger en serie artikler som enkelt-strandet oligonucleotides introdusert i gjærceller gjøre arvelige endringer i gener3. Bygge på banebrytende arbeidet i mikrobiell celler, begynte Kmiec og kolleger å utvikle unike single-agent oligonucleotides instruert enkelt base reparasjon i pattedyrceller4. Dette konseptet ble basert på biokjemiske data som viste at molekyler bærer RNA binde tettere til målområdet enn de består utelukkende av DNA baser. Selv om det var mange rapporter om gen-redigering suksess med chimeric oligonucleotides5,6,7, var redigering nivåene svært variabel mellom eksperimenter og annen målcellen kombinasjoner.
Single-strandet donor DNA er foretrukket å double-strandet donor DNA fordi det er mindre sannsynlig å integrere tilfeldig områder i genomet8. Exogenously introdusert single-strandet oligonucleotides er imidlertid utsatt for rask nedbrytning av mobilnettet nucleases. Flere strategier for å beskytte termini av oligonucleotides fra fornedrelse har vært ansatt. En exonuclease-beskyttet, enkelt-strandet DNA som inneholder ønsket sekvensen var tilstrekkelig for å oppnå en redigering effektivitet i 0,1-1% rekkevidde6. Forbedret og mer konsekvent transfection teknikker, kombinert med fenotypiske readouts, tillot mer konsekvent redigering av flere forskning grupper8,9,10,11, 12,13.
De siste 10 årene, har det vært en betydelig innsats for å gjøre målcellene mer mottakelig for genet redigering. En strategi sysselsetter modulering av cellen syklus14,15,16. Mens redigering frekvenser under normal reaksjon forhold med enkelt-strandet oligonucleotides (ssODNs) innført i svevde kulturperler pattedyrceller mellom 0,1% til 1% frekvenser av genet redigering økt 3 - til 5 ganger når oligonucleotides introdusert i celler under overgangen S fasen. I en egen serie eksperimenter viste Brachman og Kmiec (2005) at relativt høye nivåer av presise genet redigering (3-5%) ble oppnådd når 2'3 ' dideoxycytosine (ddC) var ruges i celler for 24 timer før tilsetning av oligonucleotide17 . ddC reduserer hastigheten på DNA replikering gaffel bevegelse, noe som tyder på at genet redigering av ssODNs i replikere celler sannsynlig innebærer inkorporering av ODNs i regioner aktive replikering11,18. Til sammen disse studiene førte til konseptet at donor DNA blir innlemmet i en voksende replikering gaffel som en del av sant virkningsmekanismen av genet redigering, uavhengig av om en double-strandet pause finnes eller ikke19. Dermed skjer korreksjon av en punkt mutasjon eller utskifting av et segment av DNA i kromosomet via en DNA sammenkoblingen og enkelt-strand assimilering sti.
Inducing tilfeldig double-strandet DNA pauser i voksende celler med små molekyl agenter skaper et miljø der DNA replikering hendelser er stoppet som cellen forsøker å reparere skade20,21. Denne forbigående slowdown av replikering gafler kan en mer effektiv gjennomtrengning av chromatin av enkelt-strandet redigering oligonucleotides, bedre mål tilgjengelighet15. Etableringen av double-strandet DNA bryter av stoffer som VP16, bleomycin, eller camptothecin22,23, har vist seg å stimulere genet redigering nivåer av nesten 10-fold opptil 6-8%. Men er tilfeldig double-strandet DNA pauser uønsket i en terapeutisk innstilling.
Gene redigering med programmerbare nucleases og oligonucleotides er også stimulert under celledeling24,25. Når nukleinsyre basert levering ble brukt til å utføre homologi-rettet reparasjon i synkroniserte HCT 116 celler, Rivera-Torres og kolleger vist den samme økningen i rettet mot aktivitet når transkripsjon aktivator som effektor nucleases (TALENs) ble ansatt med enkelt-strandet oligonucleotides, begge introdusert i en etterligner celle befolkningen26,27 . Flere nylig, Bialk og kolleger viste at reparasjon av enkelt base mutasjoner med enkelt-strandet oligonucleotides og en rekke gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar Cas9 (CRISPR/Cas9) molekyler foregår med høyere effekt Når celle befolkningen er traversering S fase28. CRISPR molekylet består av RNA og funksjoner for å identifisere området i målet DNA sekvensen som er ment for spalting. Cas9 er en bakteriell enzym hvis funksjon er å holde seg double-strandet DNA i en nucleolytic exchange reaksjon. Dermed CRISPR posisjoner komplekset på genomisk målet, og Cas9 nuclease utfører double-strandet pause. Lin et al. (2014) også vist betydningen av cellen syklus for å oppnå høye frekvenser av genet redigering, med en modifisert CRISPR/Cas9 ribonulceoprotien (RNP) kompleks-mediert leveringssystem i primære neonatal fibroblaster, menneskelige embryonale stamceller, og andre cellen linjer24. Dermed gjelder forholdet mellom genet redigering og celle syklus progresjon for single-agent gen redigering kombinasjon genet redigering med programmerbare nucleases og donor DNA maler. Mens kombinasjon tilnærming til genet redigering har samlet en rekke partnere med donor DNA malen, bruker de fleste arbeidere i feltet CRISPR/Cas9 for å gi funksjonen double-strandet pause. Dette valget forutsetter ved den lette-av-bruken dette bestemt genetisk verktøyet og fleksibilitet som det kan være ansatt deaktivere gen funksjon eller innføre en fremmed stykke DNA i et bestemt område. Generering av en knockout er teknisk enklere sammenlignet en genet erstatning, der kommisjonsforordning "riktig" eller normal eksemplarer av et gen sykdom området må utføres med presisjon. Flere forskere er identifisere og studerer bruk av spesifikke medikamenter og reagensene som aktiverer korreksjon av mutant baser og innsetting av normal genetiske sekvenser som er riktig plassert på forhøyet frekvenser29.
Nylig Rivera-Torres et al. 30 brukes kombinasjon genet redigering, utnytter double-strandet pause aktiviteten til en spesialdesignet CRISPR/Cas9 og genetiske informasjonen fra en enkelt-strandet oligonucleotide donor DNA-mal, reparere en punkt mutasjon i enkopi av forbedret grønne fluorescerende protein (eGFP) genet integrert i HCT116 celler. Forfatterne tok fordel av dette godt karakterisert modell celle linje evaluere spesifisitet cleavage rundt målområdet. Dataene avslører at heterogenitet på målområdet finnes, særlig i celler som ikke inneholder en korrigert punkt mutasjon. I dette manuskriptet vi detalj og fokusere på metodikken brukt av disse arbeiderne for å undersøke stedet mutational heterogenitet skapt av CRISPR/Cas9 gene redigering.
Protocol
følgende protokollen innebærer å arbeide med pattedyrceller; kjennskap steril teknikk/cellekultur forventes.
1. celle linje og oppdrettsforholdene
- gjøre 500 mL av medium for kultur HCT 116 celler: McCoy ' s 5A endret medium med 10% fosterets bovin serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 1% penicillin (dette er fullført middels).
Merk: Vokse HCT 116-19 celler i en T-75 eller T-175 kolbe før plating. Når 90% confluent, hver T-75 kolbe vil gi 8.4 x 10 6 celler, omtrent fem 10-cm plater, og hver T-175 vil gi 18.4 x 10 6 celler, omtrent femten 10 cm plater.
2. Høste celler fra kolbe
- Sug opp unna medium, vask med Dulbecco ' s Phosphate-Buffered Saline uten kalsium og magniesium (PBS) (10 mL T-75 eller 25 mL for T-175) og leveringstanken.
- Legg til trypsin dropwise til flasken med en 2-mL pipette (2 mL T-175 eller 1 mL for T-75). Plasser flasken i en inkubator på 37 ° C og 5% CO 2 i 5 min til at cellene å løsne.
- Trykk kolbe til alle celler er forskyves og deretter slukke med komplett medium ved å spre det over hele overflaten av flasken (8 mL T-175 eller 4 mL T-75) at.
- Pipette opp og ned flere ganger å bryte opp cellen klumper og overføre cellene til en 15-mL konisk tube
- Før spinning cellene ned, ta 10 µL fra 15-mL koniske og kombinere det med 10 µL av trypan blå telle celler. Pellets cellene av snurrende etter 5 min på 125 x g og 16 ° C.
3. Teller cellene
- overføre 10 µL av cellene blandet med trypan blå til hemocytometer. Antall 4 rutenett rundt utsiden (hver rute inneholder 16 torg).
- Tar det gjennomsnittlig celletall fra hvert sett av seksten hjørnet.
- Multiplisere med 10.000 (10 4).
- Multiplisere med det totale volumet av mediet som brukes til å høste celler korrigere fortynning fra trypan blå tillegg.
Merk: Ligningen formatet å beregne volumet for å resuspend cellene følger:
4. Kontaktflate cellene
- For hver 10 cm plate celleområde som skal synkroniseres, legge 5 mL av komplett medium og 6 µM av aphidicholin (12 µL av en 2,5 mM aksjer i 200-bevis etanol).
- Overføre 100 µL re suspendert cellen pellets, 2,5 x 10 6 celler, hvert 10 cm plate og virvel forsiktig å blande.
- Ruge platene på 37 ° C og 5% CO 2 16-24 h å synkronisere celler på G1/S grensen.
5. Frigi cellene fra Aphidicolin synkronisering
- 4 h før målretting, Sug opp mediet, vask med PBS, Sug opp PBS og legge 5 mL av komplett medium
- Sett den tilbake i inkubator på 37 ° C og 5% CO 2 4 h
6. RNA Complexing
- Enter mutant eGFP gene sekvensen til Zhang laboratoriet ' s online generator 25 (http:// crispr.mit.edu/) og velg CRISPR guiden sekvenser som binder med nærhet til målområdet. Få den CRISPR veiledningen sekvenser fra en kommersiell kilde.
- Lagre CRISPR RNA (crRNA), trans-aktivering crRNA (tracrRNA) og Cas9 proteiner til 20 ° C og bruke ifølge produsenten forslag.
- Blanding av RNA i ekvimolare konsentrasjoner til 45 µM. legge til 6,75 µL av en 200 µM lager av crRNA og 6.75 µL av en 200 µM lager av tracrRNA til en 1.5-mL sentrifuge tube. Legge til 16.50 µL av TE Buffer å gjøre en siste bind i 30 µL.
- Varme ved 95 ° C i 5 min med a varme blokk eller PCR.
Forsiktig: Hot! - La avkjøles til romtemperatur.
Merk: Hvis bruker en PCR-maskin, sette kjøling 0,2 ° c/s. - Utføre følgende trinn for hvert utvalg.
- Fortynne 2.22 µL av crRNA:tracrRNA i 2.78 µL av TE Buffer (10 mM Tris, pH 8.0 og 0,1 mM EDTA, pH 8.0) til et endelig antall 5 µL.
- Fortynne 1,67 µL Cas9 protein fra en 60 µM aksjer i 3,33 µL av lav-serum medium til siste volumet av 5 µL.
- Mix 5 µL Cas9 protein med 5 µL av kompleksbundet
7. Høsting cellene for målretting
- leveringstanken medium, vask med 5 mL PBS, Sug opp PBS, og Legg til 1 mL av forvarmes trypsin hver 10cm plate. Sette platene i kuvøse på 37 ° C og 5% CO 2 i 5 min.
- Trykk på 10 cm plate alle celler er forskyves og deretter slukke med 4 mL komplett medium ved å spre det over hele overflaten av platen.
- Pipette opp og ned flere ganger å bryte opp cellen klumper og overføre cellene til en 15-mL konisk tube.
- Før spinning cellene ned, ta 10 µL fra 15-mL konisk røret og kombinere det med 10 µL av trypan blå telle celler. Pellets cellene av snurrende etter 5 min på 125 x g og romtemperatur.
- Sug opp mediet og vask med 5 mL PBS. Pellets cellene av snurrende 125 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
8. Teller cellene
- overføre 10 µL av cellene blandet med trypan blå til hemocytometer. Antall 4 rutenett rundt utsiden (hver rute inneholder seksten ruter).
- Tar det gjennomsnittlig celletall fra hvert sett av seksten hjørnet.
- Multiplisere med 10.000 (10 4).
- Multiplisere med det totale volumet av mediet som brukes til å høste celler korrigere fortynning fra trypan blå tillegg.
Merk: Følgende er ligningen formatet å beregne volumet for å resuspend cellene. Nytt suspendere antall celler i serum-free McCoy ' s 5A endret medium.
9. målretting prøver
- overføre 100 µL av cellen suspensjon (5 x 10 5 celler) fra trinn 8.1 til hver electroporation 4 mm gapet cuvette. Legge til 10 µL av RNP komplekse fra trinn 6.7 til 100 µL av celler på en 5 x 10 5 celle tetthet. Legge til ODN (2 µM) til hvert utvalg.
Merk: For en positiv kontroll, legge 1 µL av eGFP på 1 µg/µL uttrykke plasmider- ta stativet til en electroporation maskin, lett flick hvert utvalg og plassere dem i kammeret. Electroporate på 250 V, LV; 2 pulser, 1 s; 13 ms; Unipolare puls.
- Overføre stativet tilbake til panseret. Overføre hvert utvalg til et godt med 2 mL komplett medium jegn en 6-vel plate. Ruge på 37 ° C og 5% CO 2 72 h før du sjekker for korreksjon nivåer.
10. Analyse av Gene endret celler og Transfection effektivitet
- Sug opp mediet og vaske cellene med 2 mL PBS. Sug opp PBS og legge 500 µL av forvarmes trypsin hver brønn av 6-vel plate. Sette platene i kuvøse på 37 ° C og 5% CO 2 i 5 min.
- Trykk platen til Kontroller alle cellene er forskyves og deretter slukke med 1 mL av komplett medium ved å spre det over hele overflaten av brønnen.
- Pass cellene i en 1.5-mL sentrifuge rør og pellets 5000 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Sug opp mediet. Nytt avbryte celle pellet 500 µL av FACS buffer (0,5% BSA, 2 mM EDTA og 2 µg/mL propidium iodide i PBS).
- Måle celle fluorescens (eGFP +) av flowcytometri.
- Beregne korreksjon effektiviteten som en prosent av de totale lever eGFP-positive cellene det totale antallet lever celler i hver prøve, som beskrevet i Rivera Torres et al 30.
11. DNA Sequence Analysis
- Electroporate synkronisert og utgitt HCT 116-19 celler i en konsentrasjon av 5 x 10 5 celler/100 µL, med RNP complex på 100 pmols og 72NT ODN på 2,0 µM.
- Overføre cellene til 6-vel plater og tillate dem å gjenopprette for 72 h.
- Sortere cellene enkeltvis i 96-brønnen platene FACS sortering med en 488-nm (100 mw) laser for eGFP +/-, som beskrevet i Rivera-Torres et al 30.
Merk: Ikke alle brønner vil kunne vokse. - Utvider cellene over 6 uker og høste som beskrevet i trinn 7.
- Fra brønnene som har vekst, isolere mobilnettet gDNA ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig DNA isolering kit (se Tabell for materiale) og forsterke regionen rundt målet base via PCR (718 bp; frem primer 5 '- ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ' og reversere primer 5 ' - ACTTGTACAGCTCGTCCATGC - 3 ').
- Utfører DNA sekvensering analyse på prøvene.
Representative Results
Vi brukte et modellsystem for å studere genet redigering i pattedyrceller, som avhenger korreksjon av en punkt mutasjon i eGFP genet integrert som en kopi i HCT116 celler. Det er viktig å merke seg at dette er et enkelt-kopi gen; derfor gjøres mindre komplisert utsikt DNA endringer eller mutagenese. Figur 1A viser mutant eGFP gene sekvensen med målrettet base, den tredje basen av stopp codon TAG, uthevet i rødt. 72-base-oligonucleotide, som er delvis utfyllende til den ikke-transkribert stranden av eGFP genet (72NT) og er utformet for å indusere base utveksling fra en G til en C, er også illustrert. I tillegg er en CRISPR, angitt som 2C, med den angitte protospacer sekvensen i en 5' til 3 orientering, også avbildet i figur 1A. For å gjennomføre denne gen-redigering reaksjonen, vi brukte en ribonucleoprotein (RNP) som består av CRISPR (cr) RNA og tracr (tr) RNA kombinert renset Cas9 protein (figur 1B), i stedet for et pattedyr uttrykk vektor bestående av Cas9 genet og riktig spesifikk veiledning RNA sekvens.
Når spesialdesignet RNP partikkel leveres med enkelt-strandet oligonucleotide i HCT116 celler av electroporation, gene redigering, dokumentert av reparasjon av enkelt base mutasjon i eGFP, er observert etter 72 timer med inkubering ved hjelp av en flyt cytometer. Funksjonell reparasjon er av fremveksten av grønne fluorescens i målrettede celler, celler som kan også skilles fra hele befolkningen med sortering på grunn av denne fluorescens. Som vist i figur 2, kan gradvis dose svar sees som koordinerte nivåer av RNP og 72NT øker. Molekylær forholdet, picomoles av RNP, og micromolar konsentrasjon av 72NT som vist i figuren, er basert på optimal dosering brukes i genet-redigering reaksjoner som er avhengige av innføringen av Cas9 og bestemt guide RNA fra transfekterte uttrykk vektorer. Rammemargen i figur 2 viser en gen-redigering reaksjon i fravær av RNP partikkel. Her er ca 1% av målrettet cellene korrigert når en 10 ganger høyere konsentrasjon av 72NT oligonucleotide brukes i single-agent gen-redigering reaksjonen.
For å fastslå om det finnes genetisk heterogenitet på mål nettsted-den såkalte på stedet mutagenese effekten-vi besluttet å undersøke resultatet av genet redigering aktivitet i enkeltceller. Mens mye mer arbeidskrevende enn å undersøke den totale befolkningen, en ekte mål på genetisk fotavtrykk eller lesjoner kan ascertained når genomet av clonally utvidet celler er undersøkt. Vi gjentok eksperimentet beskrevet i figur 2, denne gangen bare bruker 100 pmol av RNP komplekse og 2.0 µmol av 72NT oligonucleotide. Som ble ovenfor, HCT 116 celler synkronisert for 24 timer med aphidicholine og arrestert på G1/S grensen. 4 h etterpå, cellene ble utgitt og gen-redigeringsverktøy ble introdusert av electroporation. 72 h senere cellene ble analysert bruker FACS og sortert individuelt i 96-brønnen plater (eksperimentell prosessen er illustrert i Figur 3). Celler viser grønne fluorescens ble sortert etter flowcytometri i individuelle brønner av en 96-brønns plate for klonal ekspansjon. Viktigere, var celler mangler eGFP uttrykk også isolert og sortert på en lignende måte for utvidelse under like forhold.
Etter 14 dager med vekst, hadde de fleste individuelle kloner utvidet tilstrekkelig for å aktivere DNA isolasjon. Som sådan, 16 kloner av eGFP-positive prøvene ble valgt, og genetisk integriteten rundt målområdet ble analysert av DNA sekvensering. Informasjon omkring DNA sekvensen av alleler i befolkningen ble generert ved hjelp av Sanger sekvensering, sammen med sekvensen visualisering programvare for å sammenligne sekvensen av en wildtype allelet (figur 4A). Kutt området av RNP komplekset angis med en svart pil, ligger på grønne bar (2C crRNA). Som også vist i figur 4Ainneholder alle 16 eGFP-positive celler spådd nukleotid utveksling på målområdet. Konverterte C rester er uthevet i rødt, og topp profilen reflekterer presis endringen er gitt under eGFP-positive sekvensen. På en lignende måte, 15 ikke-grønne klonal isolerer tilstrekkelig utvidet for å aktivere DNA utvinning og sekvensering, ble analysert for heterogenitet på målområdet. Som spådd, i ca halv prøvene, ble ingen DNA base exchange observert. Dette gjenspeiles i vedlikehold av G rester på målområdet, som vist i figur 4B. Resten av klonal utvidelser undersøkt i disse eksperimentene vises en heterogen befolkning av sletting mutasjoner, derfor regnskap for mangel på grønne fluorescens. Sletting størrelsen varierte fra en base til 19 baser. Det er viktig å merke seg at vi har bare undersøkt 15 prøver av eGFP-positive cellene, og mens vi tror at dette er ganske representant av genetisk lesjoner etterlatt av CRISPR/Cas9 aktivitet, det er en mulighet som andre typer eller typer indeler kan være tilstede i befolkningen målrettet.
Resultatene vises i Figur 4 sammen og bekrefte er fenotypiske avlesning i eGFP målretting system. Konvertering av G til C nukleotid kan fremveksten av grønne fluorescens i korrigert HCT116 celler. Ingen base utskifting rundt målområdet er observert i kloner isolert for dette eksperimentet eller forrige eksperimenter27,28. Dataene viser også at cellene ikke å gjennomgå genet redigering via punkt-mutasjon reparasjon forbli uncorrected, men i noen tilfeller, ikke uendret, med en rekke genetisk heterogenitet rundt målområdet.
Figur 1. (A) modellsystem for genet redigering av genet muterte eGFP. De riktige segmentene av wildtype og muterte eGFP gen med målrettet codon, ligger i sentrum av sekvensen, vises i grønt og rødt, henholdsvis. Nukleotid mål for exchange er fet og understreket. Merket baser i blå representerer 2C CRISPR protospacer sekvensen, og oransje baser markere området PAM. Oligonucleotide brukes i disse eksperimentene er 72 baser i lengde, bærer phosphorothioate endret sammenhengene på tre terminal baser; 72-mer mål den ikke-transkribert (NT) stranden (72NT). (B) CRISPR/Cas9ribonucleoprotein montering reaksjon. crRNA gir målet spesifisitet (20 baser, røde inndelingen) tilsvarer 2C protospacer sekvensen og et samspill domene (blå) med tracrRNA (grønn). crRNA og tracrRNA er herdet i ekvimolare konsentrasjoner. Cas9 protein (grå) legges til komplett RNP samlingen. Guide RNAs (gRNAs) direkte og aktivere Cas9 endonuclease, som deretter cleave målet DNA. Den nedre delen av figuren viser 2C frø sekvensen og tracrRNA sekvensen. Dette tallet ble endret fra Rivera-Torres, N. et al. (2017). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Genet redigering er doseavhengig når regissert av RNP og ssODN. Synkronisert og utgitt HCT 116-19 celler var electroporated med 24-120 pmol av CRISPR/Cas9 RNP og 0.6-3.0 µM av 72mer. Etter en 72-h restitusjonsperiode, ble gen-redigering aktivitet målt ved hjelp av en flow cytometer. Gene redigering vises som korreksjon effektiviteten (%), bestemmes av antall levedyktig eGFP-positive celler delt på totalt antall levedyktige cellers i befolkningen. Feilfelt produseres fra tre sett med datapunkter generert over tre separate forsøk bruke grunnleggende beregninger av standardfeil. Innfelt: Single-agent gen redigering. Gene-redigering aktiviteten regissert av enkelt-strandet oligonucleotide (72NT) i fravær av RNP komplekse under like presenteres som en funksjon for å øke konsentrasjonen. Dette tallet ble endret fra Rivera-Torres, N. et al. (2017). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Eksperimentell strategi for isolering av encellede kloner. Celler viser eGFP uttrykket ble scoret som positive og sortert med en flyt cytometer som enkeltceller i individuelle brønner for klonal ekspansjon. Celler mangler eGFP uttrykk ble isolert og sortert på en lignende måte og utvidet under like forhold. DNA var så isolert og eGFP genet ble forsterket og utsatt for Sanger sekvensering å analysere gen-redigering aktivitet rundt målområdet. Dette tallet ble endret fra Rivera-Torres, N. et al. (2017). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. (A) allel analyse av eGFP-positive celler utvidet som en klonal populasjon. Isolert clonally og utvidet eGFP-positive eksempler (seksten kloner) ble analysert på området rundt målrettet base og DNA fra hver høstet, renset, forsterket og sekvensielt. Allel analyse ble gjennomført med Sanger sekvensering, sammen med sekvensen visualisering programvare og forhold til rekkefølgen av en wildtype allelet, noe som illustreres på toppen av figuren. Kutt området av RNP komplekset er angitt som en liten svart pil finnes på grønt stang (2C crRNA). (B) Allel analyse av eGFP-negativ celler utvidet som en klonal populasjon. Femten personlige prøver, utvidet fra kloner fra uncorrected befolkningen, var tilfeldig valgt og analysert for indel formasjon på området rundt målet nukleotid. Som ble ovenfor, allel analyse gjennomført med Sanger sekvensering og sammen med en sekvens visualisering programvare. Igjen, rekkefølgen av en wildtype allelet øverst i figuren, sammen med kutt området av RNP, presenteres. Dette tallet ble endret fra Rivera-Torres, N. et al. (2017). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Gene redigering har dukket opp som en vanlig vitenskapelig disiplin, hovedsakelig på grunn av fremveksten av CRISPR/Cas9. Denne bemerkelsesverdige veien, som muliggjør adoptivforeldre immunitet i bakterielle celler, har blitt repurposed som molekylære verktøy aktiverer genomisk endring i menneskelig kromosomer. CRISPR/Cas9 naturlige funksjon er å deaktivere virus-DNA ved å innføre double-strandet DNA bryter fører til fragmentering30,31. Denne aktiviteten ødelegges av invaderende eksogene DNA og fører til prokaryote immunitet som undertrykker påfølgende infeksjon av samme viral partikkel. Utrolig, dette systemet har pneumonic virkemåte, i at det kan aktivere bestemte CRISPR gRNA opprettet av tidligere infeksjon hendelser.
Effektivitet og nøyaktighet av genet forstyrrelser katalysert av CRISPR/Cas9 har blitt brukt i mange eukaryote genetiske systemer der målet var å deaktivere en fungerende genet32,33. Når redusert til basale nivået, består prosessen av to grunnleggende trinn. Først er en dobbel-strandet pause, mens andre er avhengig av iboende prosessen med ikke-homologe slutten med (NHEJ) for å fullføre knockout. I de fleste tilfeller, double-strandet pause resultatene i etableringen av Butt-slutt, fri chromosomal segmenter og enzymer som er involvert i NHEJ reagerer på chromosomal pause og handle for å conjoin brutt endene. Denne prosessen kan noen ganger innebære tap av personlige nukleotider på webområdet kuttet. Tapet av et par baser kan føre en frameshift, og funksjonelle uttrykk slutter. Bruk av CRISPR/Cas9 opprette genetisk knockout ved å engasjere de naturlige prosessen med NHEJ har revolusjonert eukaryote Genetikk; tap av DNA på målområdet er både forutsigbar og forventet.
I motsetning til genet knockout, har mange forskere vært engasjert i forsøk på å omdirigere og gjenbruke CRISPR/Cas9 aktivitet mot prosessen med homologi-rettet reparasjon. Målet med studiene er genet korreksjon. I denne strategien, er CRISPR/Cas9 kombinert med en mal for giver-DNA som inneholder genetisk informasjon å reparere feil medfødt eller mutasjoner inn sunn gener. Tidlige rapporter utheving bemerkelsesverdig kapasiteten til CRISPR/Cas9 å katalysere homologi-rettet reparasjon angitt (direkte eller indirekte) at prosessen skjedde i en svært presis mote24,34. Vårt laboratorium har studert homologi-rettet reparasjon eller genet korrigering ved hjelp av én-strandet oligonucleotides i et forsøk på å definere mekanisme og regulatoriske kretser rundt15,17,18 ,23. Vi har fokusert primært på genet redigering enkelt punkt mutasjoner, siden dette er den mest grunnleggende genetisk mutasjonen kjent for å være ansvarlig for mange arvet lidelser. Vår grunnleggende kunnskap om genet redigering førte oss til spørsmålet presisjonen i CRISPR/Cas9 aktivitet i disse reaksjonene, siden funksjonen CRISPR/Cas9 i genet knockout fører til dannelsen av indeler. Vi brukte en veldefinert modellsystem, i stedet for en ikke-valgbar men klinisk relevante genet, for å studere på stedet mutagenese i en desidert reduksjonistiske mote. Ved hjelp av et enkelt mål gen, på hvilket gen korreksjon kan måles på både genotypic og fenotypiske nivå, tenkte vi at heterogenitet på målområdet kan identifiseres på en pålitelig og robust måte.
Våre data bekrefter at veletablerte genet redigering system, bestående av en mutant eGFP gene integrert i HCT116 celler, kan gi grunnleggende informasjon med hensyn til generering av genetisk lesjoner og prosessen med stedets mutagenese. CRISPR/Cas9 og enkelt-strandet oligonucleotide donor DNA molekyler arbeider inne tandem kan føre til presis reparasjon av punkt mutasjon i eGFP genet. Vi foreslår en ny modell for reparasjon av punkt mutasjoner, en molekylær sti der donor DNA fungerer som en replikering mal for reparasjon av mutant basen, en prosess som vi har kalt nøyaktig30. Målrettet befolkningen, viser ikke korrigert fenotypen, viser en rekke celler som inneholder heterogene og mye alt DNA indeler rundt målområdet. I omtrent en halv kloner isolert fra befolkningen uncorrected, ble sletting mutagenese observert på målområdet. Siden ingen tidligere rapport har indikert at single-strandet oligonucleotides opptrer som single-agent gen-redigeringsverktøy kan indusere indeler på målområdet, konkluderer vi at CRISPR/Cas9 aktivitet er ansvarlig for disse mutasjonene.
I dette manuskriptet gir vi en detaljert metodikk slik at genetisk heterogenitet på målområdet kan måles på en pålitelig og robust måte. Mens en enorm mengde oppmerksomhet er betalt til analyse og kartlegging av off-site mutagenese, er det sannsynlig at en heterogen mutasjon opprettet på målområdet vil ha en større effekt på suksess eller fiasko av genet redigering i klinisk arena. Ekstra teknologier eller modifisert Cas9 proteiner kan være nødvendig å forbedre presisjonen i homologi-rettet reparasjon av medfødt feil i pattedyrceller35. Noen av disse teknologiene inkluderer bruk av ekstra oligonucleotides til å fungere som en bro, holder chromosomal endene sammen og unngå ødeleggende virkningen av NHEJ. Definere graden av heterogenitet på målområdet som følge av gen-redigering aktivitet er og må være en viktig del av enhver protokoll utviklet for terapeutisk intervensjon.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen takk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy’s 5A Modified medium | ATCC | 30-2007 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
| L-glutamine | ATCC | 30-2214 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | ATCC | 30-2300 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ATCC | 30-2200 | No Calcium or magnesium |
| Trypsin EDTA Solution | ATCC | 30-2101 | |
| Aphidicolin 1mg | Thermo Fisher | AC611970010 | |
| Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol | IDT | No catalog number since its made to your specific gene target. | |
| CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol | IDT | 1072533 | |
| S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg | IDT | 1074182 | |
| IDTE Buffer | IDT | 11-01-03-01 | |
| Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm | VWR | 10497-474 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporation Systems | BioRad | 1652660 | |
| Bovine serum albumin lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE) |
Sigma | 05470-1G | |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | AM9260G | |
| Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69581 | |
| 6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates | VWR | 10062-892 | |
| Petri Dishes | Fisher | 12-565-90 | |
| Conical Tubes (15 mL) (racked) | Thermo Fisher | AM12500 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
References
- Mandecki, W. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci. 83 (19), 7177-7181 (1986).
- Walder, R. Y., Walder, J. A. Oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis using the yeast transformation system. Gene. 42 (2), 133-139 (1986).
- Moerschell, R. P., Tsunasawa, S., Sherman, F. Transformation of yeast with synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci. 85 (2), 524-528 (1988).
- Yoon, K., Cole-Strauss, A., Kmiec, E. B. Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNADNA oligonucleotide. Genetics. 93, 2071-2076 (1996).
- Beetham, P. R., Kipp, P. B., Sawycky, X. L., Arntzen, C. J., May, G. D. A tool for functional plant genomics: chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-specific mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8774-8778 (1999).
- Bertoni, C., Morris, G. E., Rando, T. A. Strand bias in oligonucleotide-mediated dystrophin gene editing. Hum Mol Gen. 14 (2), 221-233 (2004).
- Alexeev, V., Yoon, K. Stable and inheritable changes in genotype and phenotype of albino melanocytes induced by an RNA-DNA oligonucleotide. Nat Biotechnol. 16 (13), 1343-1346 (1998).
- Zorin, B., Hegemann, P., Sizova, I. Nuclear-gene targeting by using single-stranded DNA avoids illegitimate DNA integration in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot Cell. 4 (7), 1264-1272 (2005).
- Brachman, E. E., Kmiec, E. B. DNA replication and transcription direct a DNA strand bias in the process of targeted gene repair in mammalian cells. J Cell Sci. 117 (Pt 17), 3867-3874 (2004).
- Pierce, E. A., et al. Oligonucleotide-directed single-base DNA alterations in mouse embryonic stem cells. Gene Ther. 10 (1), 24-33 (2003).
- Radecke, S., Radecke, F., Peter, I., Schwarz, K. Physical incorporation of a single-stranded oligodeoxynucleotide during targeted repair of a human chromosomal locus. J Gene Med. 8 (2), 217-228 (2006).
- Bertoni, C., Rustagi, A., Rando, T. A. Enhanced gene repair mediated by methyl-CpG-modified single-stranded oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7468-7482 (2009).
- Andrieu-Soler, C., et al. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33 (12), 3733-3742 (2005).
- Olsen, P. A., Randol, M., Krauss, S. Implications of cell cycle progression on functional sequence correction by short single-stranded DNA oligonucleotides. Gene Ther. 12 (6), 546-551 (2005).
- Engstrom, J. U., Kmiec, E. B. DNA replication, cell cycle progression and the targeted gene repair reaction. Cell Cycle. 7 (10), 1402-1414 (2008).
- Aarts, M., te Riele, H. Parameters of oligonucleotide-mediated gene modification in mouse ES cells. J Cell Mol Med. 14 (6b), 1657-1667 (2010).
- Brachman, E. E., Kmiec, E. B. Gene repair in mammalian cells is stimulated by the elongation of S phase and transient stalling of replication forks. DNA Repair. 4 (4), 445-457 (2005).
- Engstrom, J. U., Suzuki, T., Kmiec, E. B. Regulation of targeted gene repair by intrinsic cellular processes. BioEssays. 31 (2), 159-168 (2009).
- Parekh-Olmedo, H., Ferrara, L., Brachman, E., Kmiec, E. B. Gene therapy progress and prospects: targeted gene repair. Gene Ther. 12 (8), 639-646 (2005).
- Olsen, P. A., Randol, M., Luna, L., Brown, T., Krauss, S. Genomic sequence correction by single-stranded DNA oligonucleotides: role of DNA synthesis and chemical modifications of the oligonucleotide ends. J Gene Med. 7 (12), 1534-1544 (2005).
- Wang, Z., Zhou, Z. -J., Liu, D. -P., Huang, J. -D. Double-stranded break can be repaired by single-stranded oligonucleotides via the ATM/ATR pathway in mammalian cells. Oligonucleotides. 18 (1), 21-32 (2008).
- Ferrara, L., Kmiec, E. B. Camptothecin enhances the frequency of oligonucleotide-directed gene repair in mammalian cells by inducing DNA damage and activating homologous recombination. Nucleic Acids Res. 32 (17), 5239-5248 (2004).
- Ferrara, L., Parekh-Olmedo, H., Kmiec, E. B. Enhanced oligonucleotide-directed gene targeting in mammalian cells following treatment with DNA damaging agents. Exp Cell Res. 300 (1), 170-179 (2004).
- Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
- Rivera-Torres, N., et al. The position of DNA cleavage by TALENs and cell synchronization influences the frequency of gene editing directed by single-stranded oligonucleotides. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Strouse, B., Bialk, P., Niamat, R. a, Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. Combinatorial gene editing in mammalian cells using ssODNs and TALENs. Sci Rep. 4 (ii), 3791 (2014).
- Bialk, P., Rivera-Torres, N., Strouse, B., Kmiec, E. B. Regulation of Gene Editing Activity Directed by Single-Stranded Oligonucleotides and CRISPR/Cas9 Systems. PloS One. 10 (6), e0129308 (2015).
- Yu, C., et al. Small Molecules Enhance CRISPR Genome Editing in Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 16 (2), 142-147 (2015).
- Rivera-Torres, N., Banas, K., Bialk, P., Bloh, K. M., Kmiec, E. B. Insertional Mutagenesis by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Gene Editing in Cells Targeted for Point Mutation Repair Directed by Short Single-Stranded DNA Oligonucleotides. PLoS One. 12 (1), e0169350 (2017).
- Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 31 (9), 833-838 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
