Denne protokollen beskriver arbeidsflyten med et CRISPR/Cas9-basert redigering system for reparasjon av punkt mutasjoner i pattedyrceller. Her bruker vi en kombinasjon tilnærming til genet redigering med en detaljert etterarbeid eksperimentelle strategi for å måle indel formasjon på målområdet-i hovedsak analysere stedet mutagenese.
Kombinasjon genet redigering med CRISPR/Cas9 og enkelt-strandet oligonucleotides er en effektiv strategi for korrigering av ett-base punkt mutasjoner, som ofte er ansvarlig for en rekke menneskelige arvet lidelser. Bruker en veletablert cellen-basert modell, er punkt mutasjon med et enkelt-kopi mutant eGFP integrert i HCT116 celler reparert bruker denne kombinasjon. Analyse av korrigert og uncorrected celler avslører både presisjonen av genet redigering og utvikling av genetiske lesjoner, når indeler opprettes i uncorrected celler i DNA sekvensen rundt målområdet. Her, markeres bestemte metodene som er brukt til å analysere denne kombinasjon tilnærming til genet redigering av en punkt mutasjon, kombinert med en detaljert eksperimentelle strategi for å måle indel formasjon på målområdet. Denne protokollen skisserer en grunnleggende tilnærming og arbeidsflyt for undersøkelser rettet mot utvikling av CRISPR/Cas9-baserte genet redigering for menneskelig behandling. Konklusjonen av dette arbeidet er som stedets mutagenese foregår som følge av CRISPR/Cas9 aktivitet under prosessen med punkt mutasjon reparasjon. Dette arbeidet setter på plass en standardisert metode for å identifisere graden av mutagenese, som bør være en viktig og kritisk del av alle tilnærming til kliniske implementering.
Banebrytende studier av Mandecki (1986) vist permanente endringer i plasmider DNA oligonucleotides forvandlet til bakterier1, mens Walder og Walder (1986) utført lignende studier i gjær2. Kort tid etter publiserte Sherman og kolleger en serie artikler som enkelt-strandet oligonucleotides introdusert i gjærceller gjøre arvelige endringer i gener3. Bygge på banebrytende arbeidet i mikrobiell celler, begynte Kmiec og kolleger å utvikle unike single-agent oligonucleotides instruert enkelt base reparasjon i pattedyrceller4. Dette konseptet ble basert på biokjemiske data som viste at molekyler bærer RNA binde tettere til målområdet enn de består utelukkende av DNA baser. Selv om det var mange rapporter om gen-redigering suksess med chimeric oligonucleotides5,6,7, var redigering nivåene svært variabel mellom eksperimenter og annen målcellen kombinasjoner.
Single-strandet donor DNA er foretrukket å double-strandet donor DNA fordi det er mindre sannsynlig å integrere tilfeldig områder i genomet8. Exogenously introdusert single-strandet oligonucleotides er imidlertid utsatt for rask nedbrytning av mobilnettet nucleases. Flere strategier for å beskytte termini av oligonucleotides fra fornedrelse har vært ansatt. En exonuclease-beskyttet, enkelt-strandet DNA som inneholder ønsket sekvensen var tilstrekkelig for å oppnå en redigering effektivitet i 0,1-1% rekkevidde6. Forbedret og mer konsekvent transfection teknikker, kombinert med fenotypiske readouts, tillot mer konsekvent redigering av flere forskning grupper8,9,10,11, 12,13.
De siste 10 årene, har det vært en betydelig innsats for å gjøre målcellene mer mottakelig for genet redigering. En strategi sysselsetter modulering av cellen syklus14,15,16. Mens redigering frekvenser under normal reaksjon forhold med enkelt-strandet oligonucleotides (ssODNs) innført i svevde kulturperler pattedyrceller mellom 0,1% til 1% frekvenser av genet redigering økt 3 – til 5 ganger når oligonucleotides introdusert i celler under overgangen S fasen. I en egen serie eksperimenter viste Brachman og Kmiec (2005) at relativt høye nivåer av presise genet redigering (3-5%) ble oppnådd når 2’3 ‘ dideoxycytosine (ddC) var ruges i celler for 24 timer før tilsetning av oligonucleotide17 . ddC reduserer hastigheten på DNA replikering gaffel bevegelse, noe som tyder på at genet redigering av ssODNs i replikere celler sannsynlig innebærer inkorporering av ODNs i regioner aktive replikering11,18. Til sammen disse studiene førte til konseptet at donor DNA blir innlemmet i en voksende replikering gaffel som en del av sant virkningsmekanismen av genet redigering, uavhengig av om en double-strandet pause finnes eller ikke19. Dermed skjer korreksjon av en punkt mutasjon eller utskifting av et segment av DNA i kromosomet via en DNA sammenkoblingen og enkelt-strand assimilering sti.
Inducing tilfeldig double-strandet DNA pauser i voksende celler med små molekyl agenter skaper et miljø der DNA replikering hendelser er stoppet som cellen forsøker å reparere skade20,21. Denne forbigående slowdown av replikering gafler kan en mer effektiv gjennomtrengning av chromatin av enkelt-strandet redigering oligonucleotides, bedre mål tilgjengelighet15. Etableringen av double-strandet DNA bryter av stoffer som VP16, bleomycin, eller camptothecin22,23, har vist seg å stimulere genet redigering nivåer av nesten 10-fold opptil 6-8%. Men er tilfeldig double-strandet DNA pauser uønsket i en terapeutisk innstilling.
Gene redigering med programmerbare nucleases og oligonucleotides er også stimulert under celledeling24,25. Når nukleinsyre basert levering ble brukt til å utføre homologi-rettet reparasjon i synkroniserte HCT 116 celler, Rivera-Torres og kolleger vist den samme økningen i rettet mot aktivitet når transkripsjon aktivator som effektor nucleases (TALENs) ble ansatt med enkelt-strandet oligonucleotides, begge introdusert i en etterligner celle befolkningen26,27 . Flere nylig, Bialk og kolleger viste at reparasjon av enkelt base mutasjoner med enkelt-strandet oligonucleotides og en rekke gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar Cas9 (CRISPR/Cas9) molekyler foregår med høyere effekt Når celle befolkningen er traversering S fase28. CRISPR molekylet består av RNA og funksjoner for å identifisere området i målet DNA sekvensen som er ment for spalting. Cas9 er en bakteriell enzym hvis funksjon er å holde seg double-strandet DNA i en nucleolytic exchange reaksjon. Dermed CRISPR posisjoner komplekset på genomisk målet, og Cas9 nuclease utfører double-strandet pause. Lin et al. (2014) også vist betydningen av cellen syklus for å oppnå høye frekvenser av genet redigering, med en modifisert CRISPR/Cas9 ribonulceoprotien (RNP) kompleks-mediert leveringssystem i primære neonatal fibroblaster, menneskelige embryonale stamceller, og andre cellen linjer24. Dermed gjelder forholdet mellom genet redigering og celle syklus progresjon for single-agent gen redigering kombinasjon genet redigering med programmerbare nucleases og donor DNA maler. Mens kombinasjon tilnærming til genet redigering har samlet en rekke partnere med donor DNA malen, bruker de fleste arbeidere i feltet CRISPR/Cas9 for å gi funksjonen double-strandet pause. Dette valget forutsetter ved den lette-av-bruken dette bestemt genetisk verktøyet og fleksibilitet som det kan være ansatt deaktivere gen funksjon eller innføre en fremmed stykke DNA i et bestemt område. Generering av en knockout er teknisk enklere sammenlignet en genet erstatning, der kommisjonsforordning “riktig” eller normal eksemplarer av et gen sykdom området må utføres med presisjon. Flere forskere er identifisere og studerer bruk av spesifikke medikamenter og reagensene som aktiverer korreksjon av mutant baser og innsetting av normal genetiske sekvenser som er riktig plassert på forhøyet frekvenser29.
Nylig Rivera-Torres et al. 30 brukes kombinasjon genet redigering, utnytter double-strandet pause aktiviteten til en spesialdesignet CRISPR/Cas9 og genetiske informasjonen fra en enkelt-strandet oligonucleotide donor DNA-mal, reparere en punkt mutasjon i enkopi av forbedret grønne fluorescerende protein (eGFP) genet integrert i HCT116 celler. Forfatterne tok fordel av dette godt karakterisert modell celle linje evaluere spesifisitet cleavage rundt målområdet. Dataene avslører at heterogenitet på målområdet finnes, særlig i celler som ikke inneholder en korrigert punkt mutasjon. I dette manuskriptet vi detalj og fokusere på metodikken brukt av disse arbeiderne for å undersøke stedet mutational heterogenitet skapt av CRISPR/Cas9 gene redigering.
Gene redigering har dukket opp som en vanlig vitenskapelig disiplin, hovedsakelig på grunn av fremveksten av CRISPR/Cas9. Denne bemerkelsesverdige veien, som muliggjør adoptivforeldre immunitet i bakterielle celler, har blitt repurposed som molekylære verktøy aktiverer genomisk endring i menneskelig kromosomer. CRISPR/Cas9 naturlige funksjon er å deaktivere virus-DNA ved å innføre double-strandet DNA bryter fører til fragmentering30,31. Denne aktiviteten ødelegges av invaderende eksogene DNA og fører til prokaryote immunitet som undertrykker påfølgende infeksjon av samme viral partikkel. Utrolig, dette systemet har pneumonic virkemåte, i at det kan aktivere bestemte CRISPR gRNA opprettet av tidligere infeksjon hendelser.
Effektivitet og nøyaktighet av genet forstyrrelser katalysert av CRISPR/Cas9 har blitt brukt i mange eukaryote genetiske systemer der målet var å deaktivere en fungerende genet32,33. Når redusert til basale nivået, består prosessen av to grunnleggende trinn. Først er en dobbel-strandet pause, mens andre er avhengig av iboende prosessen med ikke-homologe slutten med (NHEJ) for å fullføre knockout. I de fleste tilfeller, double-strandet pause resultatene i etableringen av Butt-slutt, fri chromosomal segmenter og enzymer som er involvert i NHEJ reagerer på chromosomal pause og handle for å conjoin brutt endene. Denne prosessen kan noen ganger innebære tap av personlige nukleotider på webområdet kuttet. Tapet av et par baser kan føre en frameshift, og funksjonelle uttrykk slutter. Bruk av CRISPR/Cas9 opprette genetisk knockout ved å engasjere de naturlige prosessen med NHEJ har revolusjonert eukaryote Genetikk; tap av DNA på målområdet er både forutsigbar og forventet.
I motsetning til genet knockout, har mange forskere vært engasjert i forsøk på å omdirigere og gjenbruke CRISPR/Cas9 aktivitet mot prosessen med homologi-rettet reparasjon. Målet med studiene er genet korreksjon. I denne strategien, er CRISPR/Cas9 kombinert med en mal for giver-DNA som inneholder genetisk informasjon å reparere feil medfødt eller mutasjoner inn sunn gener. Tidlige rapporter utheving bemerkelsesverdig kapasiteten til CRISPR/Cas9 å katalysere homologi-rettet reparasjon angitt (direkte eller indirekte) at prosessen skjedde i en svært presis mote24,34. Vårt laboratorium har studert homologi-rettet reparasjon eller genet korrigering ved hjelp av én-strandet oligonucleotides i et forsøk på å definere mekanisme og regulatoriske kretser rundt15,17,18 ,23. Vi har fokusert primært på genet redigering enkelt punkt mutasjoner, siden dette er den mest grunnleggende genetisk mutasjonen kjent for å være ansvarlig for mange arvet lidelser. Vår grunnleggende kunnskap om genet redigering førte oss til spørsmålet presisjonen i CRISPR/Cas9 aktivitet i disse reaksjonene, siden funksjonen CRISPR/Cas9 i genet knockout fører til dannelsen av indeler. Vi brukte en veldefinert modellsystem, i stedet for en ikke-valgbar men klinisk relevante genet, for å studere på stedet mutagenese i en desidert reduksjonistiske mote. Ved hjelp av et enkelt mål gen, på hvilket gen korreksjon kan måles på både genotypic og fenotypiske nivå, tenkte vi at heterogenitet på målområdet kan identifiseres på en pålitelig og robust måte.
Våre data bekrefter at veletablerte genet redigering system, bestående av en mutant eGFP gene integrert i HCT116 celler, kan gi grunnleggende informasjon med hensyn til generering av genetisk lesjoner og prosessen med stedets mutagenese. CRISPR/Cas9 og enkelt-strandet oligonucleotide donor DNA molekyler arbeider inne tandem kan føre til presis reparasjon av punkt mutasjon i eGFP genet. Vi foreslår en ny modell for reparasjon av punkt mutasjoner, en molekylær sti der donor DNA fungerer som en replikering mal for reparasjon av mutant basen, en prosess som vi har kalt nøyaktig30. Målrettet befolkningen, viser ikke korrigert fenotypen, viser en rekke celler som inneholder heterogene og mye alt DNA indeler rundt målområdet. I omtrent en halv kloner isolert fra befolkningen uncorrected, ble sletting mutagenese observert på målområdet. Siden ingen tidligere rapport har indikert at single-strandet oligonucleotides opptrer som single-agent gen-redigeringsverktøy kan indusere indeler på målområdet, konkluderer vi at CRISPR/Cas9 aktivitet er ansvarlig for disse mutasjonene.
I dette manuskriptet gir vi en detaljert metodikk slik at genetisk heterogenitet på målområdet kan måles på en pålitelig og robust måte. Mens en enorm mengde oppmerksomhet er betalt til analyse og kartlegging av off-site mutagenese, er det sannsynlig at en heterogen mutasjon opprettet på målområdet vil ha en større effekt på suksess eller fiasko av genet redigering i klinisk arena. Ekstra teknologier eller modifisert Cas9 proteiner kan være nødvendig å forbedre presisjonen i homologi-rettet reparasjon av medfødt feil i pattedyrceller35. Noen av disse teknologiene inkluderer bruk av ekstra oligonucleotides til å fungere som en bro, holder chromosomal endene sammen og unngå ødeleggende virkningen av NHEJ. Definere graden av heterogenitet på målområdet som følge av gen-redigering aktivitet er og må være en viktig del av enhver protokoll utviklet for terapeutisk intervensjon.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne har ingen takk.
McCoy’s 5A Modified medium | ATCC | 30-2007 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
L-glutamine | ATCC | 30-2214 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | ATCC | 30-2300 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ATCC | 30-2200 | No Calcium or magnesium |
Trypsin EDTA Solution | ATCC | 30-2101 | |
Aphidicolin 1mg | Thermo Fisher | AC611970010 | |
Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol | IDT | No catalog number since its made to your specific gene target. | |
CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol | IDT | 1072533 | |
S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg | IDT | 1074182 | |
IDTE Buffer | IDT | 11-01-03-01 | |
Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm | VWR | 10497-474 | |
Gene Pulser Xcell Electroporation Systems | BioRad | 1652660 | |
Bovine serum albumin lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE) |
Sigma | 05470-1G | |
EDTA (0.5 M), pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | AM9260G | |
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69581 | |
6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates | VWR | 10062-892 | |
Petri Dishes | Fisher | 12-565-90 | |
Conical Tubes (15 mL) (racked) | Thermo Fisher | AM12500 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |