Summary
Detta protokoll beskrivs arbetsflödet för en CRISPR/Cas9-baserade gen redigering system för reparation av punktmutationer i däggdjursceller. Här, använder vi en kombinatorisk syn på genen redigering med en detaljerad tillskottsnäring experimentella strategi för att mäta ditsatta bildande på målwebbplatsen — i huvudsak analysera på platsen mutagenes.
Abstract
Kombinatoriska gen redigering med CRISPR/Cas9 och enkelsträngat oligonukleotider är en effektiv strategi för korrigering av singel-base punktmutationer, som ofta är ansvarig för en mängd mänskliga ärftliga sjukdomar. Väletablerade cell-baserad modellsystem med har punkt mutationen av en singel-kopia mutant andra gen integreras i HCT116-celler reparerats med denna kombinatoriska strategi. Analysen av korrigerade och okorrigerade celler avslöjar både precision gen redigering och utvecklingen av genetiska skador, när indels skapas i okorrigerad celler i DNA-sekvensen kring målwebbplatsen. Här beskrivs den specifika metod som används för att analysera denna kombinatoriska inställning till genen redigering av en punktmutation, tillsammans med en detaljerad experimentella strategi att mäta ditsatta bildande på målwebbplatsen. Detta protokoll beskriver ett grundläggande förhållningssätt och arbetsflöde för utredningar som syftar till att utveckla CRISPR/Cas9-baserade gen redigering för mänsklig behandling. Slutsatsen av detta arbete är att hotellets mutagenes sker till följd av CRISPR/Cas9 aktivitet under processen för punktmutation reparation. Detta arbete inrättar en standardiserad metod för att identifiera graden av mutagenes, som bör vara en viktig och kritisk aspekt av någon strategi som är avsedda för klinisk implementering.
Introduction
Banbrytande studier av Mandecki (1986) visade permanenta förändringar i plasmid DNA med hjälp av oligonukleotider förvandlas till bakterier1, medan Walder och Walder (1986) genomförde liknande studier i jäst2. Kort därefter, publicerade Sherman och kollegor en serie skrifter som enkelsträngat oligonukleotider infördes i jästceller att göra ärftliga förändringar i gener3. Bygger på det banbrytande arbetet i mikrobiella celler, började Kmiec och kollegor utveckla unika monoterapi oligonukleotider som riktade enda bas reparation i däggdjursceller4. Detta koncept baserades på biokemiska data som visade att molekyler som bär RNA binder hårdare till målwebbplatsen än de består helt av DNA-baser. Även om det fanns många rapporter om genredigering framgång använder chimära oligonukleotider5,6,7, förblev redigering nivåer mycket varierande mellan experiment och över olika målcellen / kombinationer.
Enkelsträngat givare DNA är att föredra till dubbelsträngat givare DNA eftersom det är mindre sannolikt att integrera slumpmässigt platser inom den genom8. Dock är exogent introducerade enkelsträngat oligonukleotider benägna att snabb nedbrytning av cellulära nukleaser. Flera strategier för att skydda termini av oligonukleotider från nedbrytning har varit anställd. En exonuclease-skyddade, enkelsträngat DNA som innehåller önskade sekvensen var tillräcklig för att erhålla en redigering effektivitet i 0,1-1% intervall6. Förbättrad och mer konsekvent transfection tekniker, tillsammans med fenotypiska utläsningar, tillåtet för jämnare redigering av flera forskning grupper8,9,10,11, 12,13.
Under de senaste 10 åren, har det skett en betydande insats för att göra målceller mer mottagliga för genen redigering. En strategi sysselsätter moduleringen av cellcykeln14,15,16. Medan redigering frekvenser under normala reaktion villkor med enkelsträngat oligonukleotider (ssODNs) infördes i svävade odlade däggdjursceller mellan 0,1% och 1%, frekvenserna av genen redigering ökade 3 - till 5 - faldig när oligonukleotider infördes i celler under sin övergång genom den S-fasen. I en separat serie experiment visade Brachman och Kmiec (2005) att relativt höga nivåer av exakt gen redigering (3-5%) erhölls när 2'3 ' dideoxycytosine (ddC) var inkuberas i celler för 24 h innan oligonukleotiden17 . ddC minskar graden av DNA-replikering gaffel rörelse, vilket tyder på att genen redigering av ssODNs i replikera celler sannolikt omfattar införlivandet av ODNs i regionerna aktiv replikering11,18. Sammantaget dessa studier ledde till konceptet att givaren DNA blir införlivas en växande replikationsgaffeln som en del av den sanna verkningsmekanismen för genen redigering, oberoende av huruvida en dubbelsträngat paus är närvarande eller inte19. Således, korrigering av en punktmutation eller ersättande av ett segment av DNA inom kromosomen uppstår via en DNA ihopparning och singel-strand assimilering väg.
Inducerande slumpmässiga dubbelsträngat DNA raster i växande celler med småmolekylär ombud skapar en miljö där DNA replikeringshändelser har avstannat som cellens försök att reparera de skador20,21. Denna övergående nedgång av replikering gafflarna möjliggör en mer effektiv penetration av kromatinstruktur av enkelsträngat redigering oligonukleotider, förbättra mål tillgänglighet15. Skapandet av dubbelsträngat DNA bryter av läkemedel såsom VP16, bleomycin, eller camptothecin22,23, har visat sig stimulera gen redigering nivåer av nästan 10-faldigt, upp till 6-8%. Slumpmässiga dubbelsträngat DNA raster är dock önskvärt i en terapeutisk miljö.
Gen redigering med programmerbara nukleaser och oligonukleotider stimuleras också under celldelning24,25. När nukleinsyrebaserade leverans användes för att genomföra homologi-regisserad reparation i synkroniserade HCT 116 celler, Rivera-Torres och kollegor visat samma ökning av inriktning aktivitet när transkription aktivator-liknande effektor nukleaser (TALENs) anställda med enkelsträngat oligonukleotider, båda införs i en replikerande cell befolkningen26,27 . Mer nyligen, Bialk och kollegor visade att reparation av enda bas mutationer med enkelsträngat oligonukleotider och en matris med klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner Cas9 (CRISPR/Cas9) molekyler sker med högre effekt När cellen befolkningen söker igenom S fas28. CRISPR molekylen består av RNA och funktioner för att identifiera regionen inom målet DNA-sekvens som anges för klyvning. Cas9 är en bakteriell enzym vars funktion är att klyva dubbelsträngat DNA i en nucleolytic exchange reaktion. Således, CRISPR positioner anläggningen på genomisk mål, och Cas9 nuclease exekverar dubbelsträngat avbrottet. Lin et al. (2014) visade också vikten av cellcykeln för att uppnå höga frekvenser av genen redigering, med ett modifierat CRISPR/Cas9-ribonulceoprotien (RNP) immunkomplexmedierade leverans-system i primära neonatal fibroblaster, mänskliga embryonala stamceller, och andra cell linjer24. Således, förhållandet mellan gen redigering och cellcykelns förlopp för monoterapi gen redigering är tillämplig för kombinatoriska gen redigering med programmerbara nukleaser och givare DNA mallar. Medan den kombinatoriska metoden till genen redigering har fört samman en mängd partners med mallen givare DNA, använder de flesta arbetstagare i fältet CRISPR/Cas9 för att tillhandahålla funktionen dubbelsträngat paus. Detta val är baserad på den lätthet-av-använda av detta särskilda genetiska verktyg och den flexibilitet som det kan användas för att inaktivera geners funktion eller att införa en utländsk bit av DNA i en specifik plats. Generering av en knockout är tekniskt enklare jämfört med en gen ersättare, där införlivandet av ”rätt” eller normala kopior av en gen i webbplatsen sjukdom måste utföras med precision. Ett antal forskare är att identifiera och studera användningen av specifika läkemedel och reagenser som möjliggör korrigering av muterade baser och införandet av normala genetiska sekvenser i rätt position vid förhöjda frekvenser29.
Nyligen, Rivera-Torres o.a. 30 används kombinatoriska gen redigering, dra nytta av dubbelsträngat paus aktivitet ett specifikt utformat CRISPR/Cas9-system och den genetiska informationen som tillhandahålls av en enkelsträngat oligonukleotiden givare DNA-mall, att reparera en punktmutation i enkopia av genen förbättrade grönt fluorescerande protein (andra) integreras i HCT116-celler. Författarna drog fördel av detta välkarakteriserad modell cellen fodrar att utvärdera specificitet klyvning kring målwebbplatsen. Data visar att olikheter på målwebbplatsen finns, särskilt i celler som inte innehåller en korrigerad punktmutation. Detta manuskript, vi detalj och fokusera på den metod som används av dessa arbetstagare för att undersöka Hotellets mutationsanalys heterogenitet skapad av CRISPR/Cas9 gen redigering.
Protocol
följande protokoll innebär att arbeta med däggdjursceller; förtrogenhet med steril teknik/cellkultur förväntas.
1. cell fodrar och odlingsbetingelser
- göra 500 mL medium för kulturen i HCT 116 celler: McCoy ' s 5A modified medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin och 1% penicillin (detta är komplett medium).
Obs: Odla HCT 116-19 cellerna i en T-75 eller T-175 kolv före plätering. När 90% konfluenta, varje T-75 kolv kommer att ge 8,4 x 10 6 celler, ungefär fem 10-cm plattor, och varje T-175 kommer att ge 18,4 x 10 6 celler, ungefär femton 10-cm plattor.
2. Skörda celler från kolven
- aspirera bort mediet, tvätta med Dulbecco ' s Phosphate-Buffered saltlösning utan kalcium och magniesium (PBS) (10 mL för T-75 eller 25 mL för T-175) och aspirera.
- Lägg till trypsin droppvis till kolven med 2 mL pipett (2 mL för T-175 eller 1 mL för T-75). Placera kolven i en inkubator på 37 ° C och 5% CO 2 för 5 min så att cellerna att lossa.
- Tryck på kolven så att se till att alla celler är rubbas och sedan släcka med komplett medium genom att sprida den över hela ytan av kolven (8 mL för T-175 eller 4 mL T-75).
- Pipettera upp och ner flera gånger bryta upp cell klumpar och överföra celler till en 15 mL koniska rör
- Innan spinning cellerna ner, ta 10 µL från 15-mL koniska och kombinera det med 10 µL trypan blå att räkna cellerna. Pellet cellerna av spinning för 5 min på 125 x g och 16 ° C.
3. Räknar cellerna
- överföra 10 µL av cellerna blandas med trypan blå till hemocytometer. Räkna 4 rutnäten runt utsidan (varje rutnät innehåller 16 rutor).
- Ta det genomsnittliga celltalet från respektive uppsättning med sexton hörn rutor.
- Multiplicera med 10 000 (10 4).
- Multiplicera med den totala volymen av medium som används för att skörda cellerna att korrigera för trypan blå tillägg utspädningen.
Obs: Formatet ekvation för att beräkna volymen för att resuspendera cellerna följer:
4. Plätering cellerna
- för varje 10 cm platta celler som ska synkroniseras, tillsätt 5 mL av komplett medium och 6 µM av aphidicholin (12 µL av en 2.5 mM lager i 200-bevis etanol).
- Överföra 100 µL av nytt svävande cell pellets, 2,5 x 10 6 celler, till varje 10-cm platta och snurra försiktigt för att blanda.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C och 5% CO 2 för 16-24 h att synkronisera celler vid G1/S gränsen.
5. Släppa celler från Aphidicolin synkronisering
- 4 h före inriktning, aspirera medium, tvätta med PBS, aspirera PBS, och tillsätt 5 mL av komplett medium
- Placera den tillbaka i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO 2 för 4 h
6. RNA komplexbildande
- RETUR mutant andra gensekvensen i Zhang labbet ' s online generator 25 (http:// crispr.mit.edu/) och välj guiden CRISPR sekvenser som binder med närhet till målwebbplatsen. Skaffa guiden CRISPR sekvenser från en kommersiell källa.
- Lagra CRISPR RNA (crRNA), trans-aktivera crRNA (tracrRNA) och Cas9 protein vid 20 ° C och Använd enligt tillverkaren förslag.
- Mix RNA i equimolar koncentrationer till 45 µM. lägga till 6,75 µL av ett 200 µM lager av crRNA och 6,75 µL ett 200 µM lager av tracrRNA till ett 1,5 mL Centrifugera röret. Tillsätt 16,50 µL av TE buffert att göra en slutlig volym av 30 µL.
- Värme vid 95 ° C i 5 min i en värme block eller PCR-maskin.
Försiktighet: Hot! - Låt svalna till rumstemperatur.
Obs: Om du använder en PCR-maskin, ställa in kyla till 0,2 ° C/s. - Utför följande steg för varje prov.
- Späd 2.22 µL av crRNA:tracrRNA komplex i 2.78 µL av TE buffert (10 mM Tris, pH 8,0 och 0,1 mM EDTA; pH 8,0) till en slutlig volym av 5 µL.
- Späda 1,67 µL Cas9 Protein från en 60 µM lager i 3.33 µL av låg-serum medium till slutlig volym av 5 µL.
- Mix 5 µL av Cas9 protein med 5 µL komplexförening RNA
7. Skörd cellerna för inriktning
- aspirera medium, tvätta med 5 mL PBS, aspirera PBS och tillsätt 1 mL före värmde trypsin till varje 10cm platta. Sätta plattorna i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO 2 för 5 min.
- Tryck på 10-cm plattan så att alla celler är rubbas och sedan släcka med 4 mL komplett medium genom att sprida den över hela ytan av plattan.
- Pipett upp och ner flera gånger bryta upp cell klumpar och överföra cellerna till en 15 mL koniska rör.
- Innan spinning cellerna ner, ta 10 µL från 15 mL koniska röret och kombinera det med 10 µL trypan blå att räkna cellerna. Pellet cellerna av spinning för 5 min på 125 x g och rumstemperatur.
- Sug ut mediet och tvätta med 5 mL PBS. Pellet cellerna av spinning på 125 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
8. Räknar cellerna
- överföra 10 µL av cellerna blandas med trypan blå till hemocytometer. Räkna 4 rutnäten runt utsidan (varje rutnät innehåller sexton rutor).
- Ta det genomsnittliga celltalet från respektive uppsättning med sexton hörn rutor.
- Multiplicera med 10 000 (10 4).
- Multiplicera med den totala volymen av medium som används för att skörda cellerna att korrigera för trypan blå tillägg utspädningen.
Obs: Följande är formatet ekvation för att beräkna volymen för att resuspendera cellerna. Återsuspendering erforderligt antal celler i serumfritt McCoy ' s 5A modified medium.
9. riktade prover
- överföra 100 µL cellsuspension (5 x 10 5 celler) från steg 8,1 till varje elektroporation 4 mm gap kyvetten. Tillsätt 10 µL av RNP komplexa från steg 6,7 till 100 µL av celler på en 5 x 10 5 cell densiteten. Lägg till ODN (2 µM) till varje prov.
Obs: För en positiv kontroll, Lägg till 1 µL av andra på 1 µg/µL uttrycker plasmiden- ta rack till en elektroporation maskin, lätt svep varje prov och placera dem i kammaren. Electroporate på 250 V, LV; 2 pulser, 1 s; 13 ms; Unipolar puls.
- Överföra racket tillbaka till huven. Överföra varje prov till en väl innehållande 2 mL av komplett medium jagn en 6-bra platta. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2 för 72 h innan du kontrollerar för korrigering nivåer.
10. Analys av genen redigeras celler och Transfection effektivitet
- aspirera på medellång och tvätta cellerna med 2 mL PBS. Aspirera PBS och tillsätt 500 µL av pre värmde trypsin till varje brunn av 6-väl plattan. Sätta plattorna i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO 2 för 5 min.
- Knacka plattan så att alla celler är rubbas och sedan släcka med 1 mL komplett medium genom att sprida den över hela ytan av brunnen.
- Passera cellerna i en 1,5 mL centrifugrör och pellet på 5 000 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
- Aspirera medium. Återsuspendering cellpelleten i 500 µL FACS buffert (0,5% BSA, 2 mM EDTA och 2 µg/mL propidium jodid i PBS).
- Mäter den cell fluorescensen (andra +) med flödescytometri.
- Beräkna korrigering effektivitet i procent av de totala levande andra-positiva cellerna över det totala antalet levande celler i varje prov som beskrivs i Rivera Torres et al 30.
11. DNA-sekvensanalys
- Electroporate de synkroniserade och släppt HCT 116-19 celler vid en koncentration på 5 x 10 5 celler/100 µL, med RNP komplexa på 100 pmols och 72NT ODN vid 2,0 µM.
- Överföra celler till 6 brunnar och tillåta dem att återvinna för 72 h.
- Sortera cellerna individuellt i 96 brunnar med en FACS sorterare med en 488-nm (100 mw) laser för andra +/-, som beskrivs i Rivera-Torres et al 30.
Obs: Inte alla brunnar kommer att framgångsrikt växa. - Expanderar celler över 6 veckor och skörda enligt beskrivningen i steg 7.
- Från brunnarna som har tillväxt, isolera cellulära gDNA använder en kommersiellt tillgänglig DNA-isolering kit (se Tabell av material) och förstärka regionen kring målet bas via PCR (718 bp; framåt primer 5 '- ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ' och reverse primer 5 ' - ACTTGTACAGCTCGTCCATGC - 3 ').
- Utföra DNA sekvensering analys av prov.
Representative Results
Vi använt modellsystem för att studera genen redigering i däggdjursceller, som förlitar sig på korrigering av en punktmutation som är inbäddad i den andra genen integrerad som ett enda exemplar i HCT116-celler. Det är viktigt att notera att detta är en singel-kopia gen; Således kan en mindre komplicerad vy av DNA-förändringar eller mutagenes göras. Figur 1A visar mutant andra gensekvensen med riktade basen, tredje basen av den stop kodon TAG, markerade i rött. Den 72-base oligonukleotiden, som delvis kompletterar den icke-transkriberas strand av andra genen (72NT) och är utformad för att inducera base utbytet från en G till en C, illustreras också. Dessutom avbildas en CRISPR, utsetts till 2C, med angivna protospacer sekvens i en 5' till 3' orientering, också i figur 1A. För att genomföra denna genredigering reaktion, vi använde en ribonukleoprotein (RNP) bestående av CRISPR (SP) RNA och tracr (tr) RNA kopplat till renat Cas9 protein (figur 1B), istället för att använda en däggdjur uttryck vektor bestående av Cas9 genen och den lämpliga särskilda handledningen RNA-sekvens.
När särskilt utformad RNP partikeln levereras med den enkelsträngade oligonukleotiden i HCT116-celler med elektroporation, gen redigering, framgår av reparation av den enda bas mutationen i andra, observeras efter 72 h inkubation med hjälp av ett flöde cytometer. Funktionella reparation är observerbart genom uppkomsten av grön fluorescens i riktade celler, celler som kan avskiljas från hela befolkningen med sortering på grund av denna fluorescens. I figur 2visas en gradvis dos-respons kan ses som samordnade nivåerna av RNP och 72NT ökning. Den molekylära baserat, picomoles av RNP och mikromolära koncentration av 72NT som visas i figuren, är baserade på optimala doser används i genredigering reaktioner som är beroende av införandet av Cas9 och specifika guide RNA från transfekterade uttryck vektorer. Infällt i figur 2 visar en genredigering reaktion utföras i avsaknad av RNP partikeln. Här, korrigeras cirka 1% av de rikta cellerna när en 10-faldig högre koncentration av den 72NT oligonukleotiden används i monoterapi genredigering reaktionen.
För att avgöra om genetiska olikheter finns vid målet webbplats-den så kallade Hotellets mutagenes effekt-beslutade vi att granska resultatet av genen redigering aktivitet i enskilda celler. Tag mycket mer arbetskrävande än att undersöka den totala populationen, ett sant mått på genetiska fotspår eller lesioner kan fastställas när genomet hos klonalt utökade cellerna undersöks. Vi upprepade experimentet beskrivs i figur 2, denna gång bara med 100 pmol av RNP komplexa och 2,0 µmol av den 72NT oligonukleotiden. Som var ovan, HCT 116 celler synkroniserade för 24 h med aphidicholine och greps vid G1/S gränsen. 4 h efteråt, cellerna släpptes och verktygen genredigering infördes genom elektroporation. 72 h senare cellerna analyserades med FACS och sorteras individuellt till 96 brunnar (experimental processen illustreras i figur 3). Celler som visar grön fluorescens var sorterade efter flödescytometri i enskilda brunnar i en plattan med 96 brunnar för klonal expansion. Allt var celler saknar andra uttryck också isolerade och sorteras på ett liknande sätt för expansion på samma villkor.
Efter 14 dagar av tillväxt, hade de flesta av de enskilda klonerna expanderat tillräckligt för att möjliggöra DNA isolering. Som sådan, 16 kloner av andra-positiva proverna valdes, och genetisk integritet kring målwebbplatsen analyserades av DNA-sekvensering. Information kring DNA-sekvensen alleler inom befolkningen genererades med Sanger sekvensering, monteras med sekvens visualiseringsprogram för att jämföra sekvensen av en vildtyp allel (figur 4A). Skär platsen för RNP anläggningen indikeras av en svart pil, ligger på gröna bar (2C crRNA). Som också visas i figur 4Ainnehåller alla 16 andra-positiva celler förutspådda nukleotid utbyte på målwebbplatsen. Konverterade C återstoden är markerade i rött, och den topp profil återspeglar exakt ändringen tillhandahålls under andra-positiv sekvensen. På ett liknande sätt, 15 icke-gröna klonal isolerar, tillräckligt utökas för att möjliggöra DNA-extraktion och sekvensering, analyserades för heterogenitet på målwebbplatsen. Som förutspådde, i ungefär halva prover observerades inga DNA bas exchange. Detta återspeglas i underhållet av G återstoden på målwebbplatsen, som visas i figur 4B. Återstoden av de klonala expansioner som undersöks i dessa experiment visas en heterogen befolkning av radering mutationer, därför redovisning för avsaknaden av grön fluorescens. Strykningen storlek varierade från en bas till 19 baser. Det är viktigt att Observera att vi endast har undersökt 15 prover av andra-positiva celler, och även om vi tror att detta är ganska representativt för typ av genetiska skador kvar av CRISPR/Cas9 aktivitet, det finns en möjlighet att andra typer eller former av indels kunde vara närvarande i målpopulationen.
Resultaten visas i figur 4 sammantaget och bekräfta den fenotypiska avläsningen i den andra inriktning systemet. Konvertering av G till C nukleotid möjliggör uppkomsten av grön fluorescens i korrigerade HCT116-celler. Ingen bas substitution som omger målwebbplatsen har observerats i de kloner som isolerad för detta experiment eller i tidigare experiment27,28. Data visar också att cellerna inte genomgå gen redigering via punktmutation reparation förblir okorrigerad men, i vissa fall inte oförändrat och med en rad genetiska heterogenitet kring målwebbplatsen.
Figur 1. (A) modellsystem för genen redigering av muterade andra genen. De lämpliga segment av vildtyp och muterade andra gen med den riktade kodon, ligger i centrum av sekvensen visas i grönt och rött, respektive. Den nukleotid måltavlan för exchange är fetstil och understruken. Den markerade baser i blå representerar 2C CRISPR protospacer sekvensen, och de orange baserna markera webbplatsen PAM. Den oligonukleotiden som används i dessa experiment är 72 baser i längd, bär phosphorothioate modified kopplingar på de tre terminal baserna; den 72-mer mål icke-transkriberas (NT) strand (72NT). (B) CRISPR/Cas9ribonukleoprotein församlingen reaktion. crRNA ger målet specificitet (20 baser, röda avsnitt) motsvarande 2C protospacer sekvensen och en interaktion domän (blå) med tracrRNA (grön). crRNA och tracrRNA är glödgas i equimolar koncentrationer. Cas9 protein (grå) läggs till slutföra församlingens RNP. Guide RNAs (gRNAs) direkt och aktivera den Cas9 Amiiiiin, som sedan klyva mål-DNA. Den nedre delen av figuren visar sekvensen 2C utsäde och sekvensen tracrRNA. Denna siffra ändrades från Rivera-Torres, N. et al. (2017). vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2. Gen redigering är dosberoende när regi RNP och ssODN. Synkroniseras och släppt HCT 116-19 celler var electroporated med 24-120 pmol av CRISPR/Cas9 RNP och 0,6-3,0 µM av 72mer. Efter en 72-h återhämtningsperiod mättes genredigering aktivitet med en flödescytometer. Gen redigering visas som korrigering effektivitet (%), bestäms av antalet livskraftiga andra-positiva celler dividerat med det totala antalet livskraftiga celler i befolkningen. Felstaplar produceras från tre uppsättningar av datapunkter som genererade över tre separata experiment med grundläggande beräkningar av standardfel. Infälld: monoterapi gen redigering. Genredigering aktivitet regisserad av den enkelsträngade oligonukleotiden (72NT) i avsaknad av den komplexa under identiska förhållanden RNP presenteras som en funktion av ökande koncentration. Denna siffra ändrades från Rivera-Torres, N. et al. (2017). vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3. Experimentell strategi för isolering av encelliga kloner. Celler uppvisar andra uttryck var gjorde som positiva och sorterad med en flödescytometer som enstaka celler i enskilda brunnar för klonal expansion. Celler som saknar andra uttryck var isolerade och sorteras på ett liknande sätt och expanderat på samma villkor. DNA var då isolerat och den andra genen var förstärkt och underkastas Sanger sekvensering att analysera genredigering aktiviteten kring målwebbplatsen. Denna siffra ändrades från Rivera-Torres, N. et al. (2017). vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4. (A) alleliska analys av andra-positiva celler expanderat som en klonal population. Isolerade klonalt och utökade andra-positiva prover (sexton kloner) var analyseras på platsen kring riktade base och DNA från varje, skördas, renat, förstärks och sekvenserade. Alleliska analys utfördes med Sanger sekvensering, monteras med sekvens visualiseringsprogram och jämfört sekvensen av en vildtyp-allel, vilket illustreras på toppen av siffran. Skär platsen för RNP komplexet är indicerat som en liten svart pil som ligger på gröna bar (2C crRNA). (B) Alleliska analys av andra negativa celler expanderat som en klonal population. Femton individuella prover, expanderat från kloner med ursprung från befolkningens okorrigerad, valdes slumpmässigt ut och analyseras för ditsatta bildande på platsen kring de mål nukleotid. Som utfördes ovan, alleliska analys med Sanger sekvensering och monteras med en sekvens visualiseringsprogram. Återigen, sekvensen av en vildtyp allel längst upp i siffran, tillsammans med webbplatsens skära i RNP, presenteras. Denna siffra ändrades från Rivera-Torres, N. et al. (2017). vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Gen redigering har vuxit fram som en mainstream vetenskaplig disciplin primärt på grund av uppkomsten av CRISPR/Cas9 systemet. Denna anmärkningsvärda väg, vilket underlättar adoptiv immunitet i bakterieceller, har varit repurposed som molekylära verktyg för att aktivera genomisk förändring i mänskliga kromosomer. CRISPR/Cas9 naturliga funktion är att inaktivera virus-DNA genom att införa dubbelsträngat DNA raster leder till fragmentering30,31. Denna aktivitet resulterar i förstörelsen av invaderande exogent DNA och leder till prokaryota immunitet som dämpar efterföljande infektion av den samma virala-partikeln. Otroligt, detta system uppvisar pneumonic beteende, däri det kan återaktivera specifika CRISPR gärna skapad av tidigare infektion händelser.
Effektiviteten och precisionen av genen störningar katalyseras av CRISPR/Cas9 har använts i många eukaryota genetiska system där målet var att inaktivera en fungerande gen32,33. När reduceras till dess basal nivå, består processen av två grundläggande steg. Först är en dubbelsträngat paus, medan andra förlitar sig på inneboende processen för icke-homolog slutet att gå (NHEJ) för att slutföra knockout. I de flesta fall, resultaten dubbelsträngat paus i skapandet av blunt-slutade, urkopplad kromosomala segment och enzymer involverade i NHEJ reagerar till kromosomala avbrottet och agera för att förena sig brutna ändarna. Denna process kan ibland innebära förlust av enskilda nukleotider på webbplatsen avhuggna. Förlusten av även några baser kan orsaka en frameshift och funktionella uttryck upphör. Användning av CRISPR/Cas9 skapa genetiska knockout genom att anlita den naturliga processen av NHEJ har revolutionerat eukaryota genetik; förlusten av DNA på målplatsen är både förutsägbar och förväntade.
I motsats till genen knockout, har ett antal forskare varit engagerade i ett försök att omdirigera och återanvända CRISPR/Cas9 aktivitet mot processen för homologi-regisserad reparation. Syftet med studierna är genen korrigering. I denna strategi kombineras CRISPR/Cas9 med en givare DNA-mall som innehåller den genetiska informationen att reparera ett medfött fel eller att infoga mutationer i friska gener. Tidiga rapporter belyser CRISPR/Cas9 anmärkningsvärd kapacitet att katalysera homologi-regisserad reparation anges (direkt eller indirekt) att processen ägde rum i en mycket exakt mode24,34. Vårt laboratorium har studerat homologi-regisserad reparation eller gen korrigering använder enkelsträngade oligonukleotider i ett försök för att definiera mekanism och reglerande kretsar kring den15,17,18 ,23. Vi har fokuserat främst på genen redigering enstaka punktmutationer, eftersom detta är den mest grundläggande genetisk mutation kända för att vara ansvarig för många ärftliga sjukdomar. Vår grundläggande kunskap om genen redigering ledde oss att ifrågasätta precisionen av CRISPR/Cas9 aktivitet i dessa reaktioner, sedan funktionen CRISPR/Cas9 i gen knockout resulterar i bildandet av indels. Vi använde en väldefinierad modellsystem, snarare än en icke-valbara ännu inte kliniskt relevanta gen, för att studera Hotellets mutagenes i en avgjort reduktionistiska mode. Med hjälp av en enkel målgenen, vid vilken gen korrigering kan mätas på både genotypisk och fenotypisk nivå, resonerade vi att heterogenitet som inträffar på målwebbplatsen kunde identifieras i en pålitlig och robust mode.
Våra data bekräftar att genen väletablerade redigering system, bestående av en mutant andra gen integreras i HCT116-celler, kan ge grundläggande information om generering av genetiska skador och processen för hotellets mutagenes. CRISPR/Cas9 och enkelsträngat oligonukleotiden givare DNA-molekyler som arbetar i tandem kan leda till exakt reparation av peka mutationen i den andra genen. Vi föreslår en ny modell för reparation av punktmutationer, en molekylär väg där givaren DNA fungerar som en replikering mall för reparation av muterade basen, en process som vi har kallat exakt30. Målpopulationen, inte uppvisar den korrigera fenotypen, visar en mängd celler som innehåller heterogena och allmänt allt DNA indels kring målwebbplatsen. I ungefär halva klonerna isolerade från okorrigerad befolkningen, observerades radering mutagenes på målwebbplatsen. Eftersom ingen tidigare rapport har indikerat att enkelsträngat oligonukleotider agerar som monoterapi genredigering verktyg kan inducera indels på målwebbplatsen, vi dra slutsatsen att CRISPR/Cas9 verksamhet ansvarar för dessa mutationer.
I detta manuskript ger vi en detaljerad metod så att genetisk heterogenitet på målplatsen kan mätas i en pålitlig och robust mode. Medan en enorm mängd uppmärksamhet har ägnats åt analys och kartläggning av off-site mutagenes, är det sannolikt att en heterogen mutation skapats på målwebbplatsen kommer att ha större effekt på framgång eller misslyckande av genen redigering i kliniska arenan. Ytterligare tekniker eller modifierade Cas9 proteiner kan krävas för att förbättra precisionen i homologi-regisserad reparation av medfödda rubbningar i däggdjursceller35. Vissa av dessa tekniker omfattar användning av extra oligonukleotider att fungera som en bro, håller kromosomala ändarna ihop och undvika destruktiva verkan av NHEJ. Anger graden av heterogenitet på målwebbplatsen genom genredigering verksamhet är och måste vara en viktig del av alla protokoll utformat för terapeutisk intervention.
Disclosures
Författarna inte har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy’s 5A Modified medium | ATCC | 30-2007 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
| L-glutamine | ATCC | 30-2214 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | ATCC | 30-2300 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ATCC | 30-2200 | No Calcium or magnesium |
| Trypsin EDTA Solution | ATCC | 30-2101 | |
| Aphidicolin 1mg | Thermo Fisher | AC611970010 | |
| Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol | IDT | No catalog number since its made to your specific gene target. | |
| CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol | IDT | 1072533 | |
| S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg | IDT | 1074182 | |
| IDTE Buffer | IDT | 11-01-03-01 | |
| Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm | VWR | 10497-474 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporation Systems | BioRad | 1652660 | |
| Bovine serum albumin lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE) |
Sigma | 05470-1G | |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | AM9260G | |
| Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69581 | |
| 6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates | VWR | 10062-892 | |
| Petri Dishes | Fisher | 12-565-90 | |
| Conical Tubes (15 mL) (racked) | Thermo Fisher | AM12500 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
References
- Mandecki, W. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci. 83 (19), 7177-7181 (1986).
- Walder, R. Y., Walder, J. A. Oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis using the yeast transformation system. Gene. 42 (2), 133-139 (1986).
- Moerschell, R. P., Tsunasawa, S., Sherman, F. Transformation of yeast with synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci. 85 (2), 524-528 (1988).
- Yoon, K., Cole-Strauss, A., Kmiec, E. B. Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNADNA oligonucleotide. Genetics. 93, 2071-2076 (1996).
- Beetham, P. R., Kipp, P. B., Sawycky, X. L., Arntzen, C. J., May, G. D. A tool for functional plant genomics: chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-specific mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8774-8778 (1999).
- Bertoni, C., Morris, G. E., Rando, T. A. Strand bias in oligonucleotide-mediated dystrophin gene editing. Hum Mol Gen. 14 (2), 221-233 (2004).
- Alexeev, V., Yoon, K. Stable and inheritable changes in genotype and phenotype of albino melanocytes induced by an RNA-DNA oligonucleotide. Nat Biotechnol. 16 (13), 1343-1346 (1998).
- Zorin, B., Hegemann, P., Sizova, I. Nuclear-gene targeting by using single-stranded DNA avoids illegitimate DNA integration in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot Cell. 4 (7), 1264-1272 (2005).
- Brachman, E. E., Kmiec, E. B. DNA replication and transcription direct a DNA strand bias in the process of targeted gene repair in mammalian cells. J Cell Sci. 117 (Pt 17), 3867-3874 (2004).
- Pierce, E. A., et al. Oligonucleotide-directed single-base DNA alterations in mouse embryonic stem cells. Gene Ther. 10 (1), 24-33 (2003).
- Radecke, S., Radecke, F., Peter, I., Schwarz, K. Physical incorporation of a single-stranded oligodeoxynucleotide during targeted repair of a human chromosomal locus. J Gene Med. 8 (2), 217-228 (2006).
- Bertoni, C., Rustagi, A., Rando, T. A. Enhanced gene repair mediated by methyl-CpG-modified single-stranded oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7468-7482 (2009).
- Andrieu-Soler, C., et al. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33 (12), 3733-3742 (2005).
- Olsen, P. A., Randol, M., Krauss, S. Implications of cell cycle progression on functional sequence correction by short single-stranded DNA oligonucleotides. Gene Ther. 12 (6), 546-551 (2005).
- Engstrom, J. U., Kmiec, E. B. DNA replication, cell cycle progression and the targeted gene repair reaction. Cell Cycle. 7 (10), 1402-1414 (2008).
- Aarts, M., te Riele, H. Parameters of oligonucleotide-mediated gene modification in mouse ES cells. J Cell Mol Med. 14 (6b), 1657-1667 (2010).
- Brachman, E. E., Kmiec, E. B. Gene repair in mammalian cells is stimulated by the elongation of S phase and transient stalling of replication forks. DNA Repair. 4 (4), 445-457 (2005).
- Engstrom, J. U., Suzuki, T., Kmiec, E. B. Regulation of targeted gene repair by intrinsic cellular processes. BioEssays. 31 (2), 159-168 (2009).
- Parekh-Olmedo, H., Ferrara, L., Brachman, E., Kmiec, E. B. Gene therapy progress and prospects: targeted gene repair. Gene Ther. 12 (8), 639-646 (2005).
- Olsen, P. A., Randol, M., Luna, L., Brown, T., Krauss, S. Genomic sequence correction by single-stranded DNA oligonucleotides: role of DNA synthesis and chemical modifications of the oligonucleotide ends. J Gene Med. 7 (12), 1534-1544 (2005).
- Wang, Z., Zhou, Z. -J., Liu, D. -P., Huang, J. -D. Double-stranded break can be repaired by single-stranded oligonucleotides via the ATM/ATR pathway in mammalian cells. Oligonucleotides. 18 (1), 21-32 (2008).
- Ferrara, L., Kmiec, E. B. Camptothecin enhances the frequency of oligonucleotide-directed gene repair in mammalian cells by inducing DNA damage and activating homologous recombination. Nucleic Acids Res. 32 (17), 5239-5248 (2004).
- Ferrara, L., Parekh-Olmedo, H., Kmiec, E. B. Enhanced oligonucleotide-directed gene targeting in mammalian cells following treatment with DNA damaging agents. Exp Cell Res. 300 (1), 170-179 (2004).
- Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
- Rivera-Torres, N., et al. The position of DNA cleavage by TALENs and cell synchronization influences the frequency of gene editing directed by single-stranded oligonucleotides. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Strouse, B., Bialk, P., Niamat, R. a, Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. Combinatorial gene editing in mammalian cells using ssODNs and TALENs. Sci Rep. 4 (ii), 3791 (2014).
- Bialk, P., Rivera-Torres, N., Strouse, B., Kmiec, E. B. Regulation of Gene Editing Activity Directed by Single-Stranded Oligonucleotides and CRISPR/Cas9 Systems. PloS One. 10 (6), e0129308 (2015).
- Yu, C., et al. Small Molecules Enhance CRISPR Genome Editing in Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 16 (2), 142-147 (2015).
- Rivera-Torres, N., Banas, K., Bialk, P., Bloh, K. M., Kmiec, E. B. Insertional Mutagenesis by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Gene Editing in Cells Targeted for Point Mutation Repair Directed by Short Single-Stranded DNA Oligonucleotides. PLoS One. 12 (1), e0169350 (2017).
- Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 31 (9), 833-838 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
