Detta protokoll beskrivs arbetsflödet för en CRISPR/Cas9-baserade gen redigering system för reparation av punktmutationer i däggdjursceller. Här, använder vi en kombinatorisk syn på genen redigering med en detaljerad tillskottsnäring experimentella strategi för att mäta ditsatta bildande på målwebbplatsen — i huvudsak analysera på platsen mutagenes.
Kombinatoriska gen redigering med CRISPR/Cas9 och enkelsträngat oligonukleotider är en effektiv strategi för korrigering av singel-base punktmutationer, som ofta är ansvarig för en mängd mänskliga ärftliga sjukdomar. Väletablerade cell-baserad modellsystem med har punkt mutationen av en singel-kopia mutant andra gen integreras i HCT116-celler reparerats med denna kombinatoriska strategi. Analysen av korrigerade och okorrigerade celler avslöjar både precision gen redigering och utvecklingen av genetiska skador, när indels skapas i okorrigerad celler i DNA-sekvensen kring målwebbplatsen. Här beskrivs den specifika metod som används för att analysera denna kombinatoriska inställning till genen redigering av en punktmutation, tillsammans med en detaljerad experimentella strategi att mäta ditsatta bildande på målwebbplatsen. Detta protokoll beskriver ett grundläggande förhållningssätt och arbetsflöde för utredningar som syftar till att utveckla CRISPR/Cas9-baserade gen redigering för mänsklig behandling. Slutsatsen av detta arbete är att hotellets mutagenes sker till följd av CRISPR/Cas9 aktivitet under processen för punktmutation reparation. Detta arbete inrättar en standardiserad metod för att identifiera graden av mutagenes, som bör vara en viktig och kritisk aspekt av någon strategi som är avsedda för klinisk implementering.
Banbrytande studier av Mandecki (1986) visade permanenta förändringar i plasmid DNA med hjälp av oligonukleotider förvandlas till bakterier1, medan Walder och Walder (1986) genomförde liknande studier i jäst2. Kort därefter, publicerade Sherman och kollegor en serie skrifter som enkelsträngat oligonukleotider infördes i jästceller att göra ärftliga förändringar i gener3. Bygger på det banbrytande arbetet i mikrobiella celler, började Kmiec och kollegor utveckla unika monoterapi oligonukleotider som riktade enda bas reparation i däggdjursceller4. Detta koncept baserades på biokemiska data som visade att molekyler som bär RNA binder hårdare till målwebbplatsen än de består helt av DNA-baser. Även om det fanns många rapporter om genredigering framgång använder chimära oligonukleotider5,6,7, förblev redigering nivåer mycket varierande mellan experiment och över olika målcellen / kombinationer.
Enkelsträngat givare DNA är att föredra till dubbelsträngat givare DNA eftersom det är mindre sannolikt att integrera slumpmässigt platser inom den genom8. Dock är exogent introducerade enkelsträngat oligonukleotider benägna att snabb nedbrytning av cellulära nukleaser. Flera strategier för att skydda termini av oligonukleotider från nedbrytning har varit anställd. En exonuclease-skyddade, enkelsträngat DNA som innehåller önskade sekvensen var tillräcklig för att erhålla en redigering effektivitet i 0,1-1% intervall6. Förbättrad och mer konsekvent transfection tekniker, tillsammans med fenotypiska utläsningar, tillåtet för jämnare redigering av flera forskning grupper8,9,10,11, 12,13.
Under de senaste 10 åren, har det skett en betydande insats för att göra målceller mer mottagliga för genen redigering. En strategi sysselsätter moduleringen av cellcykeln14,15,16. Medan redigering frekvenser under normala reaktion villkor med enkelsträngat oligonukleotider (ssODNs) infördes i svävade odlade däggdjursceller mellan 0,1% och 1%, frekvenserna av genen redigering ökade 3 – till 5 – faldig när oligonukleotider infördes i celler under sin övergång genom den S-fasen. I en separat serie experiment visade Brachman och Kmiec (2005) att relativt höga nivåer av exakt gen redigering (3-5%) erhölls när 2’3 ‘ dideoxycytosine (ddC) var inkuberas i celler för 24 h innan oligonukleotiden17 . ddC minskar graden av DNA-replikering gaffel rörelse, vilket tyder på att genen redigering av ssODNs i replikera celler sannolikt omfattar införlivandet av ODNs i regionerna aktiv replikering11,18. Sammantaget dessa studier ledde till konceptet att givaren DNA blir införlivas en växande replikationsgaffeln som en del av den sanna verkningsmekanismen för genen redigering, oberoende av huruvida en dubbelsträngat paus är närvarande eller inte19. Således, korrigering av en punktmutation eller ersättande av ett segment av DNA inom kromosomen uppstår via en DNA ihopparning och singel-strand assimilering väg.
Inducerande slumpmässiga dubbelsträngat DNA raster i växande celler med småmolekylär ombud skapar en miljö där DNA replikeringshändelser har avstannat som cellens försök att reparera de skador20,21. Denna övergående nedgång av replikering gafflarna möjliggör en mer effektiv penetration av kromatinstruktur av enkelsträngat redigering oligonukleotider, förbättra mål tillgänglighet15. Skapandet av dubbelsträngat DNA bryter av läkemedel såsom VP16, bleomycin, eller camptothecin22,23, har visat sig stimulera gen redigering nivåer av nästan 10-faldigt, upp till 6-8%. Slumpmässiga dubbelsträngat DNA raster är dock önskvärt i en terapeutisk miljö.
Gen redigering med programmerbara nukleaser och oligonukleotider stimuleras också under celldelning24,25. När nukleinsyrebaserade leverans användes för att genomföra homologi-regisserad reparation i synkroniserade HCT 116 celler, Rivera-Torres och kollegor visat samma ökning av inriktning aktivitet när transkription aktivator-liknande effektor nukleaser (TALENs) anställda med enkelsträngat oligonukleotider, båda införs i en replikerande cell befolkningen26,27 . Mer nyligen, Bialk och kollegor visade att reparation av enda bas mutationer med enkelsträngat oligonukleotider och en matris med klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner Cas9 (CRISPR/Cas9) molekyler sker med högre effekt När cellen befolkningen söker igenom S fas28. CRISPR molekylen består av RNA och funktioner för att identifiera regionen inom målet DNA-sekvens som anges för klyvning. Cas9 är en bakteriell enzym vars funktion är att klyva dubbelsträngat DNA i en nucleolytic exchange reaktion. Således, CRISPR positioner anläggningen på genomisk mål, och Cas9 nuclease exekverar dubbelsträngat avbrottet. Lin et al. (2014) visade också vikten av cellcykeln för att uppnå höga frekvenser av genen redigering, med ett modifierat CRISPR/Cas9-ribonulceoprotien (RNP) immunkomplexmedierade leverans-system i primära neonatal fibroblaster, mänskliga embryonala stamceller, och andra cell linjer24. Således, förhållandet mellan gen redigering och cellcykelns förlopp för monoterapi gen redigering är tillämplig för kombinatoriska gen redigering med programmerbara nukleaser och givare DNA mallar. Medan den kombinatoriska metoden till genen redigering har fört samman en mängd partners med mallen givare DNA, använder de flesta arbetstagare i fältet CRISPR/Cas9 för att tillhandahålla funktionen dubbelsträngat paus. Detta val är baserad på den lätthet-av-använda av detta särskilda genetiska verktyg och den flexibilitet som det kan användas för att inaktivera geners funktion eller att införa en utländsk bit av DNA i en specifik plats. Generering av en knockout är tekniskt enklare jämfört med en gen ersättare, där införlivandet av ”rätt” eller normala kopior av en gen i webbplatsen sjukdom måste utföras med precision. Ett antal forskare är att identifiera och studera användningen av specifika läkemedel och reagenser som möjliggör korrigering av muterade baser och införandet av normala genetiska sekvenser i rätt position vid förhöjda frekvenser29.
Nyligen, Rivera-Torres o.a. 30 används kombinatoriska gen redigering, dra nytta av dubbelsträngat paus aktivitet ett specifikt utformat CRISPR/Cas9-system och den genetiska informationen som tillhandahålls av en enkelsträngat oligonukleotiden givare DNA-mall, att reparera en punktmutation i enkopia av genen förbättrade grönt fluorescerande protein (andra) integreras i HCT116-celler. Författarna drog fördel av detta välkarakteriserad modell cellen fodrar att utvärdera specificitet klyvning kring målwebbplatsen. Data visar att olikheter på målwebbplatsen finns, särskilt i celler som inte innehåller en korrigerad punktmutation. Detta manuskript, vi detalj och fokusera på den metod som används av dessa arbetstagare för att undersöka Hotellets mutationsanalys heterogenitet skapad av CRISPR/Cas9 gen redigering.
Gen redigering har vuxit fram som en mainstream vetenskaplig disciplin primärt på grund av uppkomsten av CRISPR/Cas9 systemet. Denna anmärkningsvärda väg, vilket underlättar adoptiv immunitet i bakterieceller, har varit repurposed som molekylära verktyg för att aktivera genomisk förändring i mänskliga kromosomer. CRISPR/Cas9 naturliga funktion är att inaktivera virus-DNA genom att införa dubbelsträngat DNA raster leder till fragmentering30,31. Denna aktivitet resulterar i förstörelsen av invaderande exogent DNA och leder till prokaryota immunitet som dämpar efterföljande infektion av den samma virala-partikeln. Otroligt, detta system uppvisar pneumonic beteende, däri det kan återaktivera specifika CRISPR gärna skapad av tidigare infektion händelser.
Effektiviteten och precisionen av genen störningar katalyseras av CRISPR/Cas9 har använts i många eukaryota genetiska system där målet var att inaktivera en fungerande gen32,33. När reduceras till dess basal nivå, består processen av två grundläggande steg. Först är en dubbelsträngat paus, medan andra förlitar sig på inneboende processen för icke-homolog slutet att gå (NHEJ) för att slutföra knockout. I de flesta fall, resultaten dubbelsträngat paus i skapandet av blunt-slutade, urkopplad kromosomala segment och enzymer involverade i NHEJ reagerar till kromosomala avbrottet och agera för att förena sig brutna ändarna. Denna process kan ibland innebära förlust av enskilda nukleotider på webbplatsen avhuggna. Förlusten av även några baser kan orsaka en frameshift och funktionella uttryck upphör. Användning av CRISPR/Cas9 skapa genetiska knockout genom att anlita den naturliga processen av NHEJ har revolutionerat eukaryota genetik; förlusten av DNA på målplatsen är både förutsägbar och förväntade.
I motsats till genen knockout, har ett antal forskare varit engagerade i ett försök att omdirigera och återanvända CRISPR/Cas9 aktivitet mot processen för homologi-regisserad reparation. Syftet med studierna är genen korrigering. I denna strategi kombineras CRISPR/Cas9 med en givare DNA-mall som innehåller den genetiska informationen att reparera ett medfött fel eller att infoga mutationer i friska gener. Tidiga rapporter belyser CRISPR/Cas9 anmärkningsvärd kapacitet att katalysera homologi-regisserad reparation anges (direkt eller indirekt) att processen ägde rum i en mycket exakt mode24,34. Vårt laboratorium har studerat homologi-regisserad reparation eller gen korrigering använder enkelsträngade oligonukleotider i ett försök för att definiera mekanism och reglerande kretsar kring den15,17,18 ,23. Vi har fokuserat främst på genen redigering enstaka punktmutationer, eftersom detta är den mest grundläggande genetisk mutation kända för att vara ansvarig för många ärftliga sjukdomar. Vår grundläggande kunskap om genen redigering ledde oss att ifrågasätta precisionen av CRISPR/Cas9 aktivitet i dessa reaktioner, sedan funktionen CRISPR/Cas9 i gen knockout resulterar i bildandet av indels. Vi använde en väldefinierad modellsystem, snarare än en icke-valbara ännu inte kliniskt relevanta gen, för att studera Hotellets mutagenes i en avgjort reduktionistiska mode. Med hjälp av en enkel målgenen, vid vilken gen korrigering kan mätas på både genotypisk och fenotypisk nivå, resonerade vi att heterogenitet som inträffar på målwebbplatsen kunde identifieras i en pålitlig och robust mode.
Våra data bekräftar att genen väletablerade redigering system, bestående av en mutant andra gen integreras i HCT116-celler, kan ge grundläggande information om generering av genetiska skador och processen för hotellets mutagenes. CRISPR/Cas9 och enkelsträngat oligonukleotiden givare DNA-molekyler som arbetar i tandem kan leda till exakt reparation av peka mutationen i den andra genen. Vi föreslår en ny modell för reparation av punktmutationer, en molekylär väg där givaren DNA fungerar som en replikering mall för reparation av muterade basen, en process som vi har kallat exakt30. Målpopulationen, inte uppvisar den korrigera fenotypen, visar en mängd celler som innehåller heterogena och allmänt allt DNA indels kring målwebbplatsen. I ungefär halva klonerna isolerade från okorrigerad befolkningen, observerades radering mutagenes på målwebbplatsen. Eftersom ingen tidigare rapport har indikerat att enkelsträngat oligonukleotider agerar som monoterapi genredigering verktyg kan inducera indels på målwebbplatsen, vi dra slutsatsen att CRISPR/Cas9 verksamhet ansvarar för dessa mutationer.
I detta manuskript ger vi en detaljerad metod så att genetisk heterogenitet på målplatsen kan mätas i en pålitlig och robust mode. Medan en enorm mängd uppmärksamhet har ägnats åt analys och kartläggning av off-site mutagenes, är det sannolikt att en heterogen mutation skapats på målwebbplatsen kommer att ha större effekt på framgång eller misslyckande av genen redigering i kliniska arenan. Ytterligare tekniker eller modifierade Cas9 proteiner kan krävas för att förbättra precisionen i homologi-regisserad reparation av medfödda rubbningar i däggdjursceller35. Vissa av dessa tekniker omfattar användning av extra oligonukleotider att fungera som en bro, håller kromosomala ändarna ihop och undvika destruktiva verkan av NHEJ. Anger graden av heterogenitet på målwebbplatsen genom genredigering verksamhet är och måste vara en viktig del av alla protokoll utformat för terapeutisk intervention.
The authors have nothing to disclose.
Författarna har inga bekräftelser.
McCoy’s 5A Modified medium | ATCC | 30-2007 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
L-glutamine | ATCC | 30-2214 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | ATCC | 30-2300 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ATCC | 30-2200 | No Calcium or magnesium |
Trypsin EDTA Solution | ATCC | 30-2101 | |
Aphidicolin 1mg | Thermo Fisher | AC611970010 | |
Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol | IDT | No catalog number since its made to your specific gene target. | |
CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol | IDT | 1072533 | |
S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg | IDT | 1074182 | |
IDTE Buffer | IDT | 11-01-03-01 | |
Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm | VWR | 10497-474 | |
Gene Pulser Xcell Electroporation Systems | BioRad | 1652660 | |
Bovine serum albumin lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE) |
Sigma | 05470-1G | |
EDTA (0.5 M), pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | AM9260G | |
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69581 | |
6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates | VWR | 10062-892 | |
Petri Dishes | Fisher | 12-565-90 | |
Conical Tubes (15 mL) (racked) | Thermo Fisher | AM12500 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |