बैक्टीरियल विकास के सटीक, उच्च प्रवाह विश्लेषण
Summary
बैक्टीरियल विकास के मात्रात्मक मूल्यांकन एक सिस्टम स्तर घटना के रूप में माइक्रोबियल फिजियोलॉजी को समझने के लिए आवश्यक है । प्रयोगात्मक हेरफेर और एक विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण के लिए एक प्रोटोकॉल पेश कर रहे हैं, सटीक, उच्च बैक्टीरियल विकास का प्रवाह विश्लेषण, जो सिस्टम जीव विज्ञान में ब्याज की एक प्रमुख विषय है के लिए अनुमति दी ।
Abstract
बैक्टीरियल विकास आधुनिक माइक्रोबियल फिजियोलॉजी के विकास में एक केंद्रीय अवधारणा है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रणालियों के स्तर पर सेलुलर गतिशीलता की जांच में । हाल के अध्ययनों से बैक्टीरियल वृद्धि और जीनोम के बीच संबंध की सूचना है व्यापक घटनाओं, जीनोम में कमी और transcriptome पुनर्गठन के रूप में । सही ढंग से विश्लेषण बैक्टीरियल विकास जीन कार्यों और सेलुलर घटकों के विकास पर निर्भर समंवय को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । तदनुसार, एक उच्च प्रवाह तरीके से बैक्टीरियल विकास की सटीक मात्रात्मक मूल्यांकन की आवश्यकता है । उभरते तकनीकी विकास नए प्रयोगात्मक उपकरण है कि बैक्टीरियल विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के अद्यतन की अनुमति प्रदान करते हैं । प्रोटोकॉल यहां शुरू की प्रतिलिपि और बैक्टीरियल विकास के सटीक मूल्यांकन के लिए एक उच्च अनुकूलित प्रयोगात्मक प्रक्रिया के साथ एक microplate पाठक कार्यरत हैं । इस प्रोटोकॉल के विकास के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया गया था कई पहले से वर्णित ई कोलाई उपभेदों । प्रोटोकॉल के मुख्य कदम इस प्रकार हैं: प्रतिलिपि परिणामों के साथ दोहराया परीक्षणों के लिए छोटी शीशियों में सेल शेयरों की एक बड़ी संख्या की तैयारी, ९६ के उपयोग के लिए अच्छी तरह से उच्च प्रवाह विकास मूल्यांकन के लिए प्लेटें, और दो प्रमुख के मैनुअल गणना मापदंडों (यानी, अधिक से अधिक वृद्धि दर और जनसंख्या घनत्व) वृद्धि की गतिशीलता का प्रतिनिधित्व । पारंपरिक कॉलोनी बनाने इकाई (CFU) परख है, जो कोशिकाओं है कि ग्लास ट्यूबों में समय पर आगर प्लेटों पर संस्कृति के मायने रखता है की तुलना में, वर्तमान विधि और अधिक कुशल है और विकास के परिवर्तन के अधिक विस्तृत लौकिक रिकॉर्ड प्रदान करता है, लेकिन एक सख्त है कम जनसंख्या घनत्व पर पता लगाने की सीमा । संक्षेप में, वर्णित विधि बैक्टीरियल विकास के सटीक और प्रतिलिपि उच्च प्रवाह विश्लेषण, जो वैचारिक निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए या सैद्धांतिक टिप्पणियों बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए लाभप्रद है ।
Introduction
सूक्ष्मजीवविज्ञानी अध्ययन अक्सर बैक्टीरियल कोशिकाओं और बैक्टीरियल विकास घटता है, जो बैक्टीरियल फिजियोलॉजी1,2,3की एक बुनियादी घटना का आकलन की संस्कृति के साथ शुरू करते हैं । आधारभूत संस्कृति के सिद्धांत प्रकाशित शोध साहित्य और पाठ्यपुस्तकों में व्यापक रूप से उपलब्ध हैं क्योंकि जीवाणु संस्कृति एक मूलभूत पद्धति है. बेंच के स्तर पर, पर्याप्त ध्यान परंपरागत रूप से विकास मीडिया और संवर्धन शर्तों के अनुकूलन पर ध्यान केंद्रित किया गया है, लेकिन विकास दर है, जो संभावना माइक्रोबियल फिजियोलॉजी के भी अधिक से अधिक समझ प्रदान करेगा नियंत्रण, नहीं किया गया है बड़े पैमाने पर4अध्ययन किया । तेजी से बढ़ते बैक्टीरिया के लिए, सेलुलर राज्य के एक प्रमुख पैरामीटर वृद्धि दर है, जो जीनोम, transcriptome, और proteome5,6,7,8 के साथ समंवित होने की सूचना दी गई है . इस प्रकार, बैक्टीरियल विकास के मात्रात्मक मूल्यांकन माइक्रोबियल फिजियोलॉजी को समझने के लिए महत्वपूर्ण है ।
बैक्टीरियल विकास का मूल्यांकन करने के लिए, प्रयोगात्मक बायोमास अनुमान के लिए इस्तेमाल किया अच्छी तरह से9,10 की स्थापना की और जैव रासायनिक, भौतिक, या ऑप्टिकल मैलापन के रूप में जैविक मानकों, का पता लगाने पर आधारित हैं । इसके अलावा, विश्लेषणात्मक विकास परिवर्तन के गतिशील गुणों को कैप्चर करने के लिए उपयोग किए गए तरीकों सामांयतः स्थापित रेखीय मॉडल11,12,13, उदाहरण के लिए, रसद समीकरणों पर आधारित हैं । विकास गतिशीलता आम तौर पर या तो ऑप्टिकल मैलापन को मापने या कॉलोनी बनाने इकाई (CFU) परख प्रदर्शन द्वारा संस्कृति में सेल विकास के समय पर नमूना प्राप्त कर रहे हैं । इन संवर्धन और पता लगाने के तरीकों की सीमा है कि डेटा बिंदुओं जनसंख्या गतिशीलता का एक सही प्रतिबिंब नहीं है क्योंकि माप अंतराल अक्सर घंटे में कर रहे है और क्योंकि संस्कृति की स्थिति (उदा, तापमान में परिवर्तन और वातन) की सैंपलिंग के समय गड़बड़ी की जाती है । संस्कृति और विश्लेषण तकनीक प्रौद्योगिकी और समझ में हाल की घटनाओं का उपयोग कर अद्यतन किया जाना चाहिए । microplate पाठकों में हाल के अग्रिमों बैक्टीरियल विकास की वास्तविक समय अवलोकन और काफी श्रम लागत में कमी की अनुमति देते हैं । इन उंनत उपकरणों का प्रयोग, बैक्टीरियल विकास पर नवीनतम अध्ययन उच्च प्रवाह माप14,15के लिए विश्लेषणात्मक तरीकों की सूचना दी है ।
इस प्रोटोकॉल के प्रयोजन के लिए एक उच्च प्रवाह तरीके से सटीक विकास गतिशीलता का मूल्यांकन है, जो मात्रात्मक अध्ययन के लिए मूल्यवान होगा कि अंततः कैसे विकास दर निर्धारित है और क्या कारकों की वृद्धि दर को प्रभावित करने के सवालों का पता है । प्रोटोकॉल सभी कारकों है कि जीवाणु विकास के दोहराया और सटीक quantitation के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए पते । प्रायोगिक विधि और विश्लेषण मुख्य पाठ में विस्तार से वर्णित हैं । इस विधि एक उच्च प्रवाह तरीके से बैक्टीरियल विकास के सटीक और प्रतिलिपि विश्लेषण परमिट । विज्ञानियों अपने प्रायोगिक सबूत से अतिरिक्त मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल भी प्रणाली जीवविज्ञान में अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि वैचारिक निष्कर्ष आकर्षित या विकास का एक सैद्धांतिक सिंहावलोकन प्राप्त करने का प्रयास ।
Protocol
1. विकास माध्यम की तैयारी करना
नोट: मिनिमल मीडियम M63 की रासायनिक संरचना इस प्रकार है: ६२ मिमी K 2 HPO 4 , ३९ मिमी KH 2 पो 4 , 15 मिमी (NH 4 ) 2 सू 4 , १.८ & #181; m FeSO 4 , 15 & #181; एम thiamine-एचसीए?…
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम तेजी से बढ़ती कोशिकाओं के एक आम शेयर की तैयारी और microplate पर विभिंन पदों पर कई कुओं में एक ही नमूने की प्रतिकृति शामिल हैं । पहले, विज्ञानियों एक रात पूर्व संस्कृति से संस्कृति…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Materials
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
References
- Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
- Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287 (2015).
- Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
- Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808 (2013).
- Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
- Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).
- Madrid, R. E., Felice, C. J. Microbial biomass estimation. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).
- Harris, C. M., Kell, D. B. The estimation of microbial biomass. Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).
- Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
- Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
- Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).
- Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).
- Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).
- Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).
