Summary
Evaluación cuantitativa del crecimiento bacteriano es fundamental para entender la fisiología microbiana como un fenómeno de nivel de sistemas. Se introduce un protocolo de manipulación experimental y un enfoque analítico, permitiendo análisis precisos, alto rendimiento de crecimiento bacteriano, que es un tema clave de interés en biología de sistemas.
Abstract
Crecimiento bacteriano es un concepto central en el desarrollo de la moderna fisiología microbiana, así como en la investigación de la dinámica celular a nivel de sistemas. Estudios recientes han reportado correlaciones entre el crecimiento bacteriano y eventos de todo el genoma, como reorganización de reducción y transcriptoma de genoma. Analizar correctamente el crecimiento bacteriano es fundamental para entender la coordinación dependiente del crecimiento de las funciones de genes y componentes celulares. Por consiguiente, se requiere la evaluación cuantitativa precisa del crecimiento bacteriano en forma de alto rendimiento. Desarrollos tecnológicos emergentes ofrecen nuevas herramientas experimentales que permiten la actualización de los métodos utilizados para el estudio de crecimiento bacteriano. El protocolo introducido el emplea a un lector de microplacas con un procedimiento experimental altamente optimizado para la evaluación precisa y reproducible del crecimiento bacteriano. Este protocolo fue utilizado para evaluar el crecimiento de varias cepas de Escherichia coli ha descrito anteriormente. Los pasos principales del protocolo son las siguientes: la elaboración de un gran número de poblaciones de células en pequeños viales de repetidas pruebas con la reproducibilidad, la utilización de placas de 96 pocillos para la evaluación del crecimiento de alto rendimiento y el cálculo manual de dos grandes parámetros (es decir, densidad de población y tasa de crecimiento máxima) que representa la dinámica de crecimiento. En comparación con el tradicional análisis de unidad (UFC) formadoras de colonias, que cuenta con las células que se cultivan en tubos de vidrio con el tiempo en placas de agar, el presente método es más eficiente y proporciona más registros temporales de los cambios de crecimiento, pero tiene una más estricta límite de detección a densidades de población bajas. En Resumen, el método descrito es ventajoso para el análisis de alto rendimiento precisa y reproducible del crecimiento bacteriano, que puede utilizarse para sacar conclusiones conceptuales o hacer observaciones teóricas.
Introduction
Estudios microbiológicos a menudo comienzan con el cultivo de las células bacterianas y la evaluación de las curvas de crecimiento bacteriano, que representan un fenómeno fundamental de la fisiología bacteriana1,2,3. Principios básicos de la cultura están ampliamente disponibles en la literatura de los estudios publicados y los libros de texto porque la cultura bacteriana es una metodología fundamental. A nivel Banco, considerable atención se ha centrado tradicionalmente en optimización de medios de cultivo y condiciones de cultivo, pero controla la tasa de crecimiento, que probablemente daría aún mayor comprensión de la fisiología microbiana, no ha sido ampliamente estudiados4. Para el crecimiento exponencial de bacterias, un parámetro clave del estado celular es la tasa de crecimiento, que se ha divulgado para ser coordinado con el genoma, transcriptoma y proteoma5,6,7,8 . Así, la evaluación cuantitativa del crecimiento bacteriano es crucial para la comprensión de fisiología microbiana.
Para evaluar el crecimiento bacteriano, los métodos experimentales utilizados para estimar la biomasa están bien establecidos9,10 y se basan en la detección de parámetros bioquímicos, físicos o biológicos, como la turbidez óptica. Además, los métodos analíticos utilizados para capturar las propiedades dinámicas de los cambios de crecimiento se basan comúnmente en modelos no lineales establecidos11,12,13, por ejemplo, las ecuaciones logísticas. Dinámica de crecimiento se adquiere generalmente por tiempo muestreo del crecimiento celular en cultivo por medición de turbidez óptica o realizar pruebas de unidad (UFC) formadoras de colonias. La limitación de estos métodos de cultivo y detección es que los puntos no son un fiel reflejo de la dinámica de la población porque los intervalos de medición son a menudo en horas y la condición de la cultura (p. ej., cambios de temperatura y aireación) se altera en el momento de muestreo. Técnicas de cultivo y análisis deben ser actualizadas con los acontecimientos recientes en la tecnología y la comprensión. Los avances recientes en los lectores de microplacas permiten la observación en tiempo real del crecimiento bacteriano y disminuyen significativamente los costos laborales. Usando estos dispositivos avanzados, los estudios más recientes sobre crecimiento bacteriano han publicado métodos analíticos para mediciones de alto rendimiento14,15.
El propósito de este protocolo es evaluar la dinámica de crecimiento precisa de una manera de alto rendimiento, que será de gran valor para estudios cuantitativos que en última instancia, responder las preguntas de cómo se determina la tasa de crecimiento y los factores que afectan la tasa de crecimiento. El protocolo aborda todos los factores que deben tenerse en cuenta para la cuantificación precisa y repetible de crecimiento bacteriano. El método experimental y el análisis se describen en detalle en el texto principal. Este método permite el análisis preciso y reproducible de crecimiento bacteriano en forma de alto rendimiento. Microbiólogos pueden utilizar este protocolo para obtener resultados cuantitativos adicionales de su evidencia experimental. Este protocolo también puede utilizarse para estudios en biología de sistemas que tratan de sacar conclusiones conceptuales o para lograr un resumen teórico de crecimiento.
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Protocol
1. preparar el medio de crecimiento
Nota: la composición química de M63 medio mínimo es el siguiente: 62 m m K 2 HPO 4, 39 m m KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4 1,8 μm FeSO 4, 15 μm tiamina-HCl, 0,2 mM MgSO 4 y 22 mM de glucosa. M63 se hace mezclando tres soluciones: solución X 5, 20% de glucosa y solución de MgSO 4 tiamina. Almacene todas las soluciones a 4 ° C.
- Preparación de la solución de X 5
- para preparar solución de FeSO 4, utilice una pipeta eléctrica y una pipeta serológica desechable para agregar ddH 2 O a un tubo de centrífuga de 50 mL. Utilizar un P-200 Añadir 0,06 mL de HCl para obtener 36 mg FeSO 4 0.01 M HCl. Añadir-7 H 2 O y mezcle bien.
- Medir 160 mL ddH 2 O en una probeta y añadir un vaso de precipitados de 500 mL. Agregue lo siguiente en este orden: 10,72 g K 2 HPO 4, 5,24 g KH 2 PO 4, 2.0 g de (NH 4) 2 SO 4 y 0,5 mL de solución de FeSO 4 (preparado en el paso 1.1.1).
- Usando un medidor de pH de precisión, ajustar el pH a 7.0 agregando 2 M KOH. Vierta la solución en una probeta y añadir ddH 2 O a un volumen total de 200 mL. Esterilizar la solución utilizando una unidad de filtración de 250 mL (PVDF, 0,22 μm).
- Preparación de la solución de glucosa 20%
- medir 200 mL ddH 2 O en una probeta y verter un vaso de precipitados de 500 mL. Mientras se mezcla con un agitador magnético, agregar 50 g de glucosa. Diluir la solución en una probeta hasta un volumen total de 250 mL. Esterilizar la solución como se describe en el paso 1.1.3.
- Preparación de la solución de MgSO 4 tiamina
- añadir 150 mL ddH 2 O un vaso de precipitados de 500 mL. Mientras se mezcla con un agitador magnético, agregar 1,0 g de tiamina-HCl y 10 g de MgSO 4-7 H 2 O. diluir la solución en una probeta hasta un volumen total de 200 mL. Esterilizar la solución como se describe en el paso 1.1.3.
- Preparación mínima M63 medio
- Coloque la solución de X 5, la solución de glucosa 20%, la solución de MgSO 4 tiamina, una pipeta electrónica, una pipeta P-200 y puntas de pipeta de 200 μL en un banco limpio.
- ML 155,8 ddH 2 O en una probeta y verter en un vaso de precipitados de 500 mL.
- Usando la pipeta electrónica y pipeta serológica desechable, agregar 40 mL de solución de 5 X y solución glucosa al de 20% 4 mL con el ddH medido 2 O. Luego, agregar 0,2 mL de solución de MgSO 4 tiamina con la P-200. Esterilizar la solución como se describe en el paso 1.1.3.
2. Preparar el caldo glicerol
cultura- celular
Nota: las cepas bacterianas (p. ej., W3110 y sus genomas reducidos) están disponibles de organizaciones Banco de tensión. Las cepas se obtienen generalmente en forma de colonias en placas de agar.- Colocar cinco tubos de cristal esterilizado con tapones de goma de silicona, una pipeta electrónica, P-1,000, puntas de pipeta de 1.000 μl, P-200, puntas de pipeta de 200 μl y las cepas target (colonias en las placas) en un banco limpio.
- Exponga la boca del tubo de vidrio con un mechero de Bunsen antes de abrir el tapón de goma de silicona. Exponer el tapón de goma de silicona para la llama después de que se abre el tubo y luego ligeramente Coloque la tapa en el tubo de cristal.
- Utilice la pipeta electrónica y pipeta serológica desechable para añadir a uno de los tubos de vidrio y 4,5 mL M63 a los otros cuatro tubos 5 mL M63.
- Utilice la punta del P-200 una colonia y inocular en el tubo de vidrio que contiene 5 mL M63.
- El tubo de vórtice para hacer una suspensión. Entonces, la solución diluida 10 veces al transferir 0,5 mL de esta solución a uno de los cuatro tubos conteniendo 4,5 mL M63.
- Repetir el proceso descrito en el paso 2.1.5 para los tubos restantes. Una serie de diluciones con cinco concentraciones diferentes (diluciones de 1, 10, 100, 1000 y 10.000) ya está listo.
- Esterilizar las bocas de los tubos de vidrio y los tapones de goma de silicona como se describe en el paso 2.1.2. Los tubos con los tapones de la tapa. Evitar la contaminación por no arrugar los tapones de goma de silicona.
- Colocar cinco tubos en una incubadora con agitación a 37 ° C y se agita a 200 rpm. Incubar el cultivo durante la noche o para h. de 10 a 30
- Selección de la cultura para el stock de glicerol
- Coloque el medio precalentado temperatura M63, P-1,000, puntas de pipeta de 1.000 μl y una cubeta desechable en un banco limpio.
- Añadir 1000 μl M63 a una cubeta desechable con un P-1, 000. Coloque la cubeta desechable en un espectrofotómetro, iniciar el programa en una longitud de onda fija de 600 nm y medir el espacio en blanco.
- Hacia los tubos de vidrio de cinco de la incubadora sacude el Banco limpio.
- M63 descartar de la cubeta desechable y añadir 1.000 cultura μl a la misma cubeta desechable con un P-1, 000. Medir la turbidez óptica de la cultura de célula (OD 600) como se describe en el paso 2.2.2.
Nota: Para evitar cualquier contaminación y lograr una medición precisa, exponga los tubos de vidrio y los tapones de la llama como se describe y el vórtice de la cultura antes de muestreo. Para asegurar resultados confiables, se recomiendan mediciones repetidas, sobre todo cuando la densidad celular es baja. - De los cinco cultivos celulares, elegir una que se encuentra en la fase temprana de crecimiento exponencial (OD 600 = 0.01 - 0.05) para el caldo glicerol.
Nota: Si varias culturas tienen densidades dentro de la gama óptima, el uno más cercano a 0,05 es comúnmente seleccionado.
- Hacer las poblaciones de glicerol por repetidas pruebas.
Nota: Esto se describe para la preparación de las diez poblaciones. Cantidades más grandes o más pequeños se pueden hacer según los requisitos experimentales.- Coloque la solución de glicerina 60% esterilizada, diez esterilizar microtubos de 1,5 mL, P-1,000 y P-200, puntas de pipeta de 1.000 y 200 μl y un microtubo en un banco limpio.
- Añadir 250 μl esterilizada 60% solución de glicerol y 750 μl de la cultura de la celda seleccionada a los microtubos de 1,5 mL y mezclar mediante pipeteo.
Nota: El volumen de acciones es variable, pero siempre mantener una relación de 1:3 de 60% de glicerol para cultivo celular; Esto resulta en una concentración final de glicerol al 15%. - Colocar los nueve microtubos restantes en el stand de microtubos y dispensar 100 μl de la mezcla preparada en el paso 2.3.2 a cada tubo. Ahora hay diez poblaciones de glicerol idénticos para su uso futuro.
- Almacenar las existencias en un congelador a -80 ° C.
3. Adquisición de las curvas de crecimiento
- configurar el lector de microplacas.
Nota: Los términos que se muestra en las comillas muestran el fraseo específico utilizado en el lector de placa utilizado aquí (véase la tabla de materiales).- Abrir el software. Abierto " protocolos de " en " el administrador de tareas " y elija " crear nuevo ". Elegir " protocolo estándar ".
- Abierta " procedimiento " y ajustar la configuración. Abierto " temperatura " y seleccione " en la incubadora ". Set " temperatura " a 37 ° C y " gradiente " a 0 ° C. Revise " precalentamiento " antes de continuar con el siguiente paso. Abierto " empezar cinética ", establecer " tiempo de ejecución " para 24:00:00 o 48:00:00, y " intervalo de " de 00:30:00 o 1:00.
Nota: Tarda aproximadamente 1 minuto para leer un entero 96 placa bien. - Abierta " Shake " y " modo de agitar " como " lineal ". Compruebe " Constitution Shake " y " frecuencia " en 567 cpm. Abierto " leer ", compruebe " absorbancia ", " punto final/cinética ", y " monocromadores. " Set " longitud de onda " 600.
- Clic " validar " para confirmar que el procedimiento es correcto. Haga clic " guardar " para guardar como un nuevo programa para el uso futuro.
- En tiempo real de grabación de crecimiento
- dibujar un pictograma de la placa de 96 pozos (8 × 12 tabla) para indicar las posiciones de las muestras de cultivo inoculados en la placa de 96 pocillos. Imprimir la tabla y utilizarla como referencia para el experimento de.
Nota: Los pozos situados en los bordes de la microplaca sólo deben contener medio en blanco debido a la evaporación.
Microplacas de fondo - lugar un piso de 96 pocillos estéril con tapa P-1000, puntas de pipeta de 1000 μl, P-200, puntas de pipeta de 200 μL, varios microtubos de 1,5 mL, una pipeta multicanal de 8, un reservorio de reactivo esterilizada, temperatura M63 y el glicerol acciones (preparadas en el paso 2.3) en un banco limpio.
- Añadir aproximadamente 25 mL M63 para el depósito de reactivo. Uso de este stock de reserva de todos los pasos siguientes.
- Agregar 900 μl M63 en los microtubos en preparación para hacer diluciones seriadas.
- Descongelar el stock de glicerol a temperatura ambiente. Agregar 900 μl M63 stock de glicerol descongeladas y vortex. Esto resulta en una dilución de 10 veces del original stock de glicerol de.
- Transferir 100 μl de la dilución de 10 veces a otro microtubo que contiene 900 μl de M63 y vortex. Esto resulta en una 100-fold dilución.
- Repetir paso 3.2.6 hasta conseguir el número de diluciones deseado es.
- Llenar los pozos en el borde de la microplaca con 200 μL M63 utilizando una pipeta de 8 canales (P-200).
Nota: Estos pozos se pueden utilizar como el espacio en blanco. - Carga 200 μL de cada muestra en pasos 3.2.4 - 3.2.7 en los pocillos de la microplaca según la tabla de referencia (paso 3.2.1) diluida. Vórtice el antes las muestras diluidas de carga y carga la misma muestra en pozos múltiples en variados lugares en la placa de.
- Coloque la microplaca de 96 pocillos en el lector de placas de.
- Abierta " leer ahora " en " el administrador de tareas " y elegir el programa (sección 3.1). Haga clic en " OK " para comenzar a medir. Guardar la grabación como un nuevo archivo experimental para análisis de datos (sección 4).
- dibujar un pictograma de la placa de 96 pozos (8 × 12 tabla) para indicar las posiciones de las muestras de cultivo inoculados en la placa de 96 pocillos. Imprimir la tabla y utilizarla como referencia para el experimento de.
4. Análisis de datos
- exportar los resultados de los datos en tiempo real tasa de crecimiento (sección 3.2) a una memoria USB stick como un archivo de texto.
Nota: Un resultados con formato de 96 pocillos (curvas) se mostrarán en el lector de la placa en tiempo real. Los registros por hora (valores de OD) pueden ser exportados como una tabla; las filas y las columnas representan los números bien (por ejemplo, A1, B1) y el tiempo de medición (por ejemplo, 00:00:59), respectivamente. - Abrir el archivo de texto con un software de hoja de cálculo.
- Copiar las lecturas cada hora de 600 OD de la microplaca de 96 pozos en una nueva hoja de cálculo para su posterior análisis.
- Restar el fondo lee en el tiempo cero de las lecturas cada hora de cada muestra bien.
Nota: Para mayor comodidad, el valor medio del espacio en blanco pozos que contienen M63 (paso 3.2.8) puede ser utilizado como el valor de fondo. - Calcular la media de cinco consecutivos OD 600 lecturas para estimar la densidad de población máxima.
Nota: El mayor valor promedio de OD 600 cinco Lee consecutivo se define como el máximo de OD 600 de la curva de crecimiento correspondiente. - Calcular la tasa de crecimiento, μ (h -1), aplicando la siguiente ecuación para todos los pares de valores consecutivos de OD 600:
Nota: en esta ecuación, C y C i + 1 representan los valores de OD 600 de cualquier dos puntos de tiempo consecutivos (t y t i + 1, ««««respectivamente). LN indica logaritmo natural. - Calcular los cambios en la tasa de crecimiento en el tiempo basados en la hora OD 600 Lee según el paso 4.6. Calcular la media y la desviación estándar de cinco crecimientos consecutivos para estimar la tasa de crecimiento máxima.
Nota: El promedio mayor con la menor desviación estándar se define como la tasa de crecimiento máxima de la curva de crecimiento correspondiente.
5. Confirmando la tendencia Global de las lecturas de 96 pocillos (opcional)
Nota: tanto la placa del lector y la placa de 96 pocillos consumible pueden causar mediciones sesgadas. Para lograr resultados cuantitativos muy precisos y reproducibles, confirmando la tendencia global de la placa de 96 pocillos está altamente-recomendado.
- Preparar la placa de 96 pocillos y el lector de la placa para la prueba de sesgo, como se describe en la sección 3.2.2.
- Añadir 20 mL M63 a un tubo de centrífuga de 50 mL esterilizado. Añadir el caldo glicerol al mismo tubo de centrífuga y vortex. Transferir la solución suspendida a un reservorio de reactivo esterilizada.
- Use una pipeta de 8 canales para transferir 200 μL de la solución de suspensión a la placa de 96 pozos.
- Coloque la placa de 96 pocillos en el lector de placas y comenzar la medición.
- Registro hora OD 600 Lee y analiza como se describe en la sección 4. Comparar la densidad de población y tasa de crecimiento máxima calculada de cada pozo para determinar sesgo localización de 96 pocillos Lee.
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Representative Results
El método descrito proporciona un medio para capturar la dinámico crecimiento bacteriano de manera continua, de alto rendimiento utilizando un lector de formato de 96 pozos que tiene varias mediciones de densidad óptica a diferentes intervalos de tiempo (desde minutos a horas o días). Las curvas de crecimiento de una variedad de cepas de e. coli expresan diversos genomas pueden adquirirse precisamente en un solo experimento (figura 1A). En comparación con el método descrito, el método tradicional (el ensayo de UFC) generalmente requiere más largos intervalos de tiempo de muestreo (figura 1B) y es mano de obra si se requiere el cultivo múltiple. Además, cada tiempo de muestreo de cultivo para el ensayo de UFC requiere el uso de un pequeño volumen de cultivo celular que no puede utilizarse para mediciones repetidas. Además, un número limitado de puntos de tiempo para la detección puede pasar por alto los puntos de muestreo que son necesarios para el correcto cálculo de la tasa de crecimiento y el máximo de OD600. Sin embargo, el ensayo de UFC tiene un límite de detección inferior, 103 - 104 células/mL, lo que por lo menos dos órdenes de magnitud más sensible que el análisis de turbidez óptica (OD600= 0.001, que tiene un límite de detección de aproximadamente 105 -106 células/mL). El método descrito proporciona una práctica y eficiente herramienta experimental para estudios a nivel de sistemas en la dinámica de crecimiento.
Una ventaja clave de este protocolo es que se requiere de mediciones repetidas de una acción común de glicerol. Tener múltiples cultivos celulares con diferentes tasas de dilución en fase temprana de crecimiento exponencial es muy útil porque permite a los investigadores a determinar el tiempo de la cultura en cualquier escala de tiempo y evita tener saturada de culturas debido a eventos impredecibles. Repetidas mediciones de las acciones comunes, que fueron preparadas desde una de las cinco culturas iniciadas utilizando las tasas de dilución diferentes como se describe en el protocolo sección 2.2 (figura 2A), presentada resultados muy similares de crecimiento y cultivo Análisis de la dinámica. Múltiples curvas de crecimiento de repetidos e independientes medidas (N = 6) bien superpuestas (figura 2Bpanel superior), con poca varianza (figura 2Bpanel inferior), especialmente durante la fase exponencial ( Figura 2B, área sombreada). Estos resultados sugieren que el método descrito proporciona resultados altamente reproducibles.
Se recomienda estimar el sesgo global de la muestra de 96 pocillos. En el presente método, el sesgo global se calcula controlando el crecimiento de la de tipo e. coli W3110 la tensión según se describe en la sección 5 del protocolo. Por ejemplo, las tasas de crecimiento calculan de las curvas de crecimiento mostraron una variación significativa entre los 96 pocillos (Figura 3A), que representan la fluctuación mundial derivada de la manipulación de datos y los errores del dispositivo. Estos errores se pueden enmascarar por la carga de la misma muestra en pozos múltiples en diversas localizaciones en la placa. Por el contrario, el máximo de OD600 mostró un sesgo claramente dependiente de la ubicación de los resultados, como se observaron cambios graduales a lo largo de la dirección vertical, es decir, el máximo de OD600 gradualmente pasó de los pocillos de la columna 2 a los de columna 11 de la placa de 96 pocillos (figura 3B). Para evitar resultados sesgados, la misma muestra se recomienda en los pozos localizados en ambos lados de la placa de 96 pocillos para medidas repetidas. El sesgo de localización en valores máximos de600 de OD se supone que el resultado de la variación en las tasas de evaporación, que son determinadas por la calefacción y la eficiencia de sellado. En comparación con los pozos en medio de la microplaca de 96 pocillos, los pozos situados en los bordes tendieron a mostrar valores relativamente más altos, que reflejan las tasas de evaporación variadas resultantes del efecto del lacre de la microplaca. Además, puesto que otras microplacas de 96 pozos sometidos a la misma prueba de sesgo demostraron cambios direccionales similares en donde el pozo se encuentra en la placa base, la medida de la diagonal puede depender del lector de placas. Por lo tanto, es importante evaluar el sesgo global de 96 pocillos lee en estudios que determinan la densidad de población máxima. Lectores de placa disponibles comercialmente tienen su sesgo global específica causada por el calentamiento y sacudiendo las eficiencias y las microplacas de 96 pocillos se diferencian en gran medida por eficiencia de sellado.
Este método está diseñado para el análisis sistemático del crecimiento bacteriano, y puede ser utilizado para analizar dos parámetros principales, es decir, densidad célula y tasa de crecimiento, que comúnmente se aplican en una amplia variedad de campos, tales como biología de sistemas, evolución, y Ecología16,17. Se introduce el cálculo manual utilizando hoja de cálculo para mostrar la transformación de la materia prima Lee para producir los parámetros evaluados de la densidad de célula y tasa de crecimiento. Primero se calculan las tasas de crecimiento por hora el raw Lee de la curva de crecimiento (Figura 4A) según protocolo sección 4.6 como un conjunto de datos de cambios secuenciales en las tasas de crecimiento (Figura 4B). Las medias y desviaciones estándar de cada cinco crecimientos consecutivos son adquiridas secuencialmente (figura 4-D), y la mayor tasa de crecimiento con la menor desviación estándar se define como la tasa de crecimiento máxima del crecimiento curva (figura 4-D, destacó). La densidad celular máxima (OD600) se analiza de manera similar (figura 4E-F). La densidad de célula y tasa de crecimiento calculada posteriormente son sometidos a más análisis. Tenga en cuenta que los cálculos descritos pueden automáticamente realizar plataformas computacionales (lenguajes de programación), por ejemplo, R y Python.
Figura 1 las curvas de crecimiento adquiridas con diversos métodos. (A) múltiples adquisiciones de las curvas de crecimiento. Las curvas de crecimiento de cuatro diferentes cepas de e. coli expresan diversos genomas fueron obtenidas de un modo de alto rendimiento. Las células de e. coli fueron cultivadas en M63 medio mínimo, y los cambios en OD600 lecturas fueron registrados por un lector de microplacas a intervalos de 1 h. Las cepas de izquierda a derecha el tipo salvaje de e. coli W3110 (número 0) y sus genomas reducidos números 1, 10 y 18 (describen previamente5), respectivamente. (B) curva de crecimiento obtenida utilizando el ensayo de UFC. El tipo células de e. coli (número 0) fueron cultivadas y se tomaron muestras en los puntos de tiempo indicado durante varias horas. Los cambios de crecimiento se estimaron usando el ensayo de UFC. Círculos abiertos indican la grabación o puntos de muestreo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Reproducible repetidas medidas de. Culturas durante la noche (A) de la tasa de dilución variadoss. las células de e. coli se inocularon en tubos con múltiples tasas de dilución, que varió de 1-10,000-fold, como se indica. Las células fueron cultivadas a 37 º C con agitación a 200 rpm durante aproximadamente 12 horas. Los valores finales de la600 del OD de las culturas de cinco célula (de izquierda a derecha) fueron 1.51, 0.74, 0.05, 0.008 y 0.001, respectivamente. La cultura con OD600 de 0.05 se utilizó para la acción común de glicerol. (B) medidas altamente reproducibles. Seis curvas de crecimiento independientes (líneas arriba, gris) de la misma cepa de e. coli fueron adquiridas y calculadas a partir de seis posiciones en la microplaca y dos viales de la acción común de glicerol. La línea negra representa el promedio de las curvas de crecimiento de 6. Los coeficientes de variación (CV) de las seis mediciones repetidas fueron calculado (abajo), y los constantes puntos bajos son sombra de color rosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Sesgo Global Figura 3 del formato de 96 pozos. Mapa de calor (A) de las tasas de crecimiento. La población de células de e. coli fue suspendida en M63 medio mínimo y cargada igualmente de los 96 pocillos de la microplaca (representado como una tabla de 12 × 8). Los cambios en OD600 fueron obtenidos usando el lector de microplacas, tal como se describe en la sección 5 del protocolo. La gradación de blanco a rojo indica las tasas de crecimiento de 0,7 a 0,9 h-1. (B) mapa de calor de la OD máximo600. La gradación de blanco a rojo indica los valores de600 OD máximos de 0.9 a 1.2. Los cálculos de la tasa de crecimiento y máximo OD600 son como se describe en la figura 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 análisis de las curvas de crecimiento. (A) datos de las curvas de crecimiento. Las lecturas de600 por hora de OD se trazan contra el tiempo de la cultura. Círculos abiertos indican los tiempos de muestreo. Temporal (B) cambios en las tasas de crecimiento. Las tasas de crecimiento por hora entre dos consecutivos OD600 lecturas se calculan según la ecuación descrita en 4.6. (C) significa que las tasas de crecimiento. La media de cinco crecimientos consecutivos se calculan a las tasas de crecimiento suave. (D) desviaciones estándar de las tasas de crecimiento promedio. Se calcula la desviación estándar de las tasas de crecimiento consecutivas cinco mismo. La tasa de crecimiento máxima con la menor desviación de estándar está resaltada en rojo. (E) significa OD600. Se calcula la media de cinco consecutivos OD600 valores para determinar el OD lisa600. (F) desviaciones estándar de la media OD600 . Se calcula la desviación estándar de los mismos cinco consecutivos OD600 valores. El máximo de OD600 con la desviación estándar más pequeña está resaltado en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Pasos críticos en el protocolo incluyen la preparación de una acción común de crecimiento exponencial las células y la replicación de las mismas muestras en pozos múltiples en diversas posiciones en la microplaca. Previamente, microbiólogos comenzaron la cultura de una cultura de la noche. Mientras que este método puede reducir el tiempo de retraso del crecimiento bacteriano, es difícil de conseguir las curvas de crecimiento reproductivo. Como se muestra en la figura 2, las mediciones independientes utilizando los stocks de glicerol común dio lugar a las curvas de crecimiento casi idénticos, que ofrecen resultados reproducibles y precisos. Como se muestra en la figura 3, pozos en diferentes lugares de dan lecturas ligeramente distintas, que se considera el fondo global de las mediciones. Para la evaluación cuantitativa del crecimiento bacteriano, se debe considerar esta situación. Inoculación de muestras en pocillos múltiples en localizaciones variadas placa para replicación experimental es muy recomendable para tener en cuenta el sesgo global.
Además de manejar errores, se deben considerar la modificación y resolución de problemas derivados de los dispositivos experimentales y suministros. Varios lectores de microplacas avanzada están comercialmente disponibles. Muestran una amplia variación en características, tales como el método de ajuste de la longitud de onda de luz, el modo de calefacción o de refrigeración y la forma y frecuencia de los temblores. Basándonos en nuestra experiencia, evaporación debe abordarse en estudios de alto rendimiento debido a cambios en el volumen del líquido influyen grandemente OD600 lecturas. Evaporación es causada por el método de calefacción utilizado por los lectores de microplacas y la arquitectura de las placas. Los dos modos de calefacción comúnmente implementado en los lectores de microplacas comercial son la calefacción por aire caliente y calefacción con una placa caliente. El lector de microplacas utilizado en este protocolo utiliza la placa como un método de calentamiento para disminuir la evaporación porque el medio en la microplaca se seca rápidamente en el aire caliente que sopla. Las placas también deben ser cuidadosamente seleccionados. Microplacas de 96 diferentes pocillos (con tapas) causan diferentes niveles de evaporación. El método descrito utiliza el formato de la placa con una tapa cubierta profunda, que reduce la evaporación.
Por otra parte, si el estudio exige el análisis de la fase estacionaria de la curva de crecimiento, entonces la forma y frecuencia de temblores en el lector de microplacas deben tenerse en cuenta. Agitación durante la cultura asegura que el crecimiento las células se suspenden uniformemente en los medios de comunicación. Agitación inadecuada o baja frecuencia pueden causar las células alrededor del borde del pozo o en el centro con una densidad alta, dando por resultado falsas lecturas que son inferior o superior a la real lee la pila. El método descrito utiliza lineal, bidireccional temblando. Mientras que el modo de agitación en forma de 8 es probablemente suficiente, no se recomienda el modo circular de agitación.
La principal limitación de este método es la evaporación del medio de cultivo celular. Puesto que el volumen máximo de la cultura es pequeño, es decir, 200 μL, incubación a 37 ° C produce evaporación importante. Así, este método no es adecuado para el cultivo de más de 48 h. Además, cultivos de células de baja densidad deben evitarse porque detección óptica (OD600) se limita a estas densidades. Cuando se consideran juntos, células/cepas de crecimiento muy lentas o muy baja concentración inicial las culturas no son preferidas, ya que requieren más tiempo y son por debajo del límite de detección de OD600.
Este método produce mediciones precisas, alto rendimiento, que son muy ventajosas para encuestas sistemáticas. Como un resultado representativo, este método permite para evaluar una variedad de cepas de e. coli con varias secuencias genómicas o medio fácil y reproducible5. En comparación con los métodos tradicionales de cultivo en tubos y medir manualmente muestras en diferentes puntos temporales, el método descrito es menos trabajo y tiempo intensivo. Futuras aplicaciones y desarrollo del método se supone que implican la automatización de la manipulación experimental y análisis computacional. Aplicación automática de medición y robótica conducirá a un método altamente eficiente y confiable de evaluar el crecimiento de la célula y realizar pruebas de supervivencia usando células bacterianas y de mamíferas.
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Disclosures
Agradecemos a Kohei Tsuchiya para dar el ejemplo de ensayo de UFC. Este trabajo fue parcialmente apoyado por una subvenciones para la investigación científica (C) no. 26506003 (a BWY) desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología, Japón.
Acknowledgments
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
References
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