Summary
Kvantitativ utvärdering av bakteriell tillväxt är nödvändig för att förstå mikrobiell fysiologi som system-nivå fenomen. Ett protokoll för experimentell manipulation och en analytisk metod introduceras, vilket möjliggör precisa, hög genomströmning analys av bakterietillväxt, som är en viktig fråga av intresse i systembiologi.
Abstract
Bakteriell tillväxt är ett centralt begrepp i utvecklingen av moderna mikrobiell fysiologi, liksom i utredningen av cellulära dynamics på systemnivå. Nyligen genomförda studier har rapporterat korrelationer mellan bakterietillväxt och genome-wide händelser, såsom genomet minskning och transkriptom omorganisation. Korrekt analysera bakterietillväxt är avgörande för att förstå tillväxt-beroende samordning av genen funktioner och cellulära komponenter. Följaktligen krävs den precisa kvantitativa utvärderingen av bakterietillväxt på ett sätt som hög genomströmning. Framväxande tekniska utvecklingen erbjuder nya experimentella verktyg som tillåter uppdateringar av de metoder som används för att studera bakterietillväxt. Protokollet införs här sysselsätter en microplate reader med en mycket optimerad experimentell förfarande för reproducerbara och exakt utvärdering av bakterietillväxt. Detta protokoll användes för att utvärdera tillväxten av flera tidigare beskrivits Escherichia coli stammar. De viktigaste stegen i protokollet är följande: utarbetandet av ett stort antal cell bestånd i små flaskor för upprepade tester med reproducerbara resultat, användning av 96 brunnar för hög genomströmning tillväxt utvärdering och manuell beräkning av två större parametrar (dvs, maximal tillväxt takt och befolkningstätheten) som representerar tillväxtdynamiken. I jämförelse med traditionella kolonibildande enhet (CFU) analysen, som räknar de celler som odlas i glasrör med tiden på agarplattor, denna metod är mer effektiv och ger mer detaljerad temporal records tillväxt förändringar, men har en strängare detektionsgränsen på låg befolkningstäthet. Sammanfattningsvis är den beskrivna metoden fördelaktiga för exakt och reproducerbar hög genomströmning analys av bakterietillväxt, som kan användas till begreppsmässig slutsatser eller göra teoretiska observationer.
Introduction
Mikrobiologiska undersökningar börjar ofta med kulturen av bakterieceller och bedömningen av bakterietillväxt kurvorna, som utgör ett grundläggande fenomen av bakteriell fysiologi1,2,3. Grundläggande kultur principer är allmänt tillgängliga i publicerad forskningslitteratur och läroböcker eftersom bakterieodling är en grundläggande metodik. På bänk nivå, betydande uppmärksamhet har traditionellt fokuserats på optimera tillväxt medier och odlingsskålar villkor, men kontrollera tillväxttakten, som sannolikt skulle ge ännu större förståelse för mikrobiell fysiologi, har inte varit flitigt studerade4. För exponentiellt växande bakterier, är en viktig parameter i den cellulära staten tillväxttakten, som har rapporterats vara samordnad med den genomet och transkriptom proteomet5,6,7,8 . Kvantitativ utvärdering av bakterietillväxt är alltså avgörande för att förstå mikrobiell fysiologi.
Utvärdera bakterietillväxt, de experimentella metoder som används för att beräkna biomassa är väl etablerad9,10 och baseras på påvisande av biokemiska, fysiska eller biologiska parametrar, till exempel optiska grumlighet. Dessutom är de analysmetoder som används för att fånga de dynamiska egenskaperna hos tillväxt förändringar vanligen baserade på etablerade ickelinjära modeller11,12,13, exempelvis logistiska ekvationer. Tillväxtdynamik förvärvas generellt genom tidsstyrd provtagning av celltillväxt i kultur av antingen mäta optiska grumlighet eller utför kolonibildande enhet (CFU) analyser. Begränsning av dessa metoder för odling och upptäckt är att datapunkterna inte är en sann bild av populationsdynamik eftersom mätning intervallen är ofta i timmar och eftersom villkoret kultur (t.ex.förändringar i temperatur och Luftning) är störd vid tidpunkten för provtagning. Kultur och analystekniker måste uppdateras med senaste tekniska utvecklingen och förståelse. Senaste framstegen inom mikroplattan läsare tillåter realtid observationen av bakterietillväxt och avsevärt minska arbetskostnader. Använda dessa avancerade enheter, har de senaste undersökningarna på bakterietillväxt rapporterat analysmetoder för hög genomströmning mätningar14,15.
Syftet med detta protokoll är att utvärdera den exakta tillväxtdynamiken i en hög genomströmning sätt, vilket kommer att vara värdefullt för kvantitativa studier som slutligen ta itu med frågorna om hur tillväxttakten bestäms och vilka faktorer påverkar tillväxttakten. Protokollet behandlar alla faktorer som bör beaktas för repeterbara och noggrann kvantitering av bakterietillväxt. Den experimentella metoden och analysen beskrivs i detalj i huvudtexten. Denna metod tillåter exakta och reproducerbara analysen av bakterietillväxt på en hög genomströmning sätt. Mikrobiologer kan använda det här protokollet för att härleda ytterligare kvantitativa resultat från deras experimentella bevis. Detta protokoll kan också användas för studier i systembiologi som försöker dra konceptuella slutsatser eller uppnå en teoretisk översikt av tillväxt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förbereda odlingsmedium
Obs: den kemiska sammansättningen av minimal medium M63 är följande: 62 mM K 2 HPO 4, 39 mM KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4, 1,8 µM FeSO 4, 15 µM tiamin-HCl, 0,2 mM MgSO 4 och 22 mM glukos. M63 görs genom att blanda tre lager lösningar: fem X lösning, 20% glukos och MgSO 4 tiamin lösning. Lagra alla lösningar vid 4 ° C.
- Beredning av fem X
- att förbereda FeSO 4 lösning, Använd en elektrisk pipetten, och disponibel serologiska pipett för att lägga ddH 2 O till en 50 mL centrifugrör. Använd en P-200 att lägga till 0,06 mL HCl att erhålla 0,01 M HCl. Tillsätt 36 mg FeSO 4-7 H 2 O och blanda väl.
- Mäter 160 mL ddH 2 O i en mätcylinder och lägga till en 500 mL-glasbägare. Lägg till följande i denna ordning: 10,72 g K 2 HPO 4, 5.24 g KH 2 PO 4, 2,0 g (NH 4) 2 SO 4 och 0,5 mL FeSO 4 lösning (beredd enligt steg 1.1.1).
- Med en precision pH-mätare, justera pH till 7,0 genom att lägga till 2 M KOH. Häll lösningen i en mätcylinder och tillsätt ddH 2 O till en total volym på 200 mL. Sterilisera om lösningen med en 250 mL-filtrering enhet (PVDF, 0,22 µM).
- Förbereder 20% glukoslösning
- mäta 200 mL ddH 2 O i en mätcylinder och häll det i en 500 mL-bägare. Lägga till 50 g glukos medan blandning med en magnetomrörare. Späd lösningen i en mätcylinder till en total volym på 250 mL. Sterilisera lösningen som beskrivs i steg 1.1.3.
- Beredning av MgSO 4 tiamin
- lägga 150 mL ddH 2 O till en 500 mL-glasbägare. Medan blandning med en magnetisk omrörare, lägga till 1,0 g tiamin-HCl och 10 g MgSO 4-7 H 2 O. Dilute lösningen i en mätcylinder till en total volym på 200 mL. Sterilisera lösningen som beskrivs i steg 1.1.3.
- Förbereder minimal medium M63
- Placera fem X lösningen, 20% glukoslösning, MgSO 4 tiamin lösningen, en elektronisk pipett, P-200 pipett och 200-µL pipettspetsar på en ren bänk.
- Mäta 155.8 mL ddH 2 O i en mätcylinder och häll det i en 500 mL-glasbägare.
- Med hjälp av elektroniska pipetten och disponibel serologiska pipett, tillsätt 40 mL fem X lösning och 4 mL 20% glukoslösning till uppmätta ddH 2 O. Lägg sedan till 0,2 mL MgSO 4 tiamin lösning med P-200. Sterilisera lösningen som beskrivs i steg 1.1.3.
2. Förbereda Glycerol beståndet
- Cell kultur
Obs: bakteriestammar (t.ex., W3110 och dess reducerade genomen) är tillgängliga från stam bank organisationer. Stammarna erhålls vanligen i form av kolonier på agarplattor.- Placera fem steriliserad glasrör med silikon gummiproppar, en elektronisk pipett, P-1,000, 1000-µL pipettspetsar, P-200, 200-µL pipettspetsar och målet stammar (kolonier på tallrikar) på en ren bänk.
- Utsätta mynningen av glasröret till en bunsenbrännare innan du öppnar silikon gummiproppen. Exponera silikon gummiproppen till lågan efter tuben öppnas, och sedan lätt placera locket tillbaka på glasröret.
- Använda den elektroniska pipetten, och disponibel serologiska pipetten för att tillsätt 5 mL M63 till en av de glasrör och 4,5 mL M63 till de övriga fyra rören.
- Använd P-200 tipset att plocka en koloni och Inokulera det i glasrör innehållande 5 mL M63.
- Vortex röret att göra en suspension. Sedan späd lösningen 10-faldigt genom att överföra 0,5 mL av denna lösning till en av de fyra rören som innehåller 4,5 mL M63.
- Upprepar du processen som beskrivs i steg 2.1.5 för de återstående rören. En utspädning serie med fem olika koncentrationer (utspädningar av 1, 10, 100, 1000 och 10 000) är nu klar.
- Sterilisera munnen av glasrör och silikon gummiproppar som beskrivs i steg 2.1.2. Cap rören med proppar. Undvik kontaminering genom att inte skrynkla silikon gummiproppar.
- Placera fem rören i en pre värmde skakningar inkubator vid 37 ° C och skaka på 200 rpm. Inkubera kulturen över natten eller i 10 till 30 h.
- Urval av kulturen för glycerol beståndet
- Placera pre värmde rumstemperatur M63 medium, P-1,000, 1000-µL pipettspetsar och en disponibel kyvetten på en ren bänk.
- Lägga till 1000 µL M63 till en disponibel kyvetten med en p1, 000. Placera den disponibla kyvetten i en spektrofotometer, starta programmet vid en fast våglängd på 600 nm, och mäta tomrummet.
- Flytta fem glas rören från skakningar inkubatorn till ren bänken.
- Kasta M63 från den disponibel kyvetten och lägga 1000 µL kultur till den samma disponibla kyvetten med en p1, 000. Mät den optiska grumligheten av cellkulturen (OD 600) som beskrivs i steg 2.2.2.
Obs: För att undvika kontaminering och uppnå en exakt mätning, exponera glasrör och proppar till lågan som beskrivs och vortex kulturen före provtagningen. För att säkerställa tillförlitliga resultat, upprepade mätningar rekommenderas, särskilt när cell densiteten är låg. - Av de fem cellen kulturer, välja en som är i tidiga exponentiella tillväxtfasen (OD 600 = 0,01 - 0,05) för glycerol beståndet.
Obs: Om flera kulturer har densiteter inom intervallet optimal, en närmast 0,05 vanligen väljs.
- Göra glycerol bestånden för upprepade tester.
Obs: Detta beskrivs för att förbereda tio lager. Större eller mindre belopp kan göras enligt de experimentella krav.- Placera den steriliserade 60% glycerol lösningen, tio steriliseras 1,5 mL mikrorör, P-1,000 och P-200, 1 000 - och 200-µL pipettspetsar och ett mikrorör stå på en ren bänk.
- Lägga till 250 µL steriliserad 60% glycerol lösning och 750 µL av den markerade cellkulturen till 1,5 mL mikrorör och mix av pipettering.
Obs: Lager volymen är variabel, men alltid bibehålla förhållandet 1:3 av 60% glycerol till cellkultur. Detta resulterar i en slutlig koncentration på 15% glycerol. - Placera de återstående nio mikrorör i mikrorör stativet och Dispensera 100 µL av den blandning som bereddes i steg 2.3.2 till varje rör. Nu finns det tio identiska glycerol bestånd för framtida användning.
- Lagra bestånden i en frys vid -80 ° C.
3. Förvärva de tillväxtkurvor
- ställa in mikroplattan läsaren.
Obs: Villkoren visas i citattecken Visa specifika formuleringen används på plattan läsaren används här (se tabell av material).- Öppna programvaran. Öppna " protokoll " i " Task Manager " och välj " skapa nya ". Välja " standardprotokoll ".
- Öppna " förfarande ", och justera inställningarna. Öppna " inställd temperatur ", och välj " inkubator på ". Ange " temperatur " till 37 ° C och " lutning " till 0 ° C. Kontrollera " Värm " innan du fortsätter med nästa steg. Öppna " starta Kinetic ", ange " körning " för 24:00:00 eller 48:00:00, och " intervall " för 00:30:00 eller 01:00:00.
Obs: Det tar ca 1 min att läsa en hel 96 väl tallrik. - Öppna " skaka " och ange " skaka läge " som " linjär ". Kontrollera " CoInstitutionen Shake " och ange " frekvens " på 567 cpm. Öppna " Läs ", kontrollera " absorbans ", " slutpunkt/Kinetic ", och " Monochromators. " ställa " våglängd " till 600.
- Klicka " validera " bekräfta att förfarandet är korrekt. Klicka " Spara " att spara det som ett nytt program för framtida användning.
- Realtid inspelning av tillväxt
- dra plattan med 96 brunnar piktogram (8 × 12 tabell) för att ange placeringen av de inokulerade kultur proverna på plattan med 96 brunnar. Skriva ut tabellen och använda den som referens för experimentet.
Obs: Brunnarna ligger på kanterna av mikroplattan bör endast innehålla tomma medium på grund av avdunstning. - Plats en steriliserad 96 brunnar platt botten mikroplattan med lock, P-1000, 1000-µL pipettspetsar, P-200, 200-µL pipettspetsar, flera 1,5 mL mikrorör, en 8-flerkanalig pipett, en steriliserad reagens reservoir, rumstemperatur M63 och glycerol bestånd (bereddes i steg 2,3) på en ren bänk.
- Lägga till cirka 25 mL M63 reservoaren reagens. Använda denna reservoar lager för alla följande steg.
- Lägga till 900 µL M63 till mikrorör förberedelse för seriella utspädningar.
- Tina glycerol beståndet vid rumstemperatur. Tillsätt 900 µL M63 tinade glycerol lager och vortex. Detta resulterar i en 10-faldig utspädning av ursprungliga glycerol beståndet.
- Överföra 100 µL 10-faldig utspädning till en annan mikrorör som innehåller 900 µL av M63 och vortex. Detta resulterar i en 100-faldig utspädning.
- Upprepa steg 3.2.6 tills önskat antal utspädningar uppnås.
- Fylla brunnarna vid kanten av mikroplattan med 200 µL M63 använder en 8-kanals pipett (P-200).
Obs: Dessa brunnar kan användas som tomrummet. - Belastning 200 µL av varje utspätt prov beredd i steg 3.2.4 - 3.2.7 till mikroplattan brunnarna enligt referenstabellen (steg 3.2.1). Vortex de utspädda prover före lastning och belastning samma prov i flera brunnar på varierande platser på tallriken.
- Placera mikroplattan 96 brunnar på plattan läsaren.
- Öppna " Läs nu " i " Task Manager " och välja programmet (avsnitt 3.1). Klicka på " OK " att starta mätning. Spara inspelningen som en ny experimentell fil för dataanalys (avsnitt 4).
- dra plattan med 96 brunnar piktogram (8 × 12 tabell) för att ange placeringen av de inokulerade kultur proverna på plattan med 96 brunnar. Skriva ut tabellen och använda den som referens för experimentet.
4. Dataanalys
- exportera resultaten av realtid tillväxttakt-data (avsnitt 3.2) till ett USB-minne sticka som en textfil.
Obs: En 96-väl formaterad resultaten (kurvor) visas på plattan läsaren i realtid. Varje timme posterna (OD-värdena) kan exporteras som en tabell; raderna och kolumnerna representerar väl siffrorna (t.ex., A1, B1) och mättiden (t.ex., 00:00:59) respektive. - Öppna textfilen med ett kalkylprogram.
- Kopiera de Timvisa OD 600 läsningar av 96 brunnar mikroplattan till ett nytt kalkylblad för ytterligare analys.
- Subtrahera bakgrunden läser på tid noll från den Timvisa läser av varje prov väl.
Obs: För bekvämlighet, medelvärdet av tomrummet brunnar innehållande M63 (steg 3.2.8) kan användas som bakgrundsvärde. - Beräkna medelvärdet av fem på varandra följande OD 600 läser att uppskatta maximal befolkningtätheten.
Obs: Största medelvärdet av fem på varandra följande OD 600 läser definieras som den maximala OD 600 av motsvarande tillväxtkurvan. - Beräkna tillväxttakten, µ (h -1), genom tillämpning av följande ekvation för alla par av på varandra följande värden på OD 600:
Observera: I denna ekvation, representerar C jag och C i + 1 600 OD-värdena av två på varandra följande tidpunkter (t jag och t i + 1, respektive). LN indikerar naturliga logaritmen. - Beräkna förändringar i tillväxttakten över tid baserat på timlön OD 600 läser enligt steg 4,6. Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för fem på varandra följande tillväxttakten att uppskatta den maximala ökningstakten.
Obs: Den största genomsnittliga med minsta standardavvikelsen definieras som den maximala ökningstakten i motsvarande tillväxtkurvan.
5. Bekräftar den globala Bias av 96 brunnar läser (valfritt)
Obs: båda plattan läsare och den förbrukningsbara plattan med 96 brunnar kan orsaka partisk mätningar. För att uppnå mycket exakta och reproducerbara kvantitativa resultat, bekräftar de globala bias av plattan med 96 brunnar rekommenderas.
- Förbereda plattan med 96 brunnar och plattan läsaren för bias test som beskrivs i avsnitt 3.2.2.
- Lägga till 20 mL M63 till en steriliserad 50 mL centrifugrör. Lägg till glycerol beståndet i samma centrifugrör och vortex. Överföra den svävande lösningen till en steriliserad reagens reservoir.
- Använda en 8-kanals pipetten för att överföra 200 µL av suspenderade lösningen till plattan med 96 brunnar.
- Placera plattan med 96 brunnar på plattan läsaren och starta mätningen.
- Posten timlön OD 600 läser och analysera som beskrivs i avsnitt 4. Jämför den Beräknad maximal tillväxt takt och befolkningstätheten i varje brunn för att bestämma platsindikerande bias av 96 brunnar läser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrivna metoden gör det möjligt att fånga dynamiska bakterietillväxt i en kontinuerlig och hög genomströmning sätt genom att utnyttja en 96 brunnar format läsare som tar flera optiska densitet mätningar vid olika tidsintervall (från minuter till timmar till dagar). Tillväxtkurvorna av ett sortiment av E. coli -stammar som uttrycker olika genomen kan förvärvas just i ett enda experiment (figur 1A). I jämförelse med den beskrivna metoden, den traditionella metoden (CFU analysen) generellt kräver längre provtagning tidsintervall (figur 1B) och är arbetskrävande om flera kultur krävs. Dessutom, kräver varje kultur Provtagningstiden för CFU analysen användning av en liten volym av cell-kultur som inte kan användas för upprepade mätningar. Dessutom kan begränsat antal tidpunkter för upptäckt missa de provtagningspunkter som behövs för en korrekt beräkning av tillväxttakten och maximal OD600. CFU analysen har dock en lägre detektionsgräns, 103 - 104 celler/mL, vilket gör det minst två tiopotenser mer känsliga än optiska grumlighet analysen (OD600= 0,001, som har en detektionsgränsen cirka 105 -106 celler/mL). Den beskrivna metoden ger en praktisk och effektiv experimentella verktyg för system-nivå studier på tillväxtdynamik.
En viktig fördel med detta protokoll är att det tar upprepade mätningar från en gemensam glycerol-lager. Att ha flera cellkulturer på olika utspädning priser i tidiga exponentiella tillväxtfasen är mycket användbart eftersom det tillåter forskare att bestämma kulturtid på någon tidsskala och undviker att ha mättat kulturer beror på oförutsägbara händelser. Upprepad odling och mätningar av de gemensamma bestånd, som var beredda från en av de fem kulturer som initierats med hjälp av olika utspädning priser som beskrivs i protokollet avsnitt 2.2 (figur 2A), presenteras mycket liknande resultat av tillväxten Dynamics analys. Flera tillväxtkurvor upprepade och oberoende mätningar (N = 6) överlappade varandra väl (figur 2Bövre panelen), med lite variansen (figur 2Bnedre panelen), särskilt under den exponentiella fasen ( Figur 2B, skuggade området). Dessa resultat tyder på att den beskrivna metoden levererar mycket reproducerbara resultat.
Det rekommenderas starkt att uppskatta den globala bias av 96-väl läser. I denna metod, den globala bias uppskattas genom att övervaka tillväxten av den vildtyp E. coli stam W3110 som beskrivs i avsnitt 5-protokollet. Exempelvis tillväxten beräknas från de tillväxtkurvor som visade betydande variation bland 96 brunnarna (figur 3A), som representerar globala fluktuationer härrör från både datamanipulation och enhets fel. Dessa fel kan maskeras genom att läsa samma prov i flera brunnar på varierande platser på plattan. Däremot den maximal OD600 visade en tydlig läge-beroende bias för resultat som gradvisa förändringar observerades längs den vertikala riktningen, d.v.s. maximal OD600 gradvis ökade från brunnarna i kolumn 2 med kolumn 11 på plattan med 96 brunnar (figur 3B). För att undvika partisk resultat, rekommenderas samma prov som ska läsas in brunnarna ligger på båda sidor av plattan med 96 brunnar för upprepade mätningar. Den platsindikerande bias i maximal OD600 värden antas resultera från variationen i avdunstningen, vilka bestäms av både värme och tätning effektivitetsvinster. Jämfört med brunnarna i mitten 96 brunnar mikroplattan, tenderade brunnarna ligger vid kanterna att Visa relativt högre värden, återspeglar de varierade avdunstningen som följd av försegla effekten av mikroplattan. Dessutom, eftersom andra 96 brunnar mikroplattor underkastas samma bias provet visade liknande riktade förändringar utifrån där brunnen var belägen på plattan, kan omfattningen av bias bero på plattan läsaren. Det är således viktigt att utvärdera den globala bias av 96 brunnar läser i studier som avgör maximal befolkningstäthet. Kommersiellt tillgängliga plattan läsare har alla sina specifika globala bias orsakad av värme och skaka effektivitetsvinster, och de 96 brunnar mikroplattor skiljer sig till stor del genom tätning effektivitet.
Denna metod är utformad för systematisk analys av bakterietillväxt, och det kan användas för att analysera två viktiga parametrar, dvs, tillväxt takt och cell densiteten, som vanligen tillämpas i en mängd olika områden som systembiologi, evolution, och ekologi16,17. Manuell beräkning använder kalkylblad införs för att Visa bearbetning av raw läser att producera utvärderade parametrarna för tillväxt takt och cell densiteten. Timpriser som tillväxt beräknas först från de raw-läsningar av tillväxtkurvan (figur 4A) enligt protokollet avsnitt 4.6 som en uppsättning data av sekventiella förändringar i tillväxttakten (figur 4B). Medel och standardavvikelser av varje fem på varandra följande tillväxttakterna förvärvas sekventiellt (figur 4 c-D), och den största genomsnittliga tillväxttakten med minsta standardavvikelsen definieras som den maximala ökningstakten i tillväxten kurva (figur 4 c-D, markerat). Maximal cell densiteten (OD600) analyseras på samma sätt (figur 4E-F). Beräknad tillväxt takt och cell densiteten utsätts därefter för ytterligare analys. Observera att beskrivs beräkningarna automatiskt kan utföras med computational plattformar (programmeringsspråk), t.ex., R och Python.
Figur 1 tillväxtkurvor förvärvade med olika metoder. (A) flera förvärv av tillväxtkurvor. Tillväxtkurvor för fyra olika E. coli -stammar som uttrycker olika genomen erhölls på ett sätt som hög genomströmning. E. coli celler odlades i minimal medium M63 och förändringar i OD600 läsningar spelades av en microplate reader 1-h mellanrum. Stammar från vänster till höger är den vilda typen E. coli W3110 (siffran 0) och dess reducerade genomen nummer 1, 10 och 18 beskrivs (tidigare5), respektive. (B) tillväxtkurva som erhålls med hjälp av CFU analysen. Vildtyp E. coli celler (siffran 0) var odlade och var provtas vid angivna tidpunkter under flera timmar. Förändringarna som tillväxt uppskattades med CFU-analys. Öppna cirklar indikerar registreringen eller provtagningspunkter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Reproducerbara upprepade mätningar. (A) över natten kulturer av varierad spädnings. E. coli -celler var inokuleras i rör till flera utspädning, som varierade från 1-till 10,000-fold, som anges. Cellerna odlades vid 37 ° C under skakning på 200 rpm för cirka 12 h. OD slutvärdena600 av de fem cellkulturerna (från vänster till höger) var 1,51, 0,74, 0,05, 0,008 0,001, respektive. Kulturen med OD600 0,05 användes för gemensamma glycerol beståndet. (B) mycket reproducerbara mätningar. Sex oberoende tillväxtkurvor (topp, grå linjer) av samma E. coli stam var förvärvat och beräknas från sex positioner på mikroplattan och två injektionsflaskor med gemensamma glycerol beståndet. Den svarta linjen representerar medelvärdet av de sex tillväxtkurvorna. I variationskoefficienter (CV) av sex upprepade mätningar var beräknade (nederst) och stadig låga punkter är skuggade i rosa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 globala Bias av formatet 96 brunnar. (A) värme karta över tillväxttal. E. coli cell beståndet var upphängd i minimal medium M63 och laddade lika i 96 brunnarna av mikroplattan (representeras som ett 12 × 8 bord). Förändringar i OD600 erhölls med mikroplattan läsaren, som beskrivs i avsnitt 5 i protokollet. Graderingen från vitt till rött indikerar tillväxten från 0,7 till 0.9 h-1. (B) värmekarta av maximal OD600. Graderingen från vitt till rött anger maximal OD600 värden från 0,9 till 1,2. Beräkningarna för den tillväxttakt och maximal OD600 är som beskrivs i figur 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Analys av tillväxtkurvorna i figur 4. (A) rådata av tillväxtkurvor. Den timlönerna OD600 läser ritas mot kultur tiden. Öppna cirklar indikerar provtagningstiderna. (B) temporala förändringar i tillväxttakten. Tillväxt timpriser mellan två på varandra följande OD600 läsningar beräknas enligt ekvation beskrivs i 4.6. (C) menar tillväxttakt. Medelvärdet av fem på varandra följande tillväxten beräknas ge jämn tillväxttakt. (D) standardavvikelser av genomsnittlig tillväxttakt. Standardavvikelsen för den samma fem på varandra följande tillväxten beräknas. Den maximala ökningstakten med minsta standardavvikelsen är markerade i rött. (E) menar OD600. Medelvärdet av fem på varandra följande OD600 -värdena beräknas för att avgöra den släta OD600. (F) standardavvikelser av medelvärden OD600 . Standardavvikelse av samma fem på varandra följande OD600 värden beräknas. Den maximal OD600 med minsta standardavvikelsen är markerade i rött. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i protokollet inbegripa förberedelse av en stamaktier av exponentiellt växande celler och replikering av samma proverna i flera brunnar på olika befattningar på mikroplattan. Tidigare startade mikrobiologer kulturen från en övernattning före kultur. Även denna metod kan minska fördröjning av bakterietillväxt, är det svårt att uppnå reproducerbara tillväxtkurvor. Som visas i figur 2, resulterade de oberoende mätningar med gemensamma glycerol bestånden i nästan identiska tillväxtkurvor, som ger reproducerbara och exakt resultat. I figur 3visas brunnar på olika platser ge lite olika läsningar, som betraktas som global bakgrund av mätningarna. För den kvantitativa utvärderingen av bakterietillväxt, bör denna bakgrund övervägas. Inokulering av prover till flera brunnar på varierade plattan platser för experimentell replikering rekommenderas att ta hänsyn till globala bias.
Utöver felhantering, bör ändring och felsökning härrör från experimentella enheter och leveranser övervägas. Flera avancerade mikroplattan läsare är kommersiellt tillgängliga. De visar en stor variation i egenskaper, såsom metoden för justera ljus våglängd, värme eller kyla, och sätt och frekvensen av skakningar. Baserat på vår erfarenhet, bör avdunstning behandlas i hög genomströmning studier eftersom förändringar i flytande volym kraftigt påverka OD600 läsningar. Avdunstning orsakas av metoden för uppvärmning används av mikroplattan läsarna och arkitekturen av mikroplattor. De två lägena av värme som ofta genomförs i kommersiella mikroplattan läsare är uppvärmning av varm luft och värme med en värmeplatta. Microplate läsaren används i detta protokoll används värmeplattan som uppvärmning metod för att minska avdunstning eftersom mediet i mikroplattan skulle snabbt torka upp i den blåsa varm luften. Mikroplattor bör också väljas noggrant. Olika 96 brunnar mikroplattor (med lock) orsaka olika nivåer av avdunstning. Den beskrivna metoden använder det platta formatet med djup täckta lock, vilket minskar avdunstningen.
Dessutom om studien kräver stationär fas analys av tillväxtkurvan, bör sedan det sätt och frekvensen av skakningar i microplate reader beaktas. Skakar under kultur säkerställer att växande blodkropparna är suspenderade jämnt i media. Felaktig skakningar eller låg frekvens kan orsaka cellerna att stapla runt väl kanten eller i mitten på en hög densitet, vilket resulterar i false läspaket som är antingen lägre eller högre än faktiska läsningar. Den beskrivna metoden använder linjär, dubbelriktad skakar. Medan det 8-formade skakningar läget är förmodligen tillräckligt, rekommenderar vi inte cirkulära funktionsläget av skakningar.
Den största begränsningen med denna metod är avdunstning av cellodlingsmedium. Eftersom maximal kultur volymen är liten, orsakar dvs200 µL, inkubation vid 37 ° C betydande avdunstning. Således, denna metod är olämplig för odling längre än 48 h. Dessutom, cellkulturer av låg densitet bör undvikas eftersom optisk detektion (OD600) är begränsad vid dessa tätheter. När betraktas tillsammans, är mycket långsamt växande celler/stammar eller mycket låg initial koncentration kulturer inte föredra, eftersom de kräver längre tid och är under detektionsgränsen OD600.
Denna metod ger exakt, hög genomströmning mätningar, vilket är mycket fördelaktigt för systematiska undersökningar. Som representativa resultat, denna metod gör det möjligt för att utvärdera ett sortiment av E. coli -stammar med olika genomsekvenser och/eller medium enkelt och reproducibly5. Jämfört med traditionella metoder för odling i rör och manuellt mäta prover vid olika tidpunkter, är den beskrivna metoden mindre arbete och tid intensivt. Framtida tillämpningar och utvecklingen av metoden antas för att involvera automatisering av experimentella manipulation och computational analys. Automatisk mätning och robotik tillämpning kommer att leda till en mycket effektiv och tillförlitlig metod för utvärdering av celltillväxt och utföra överlevnad tester med bakterie- och däggdjurs-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi tackar Kohei Tsuchiya för att tillhandahålla i CFU assay exempel. Detta arbete stöddes delvis ekonomiskt ett bidrag för vetenskaplig forskning (C) nr 26506003 (till BWY) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik, Japan.
Acknowledgments
Författarna har något att avslöja.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
References
- Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
- Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287 (2015).
- Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
- Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808 (2013).
- Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
- Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).
- Madrid, R. E., Felice, C. J.
- Harris, C. M., Kell, D. B.
- Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
- Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
- Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).
- Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M.
- Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).
- Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).
