הערכה כמותית של התפתחות חיידקים חיוני להבנת הפיזיולוגיה מיקרוביאלי כתופעה מערכות ברמת. פרוטוקול עבור גישה אנליטית מניפולציה ניסויית הם הציגו, המאפשר ניתוח מדויק, תפוקה גבוהה של התפתחות חיידקים, אשר הוא נושא מפתח עניין במערכות ביולוגיות.
התפתחות חיידקים הוא מושג מרכזי בהתפתחות של פיזיולוגיה מיקרוביאלי מודרניים, כמו גם בחקירה של דינמיקה סלולר ברמת מערכות. מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו על מתאמים בין התפתחות חיידקים ואירועים הגנום כולו, כגון ארגון מחדש, הפחתת ו- transcriptome, הגנום. כראוי ניתוח התפתחות חיידקים חיוני להבנת התיאום תלויי-צמיחה של ג’ין פונקציות ורכיבים הסלולר. בהתאם לכך, הערכה כמותית מדויקת של התפתחות חיידקים באופן תפוקה גבוהה נדרש. התפתחויות טכנולוגיות המתעוררים מציעים כלים חדשים ניסיוני לאפשר עדכוני שיטות לימוד התפתחות חיידקים. פרוטוקול הציג כאן מעסיקה קורא microplate עם הליך ניסיוני מאוד וממליצה על הערכה מדויקת הדירים של התפתחות חיידקים. פרוטוקול זה שימש להערכת הצמיחה של מספר זנים Escherichia coli שתואר קודם לכן. השלבים העיקריים של הפרוטוקול הם כדלקמן: הכנת כמות גדולה של מניות תא בקבוקונים קטנים לבדיקות חוזרות ונשנות עם תוצאות לשחזור, השימוש של 96-ובכן צלחות להערכת גידול בתפוקה גבוהה בחישוב ידני של מייג’ור שני פרמטרים (קרי, צפיפות האוכלוסין וקצב הצמיחה המקסימלי) המייצג את הדינמיקה צמיחה. בהשוואה המסורתית המושבה יוצרי יחידה (CFU) וזמינותו, מה. שמסביר את התאים מתורבתים צינורות זכוכית לאורך זמן על פלטות אגר, השיטה הנוכחית יעיל יותר, מספק מפורט יותר רשומות הטמפורלי של צמיחה שינויים, אבל יש על ההחמרה מגבלת זיהוי-צפיפות אוכלוסין נמוכה. לסיכום, השיטה המתוארת היא יתרון לניתוח לשחזור ומדויק תפוקה גבוהה של התפתחות חיידקים, אשר יכול לשמש להסיק מסקנות רעיונית או כדי לבצע תצפיות תיאורטי.
מחקרים מיקרוביולוגית בדרך כלל מתחילים עם התרבות של תאים חיידקיים, את ההערכה של עקומות התפתחות חיידקים, אשר מייצגים תופעה הבסיסית של פיזיולוגיה בקטריאליות1,2,3. עקרונות תרבות בסיסיים זמינים באופן נרחב ספרות המחקר שפורסם ואת ספרי הלימוד כי התרבות חיידקי היא מתודולוגיה היסוד. ברמת ספסל, תשומת לב רבה התמקדה באופן מסורתי על אופטימיזציה של צמיחה מדיה ו culturing תנאים, אך שליטה הצמיחה, אשר סביר לספק הבנה אפילו טובה יותר של חיידקים פיזיולוגיה, לא היה למדה בהרחבה4. עבור שמתקדמות חיידקים, פרמטר מפתח של המדינה הסלולר הוא שיעור צמיחה, אשר דווחה בתיאום עם הגנום, transcriptome, פרוטאום5,6,7,8 . לפיכך, הערכה כמותית של התפתחות חיידקים חיוני להבנת הפיזיולוגיה מיקרוביאלי.
כדי להעריך את התפתחות חיידקים, השיטות ניסיוני המשמש להערכת ביומסה וותיקה9,10 הינם מבוססים על הגילוי של פרמטרים ביוכימיים, פיזי או ביולוגיים, כגון עכירות אופטי. בנוסף, שיטות אנליטיות להשתמש כדי ללכוד את מאפייני צמיחה שינויים דינמיים בדרך כלל מבוססים על ויצר מודלים ליניאריים11,12,13, לדוגמה, לוגיסטיים משוואות. דינמיקה הגדילה נרכשים בדרך כלל על ידי דגימה מתוזמן של צמיחת תאים בתרבות באמצעות מדידת עכירות אופטי או ביצוע מבחני יחידה (CFU) המושבה יוצרי. המגבלה של שיטות אלה culturing וזיהוי היא נקודות הנתונים אינם השתקפות אמיתית של המלאכותיות כי מרווחי המדידה הם לעיתים קרובות בשעות וכי התנאי תרבות (למשל, שינויים בטמפרטורה, לערבב) מופר בזמנו של הדגימה. תרבות טכניקות ניתוח יש לעדכן באמצעות התפתחויות הטכנולוגיה והבנה. התפתחויות אחרונות microplate הקוראים לאפשר התצפית בזמן אמת של התפתחות חיידקים, להקטין באופן משמעותי את עלויות העבודה. באמצעות אלה מכשירים מתקדמים, המחקרים העדכניים ביותר על התפתחות חיידקים דיווחו על שיטות אנליטיות על תפוקה גבוהה מידות14,15.
המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך את הדינמיקה צמיחה מדויק באופן תפוקה גבוהה, אשר יהיה יקר עבור מחקרים כמותיים המטפלות בסופו של דבר את השאלות כיצד נקבע קצב הגידול, אילו גורמים משפיעים על הצמיחה. הפרוטוקול מענה כל הגורמים אשר צריכים להילקח בחשבון עבור כימות הדיר ומדויק של התפתחות חיידקים. השיטה הניסיונית וניתוח מתוארים בפירוט רב הטקסט העיקרי. שיטה זו מאפשרת ניתוח לשחזור ומדויק של התפתחות חיידקים באופן תפוקה גבוהה. מיקרוביולוגים ניתן להשתמש בפרוטוקול זה להפיק תוצאות כמותיות נוספות מהראיות ניסיוני שלהם. פרוטוקול זה יכול לשמש גם ללימודי במערכות ביולוגיות שמנסות להסיק מסקנות רעיונית או להשיג סקירה תיאורטית של צמיחה.
שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללות הכנת מלאי משותף של שמתקדמות תאים, השכפול של הדגימות באותו בבארות מרובים-עמדות שונות על microplate. בעבר, מיקרוביולוגים החלה התרבות מתרבות מראש בין לילה. בעוד ששיטה זו עשויה להפחית את זמן ההשהיה של התפתחות חיידקים, קשה להשיג. את עקומות גדילה לשחזור. כפי שמוצג <strong cl…
The authors have nothing to disclose.
המחברים אין לחשוף.
K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
(NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
glucose | Wako | 049-31165 | |
HCl | Wako | 080-01066 | |
Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
KOH | Wako | 168-21815 | |
Glycerol | Wako | 075-00611 | |
Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
Pipette Tips, 1000 µL | WATSON | 110-8040 | |
Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |