Etapas de preparação para medição de reatividade no Mouse arteríolas retina Ex Vivo

Summary

Muitas doenças oculares visão em risco estão associadas com microvessels da retina disfuncional. Portanto, a medição das respostas arteríola retinal é importante para investigar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes. Este artigo descreve um protocolo detalhado para isolamento de rato arteríola retinal e preparação para avaliar os efeitos de substâncias vasoativas no diâmetro vascular.

Abstract

Insuficiência vascular e alterações na perfusão retiniana normal estão entre os fatores principais para a patogênese de várias doenças oculares visão em risco, tais como retinopatia diabética, retinopatia hipertensiva e, possivelmente, glaucoma. Portanto, preparações microvasculares da retina são ferramentas cruciais para estudos fisiológicos e farmacológicos delinear os mecanismos fisiopatológicos subjacentes e a concepção terapias para as doenças. Apesar da ampla utilização de modelos de rato em pesquisa oftálmica, estudos sobre a reatividade vascular da retina são escassos nesta espécie. Das principais razões para esta discrepância é os desafiante procedimentos de isolamento devido ao tamanho pequeno destes vasos sanguíneos da retina, que é ~ ≤ 30 µm de diâmetro luminal. Para contornar o problema de isolamento direto destes microvessels da retina para estudos funcionais, estabelecemos uma técnica de isolamento e preparação que permite ex vivo estudos de vasoactivity da retina do rato sob condições fisiológicas perto . Embora as preparações experimentais presentes irão se referir especificamente as arteríolas retina do rato, esta metodologia prontamente pode ser empregada para microvessels de ratos.

Introduction

Distúrbios na perfusão da retina têm sido implicados na patogênese de várias doenças oculares, como retinopatia diabética, retinopatia hipertensiva e glaucoma^1,2,3. Assim, estudos que visam medir a reatividade vascular na retina são importantes para compreender a fisiopatologia dessas doenças, e desenvolver novo tratamento se aproxima.

Devido à possibilidade de manipulação genética no genoma murino, o mouse tornou-se um modelo animal utilizado para estudos do sistema cardiovascular⁴. No entanto, por causa do pequeno tamanho dos vasos sanguíneos da retina (≤ 30 µm), medição de reatividade vascular na retina do rato é um desafio. Por exemplo, stereomicroscopic técnicas para a medição na vivo são limitadas em sua resolução óptica e, portanto, só permitem exatamente detectar alterações no fluxo de diâmetro ou sangue no sangue pequeno de menos de 30 µm de diâmetro ≤ quando equipado com dispositivos adicionais de sofisticados, tais como um microscópio confocal usando corantes fluorescentes ou a óptica adaptativa digitalização luz oftalmoscópio^5,6. Além disso, a interpretação das medições na vivo vista identificar locais sinalização mecanismos nos vasos da retina podem ser confundidos por anestésicos, altera na pressão arterial sistêmica e a influência dos vasos sanguíneos de retrobulbar.

Portanto, nós desenvolvemos um método para medir respostas de rato dos vasos sanguíneos da retina com alta resolução óptica ex vivo. A técnica apresentada neste documento permite visualização das arteríolas retina através de transmitidas microscopia de luz. Esse método, que também pode ser usado em ratos, fornece acesso às vantagens do gene segmentação tecnologia na investigação vascular ocular.

Protocol

Os procedimentos experimentais deste estudo foram aprovados pelo Animal conta Comissão de Renânia-Palatinado, Alemanha. Cuidados com animais em conformidade com as orientações institucionais e a associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) instrução para o uso de animais em oftalmologia e visão pesquisa. Animais foram tratados de acordo com a directiva da União Europeia 2010/63/UE para experiências em animais. Masculinos camundongos C57BL/6J (The Jackson Laboratory, Porto da barra, ME, EUA), com 3-4 meses de idade foram utilizados para os experimentos. Os animais estavam alojados em condições normais (temperatura de 23 ± 2 ° C, umidade gama 55 ± 10% e 12 h ciclos de claro/escuro) e tinham acesso ao mouse padrão chow e água ad libitum.

1. isolamento da Retina do rato

1. Coloque os instrumentos de dissecção na mesa de preparação e verificar se todos os instrumentos são completos para permitir uma rápida preparação.
2. Sacrifica o mouse por inalação de CO₂ .
3. Decapitar o mouse com uma tesoura de aço, corte sagitally o crânio em duas metades, usando o mesmo par de tesouras e retire a pele e o cérebro usando tesouras de olho (Figura 1).
4. Corte o osso do crânio para deixar somente o osso orbital usando tesouras de olho.
5. Transferi a órbita em um prato de dissecação com gelada tampão Krebs-Henseleit.
6. Mantenha o prato de dissecação no gelo ou altere o buffer de cada 10 min.
7. Corte o osso orbital usando tesouras de olho e remova cuidadosamente o globo de olho, juntamente com o tecido orbital usando pinças de precisão 4 tipo e estudante Vannas para primavera (Figura 2).
8. Remova cuidadosamente a glândula Harderian, tecido conjuntivo e os músculos extraoculares usando pinças de precisão 5 tipo e Vannas para Capsulotomia, tomando cuidado para não danificar o principal ramo da artéria oftálmica.
9. Ligate orbitais ramos da artéria oftálmica e, eventualmente, a extremidade proximal do principal ramo da artéria oftálmica usando suturas de Nylon 10-0 (Figura 3).
10. Transferi o globo de olho em uma placa de Petri contendo etanol a 70% para 10 s usando tipo 4 pinças de precisão. Coloque o prato de dissecação do globo do olho e substituir o buffer com solução de Krebs fresca. A córnea aparecerá esbranquiçada após exposição ao etanol.
11. Perfurar a córnea periférica com uma agulha de 30 calibre e dissecar a córnea usando Vannas para Capsulotomia. Cortar o tecido da íris suavemente, coloque uma ponta afiada das Vannas para Capsulotomia entre a coroide e retina e cortou a coroide e a esclera. Deixe algum tecido scleral em torno do nervo óptico (Figura 4).

2. montagem da Retina na câmara de perfusão

Nota: A câmara de perfusão utilizada para experimentos de arteríola retinal é feito em casa. Consiste em um reservatório transparente com um tubo dentro e vazão (Figura 5). Uma extremidade de um tubo de silicone está colada ao fundo da câmara com adesivo de histoacryl e a outra extremidade anexado a uma torneira de três vias. Conecte uma seringa com solução tampão de Krebs fresco para a torneira de três vias e preencher o tubo com buffer.

1. Leve uma micropipeta de vidro com um porta-agulha e empurre-a para a extremidade do tubo na parte inferior da câmara de perfusão. Então quebre a ponta da micropipeta com tesouras tipo 4 para obter uma gorjeta de 100 µm de diâmetro.
2. Concentre-se na ponta da micropipeta a e eliminá-la através da seringa conectada ao tubo. Cuide-se que o capilar não é obstruído por detritos. Em caso de oclusão, removê-lo, lave o tubo e inserir mais uma micropipeta.
3. Encha a câmara de perfusão com frio tampão Krebs e colocar a câmara sob um microscópio estéreo.
4. Coloque uma plataforma de plástico transparente para a câmara de perfusão. Esta plataforma tem um recuo de 1,8 mm de largura para o nervo óptico e artéria oftálmica e é colocada em dois fios de aço de diâmetro de 1,6 mm. Em seguida, coloque um anel de aço inoxidável de diâmetro 2,8 mm e 4,0 mm diâmetro externo para a plataforma.
5. Transferi a retina com o nervo óptico e artéria oftálmica anexada da câmara de dissecação na câmara de perfusão com extremo cuidado, usando uma colher. Este passo é importante para evitar a potencial alongamento dos tecidos, como pode ser prejudicial para o experimento.
6. Cortar a parte suturada da extremidade proximal da artéria oftálmica, coloque duas alças pré-formadas de sutura de nylon 10-0 para a micropipeta e Canule a artéria oftálmica com a micropipeta. Amarrar a artéria para a micropipeta (Figura 6) e coloque a retina para a plataforma transparente usando pinças-multa-ponto.
7. Delicadamente te abrir a capsula de lente anterior com duas pinças de ponta fina, retire a lente e cortar a capsula de lente inteira usando micro-tesouras.
8. Posteriormente, fazer quatro incisões radiais na retina metade a distância entre a pars plana para o nervo óptico e coloque um anel de aço inoxidável na retina para corrigi-lo para o fundo. A retina está agora pronta para o experimento (Figura 7).

3. preparação de arteríolas da retina para o experimento

1. Coloque a câmara de perfusão sob um microscópio de luz. O objetivo é uma lente de objetiva de imersão de água X 100.
2. Conectar as duas tubulações para em - e out - flow para uma bomba pericíclica e circulam na câmara com tampão Krebs oxigenado com 95% O₂ e carbonatadas com 5% CO₂ a 37 ° C. Use uma taxa de fluxo entre 100 e 120 mL/min.
3. Conecte o tubo de silicone, que é conectado com a micropipeta, um reservatório do silicone mangueira através de uma torneira de três vias. Em seguida, encher o reservatório com tampão Krebs para uma altura correspondente a 50 mm Hg, mas não abra a torneira de três vias ainda.
4. Olhe através dos objectivos do microscópio e foco na superfície da retina. Busca de vasos sanguíneos ou células vermelhas do sangue. É possível que os vasos sanguíneos são completamente recolhidos, às vezes apenas que algumas células vermelhas do sangue são visíveis.
5. Quando um vaso sanguíneo encontra-se, concentre-se nele e abra a torneira de três vias. O diâmetro do vaso deve aumentar imediatamente e os glóbulos vermelhos também mover centrifugamente, se for uma arteríola, ou centripetamente em caso de uma Vénula. As arteríolas são menores em diâmetro, em comparação com vênulas da mesma ordem.
6. Uma vez que encontra-se um vaso sanguíneo com uma parede bem visível, pode ser empregado para experiências após um período de equilíbrio de 30 min (Figura 8). Durante o período de equilíbrio, as arteríolas desenvolvem apenas fraco tom intrínseco, resultando em menos de 10% de redução de diâmetro luminal.

4. realizando o experimento

1. Teste a viabilidade dos navios com o tromboxano mimética 9,11-dideoxy-9, 11α-methanoepoxy prostaglandina F_2α (U46619), adicionando-o para a solução de banho. Este agente contrai as arteríolas retina do rato por cerca de 50% do diâmetro de repouso em concentrações ≥ 10^-6 M.
2. Uma vez que o navio está confirmado viável, lave o agonista fora da banheira pela bomba de circulação e fornecer fresco tampão Krebs para o banho.

Representative Results

U-46619 produziu respostas vasoconstritor dependente da concentração em arteríolas da retina de ratos do selvagem-tipo do fundo C57Bl/6J. Em uma concentração de 10^-6 M, diminuição do diâmetro luminal foi ≈50% do diâmetro de descanso. Figura 9A mostra uma curva concentração-resposta representativa de uma arteríola retinal. Em arteríolas preconstricted com U46619, cumulativa administração de acetilcolina evocados dependente da concentração aumenta no diâmetro luminal para ≈25% do diâmetro preconstricted em 10^-5 M, indicativo de um endotélio vascular intacta ( Figura 9B).

Figura 1: dissecação do crânio rato. Pele sobre a cabeça decapitada do mouse é removida para expor os olhos e a cavidade orbital. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: isolamento do tecido do globo e orbital do olho. O osso orbital foi cortado com uma tesoura de olho e o globo de olho, juntamente com os tecidos retrobulbar e nervo óptico foram cuidadosamente isoladas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: O Globo do olho e preparação da artéria oftálmica. Uma vez que os tecidos circunvizinhos orbitais foram dissecados com bem micro-tesouras, a artéria oftálmica foi cuidadosamente exposta e seus pequenos ramos ligados com suturas de monofilamento de nylon 10-0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: dissecção das estruturas oculares. Para visualizar a retina, a esclera e Úvea foram dissecados com Vannas para Capsulotomia. Alguns tecidos scleral em torno do nervo óptico foi abandonado para evitar danos da artéria oftálmica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: câmara de órgão para microscopia de vídeo em tempo real. A câmara foi feita em casa. Ela consistia de uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro com um tubo em e out flow. Os tubos foram colados com adesivo de histoacryl. Externamente oxigenado e carbonatada tampão Krebs-Henseleit foi divulgado por uma bomba peristáltica através destes tubos. Uma extremidade de um tubo de silicone foi colada ao fundo da câmara e a outra extremidade anexado a uma torneira de três vias. No final do tubo, foi inserida uma micropipeta de vidro com uma ponta de 100 µm, que serviu para a canulação da artéria oftálmica. Através do tubo de silicone, a circulação de Oftalmologia foi pressurizada através do preenchimento de um tubo de silicone com tampão Krebs para um nível correspondente a 50 mm Hg. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: canulação da artéria oftálmica. A artéria oftálmica foi canulada com micropipeta de vidro e suturada com uma sutura de nylon 10-0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: canulação da artéria oftálmica. Depois de colocar a retina para a plataforma transparente, foi removida a lente com o saco capsular, quatro incisões radiais feitas na retina e um aço inoxidável de anel de 2,8 mm de diâmetro interno e 4,0 mm de diâmetro exterior foi colocado a retina para corrigi-lo para o b ottom. A retina então estava pronta para o experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: visualização de vasos da retina. Uma arteríola retinal exemplar com células vermelhas do sangue dentro.

Figura 9: estudos funcionais usando vídeo microscopia. Curvas de resposta de concentração representativo de uma única arteríola retinal. (A) curva concentração-resposta para o vasoconstritor, U46619 (10^-9 a 10^-6 M) e (B) para o endotélio-dependente vasodilatador, acetilcolina (10^-8 a 10^-5 M). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A medição das respostas vasculares na retina do rato é um desafio devido ao pequeno tamanho de vasos da retina. Com a técnica apresentada, arteríolas retina são visualizadas por microscopia de luz transmitida. Isso é possível, porque a retina isolada é translúcida. A vantagem da técnica é a alta resolução óptica. A resolução espacial calculada é 11 px/µm. No entanto, a resolução real para este sistema óptico que utiliza a luz branca é entre 200 e 300 nm, que é explicado pelo limite de difração de Abbe. Desde o primeiro ramo de arteríolas retina do rato tem um diâmetro interno de 20 a 30 µm, variações do diâmetro de aproximadamente 1% são detectáveis com este sistema. Não há nenhuma necessidade de dispositivos técnicos adicionais ou corantes fluorescentes conforme relatado em outros estudos Visualizar pequenas arteríolas retina^5,6,7. Uma desvantagem da técnica é o tempo de preparação longa, que é entre 90 a 120 min por investigadores treinados. Se o tempo de preparação excede 180 min, a função endotelial começa a ser atenuado.

Existem várias etapas críticas principais nesta técnica. Em primeiro lugar, é importante para ligate minuciosamente todos os ramos arteriais de retrobulbar. Se a ligadura é incompleta, arteríolas retina não irão ser pressurizadas devido ao escapamento. Em segundo lugar, a imersão em etanol por 10 s antes de abrir o globo de olho é importante para desactivar a reatividade do músculo liso da artéria oftálmica. Demonstramos anteriormente que imergindo por 10 s em 70% etanol desativa completamente a artéria oftálmica músculo liso⁸. Em contraste, arteríolas retina são susceptíveis de ser diretamente afetadas pelo etanol, já que eles estão protegidos pela parede bulbar. Se essa etapa for omitida, variações do diâmetro na artéria oftálmica podem influenciar a perfusão da retina. Digno de nota, a reatividade da artéria oftálmica marcadamente pode diferir do que arteríolas da retina em resposta ao mesmo agonista^9,10. Em terceiro lugar, evite a torção da artéria oftálmica. Especialmente durante a preparação da retina para a plataforma de montagem, a artéria oftálmica pode tornar-se torcido, resultando em oclusão do lúmen. Além disso, verificar cuidadosamente que a ponta do vidro capilar não é obstruída para habilitar a pressurização das arteríolas da retina. Nós sugerimos para não executar mais de três curvas concentração-resposta consecutivos na mesma preparação da retina, porque observamos que respostas à acetilcolina tornou-se mais fracas quando repetindo as curvas concentração-resposta por mais de três vezes. No entanto, podem haver diferenças em relação a repetibilidade das curvas concentração-resposta dependendo o agente aplicado e, assim, devem ser testadas individualmente.

Nós aplicamos extraluminally agentes farmacológicos em nossos estudos, embora intraluminal perfusão usando uma bomba de controle de servo também é possível. Uma vez que a técnica permite medir local mecanismos de reatividade vascular na retina de animais de pequeno laboratório, incluindo camundongos e ratos, as vantagens da tecnologia de gene-alvo com o uso de animais geneticamente modificados podem ser acessadas com esse método .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Steel Scissors	Carl Roth GmbH	3576.1	1x 140 mm
Eye Scissors	Geuder	G-19390	1x straight, 10.5 cm
Precision tweezers, straight with fine tips	Carl Roth GmbH	LH68.1	2x type 4
Precision tweezers, straight with extra fine tips	Carl Roth GmbH	LH53.1	2x type 5
Vannas capsulotomy scissors	Geuder	19760	1x straight, 77 mm
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91501-09	1x curved,
Barraquer Needle Holder	Geuder	G-17500	1x curved, 120 mm
Needle	Becton, Dickinson and Company	305128	1x 30 G
Glass Capillaries (for producing micropipettes)	Drummond Scientific Company	9-000-1211	1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter)
Nylon Suture	Alcon	198001	1x 10-0
Nunclon cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	153066	1x 35 mm diameter
Nunclon cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	172931	1x 100 mm diameter
Discofix C	Braun	16500C	10 cm
Histoacryl adhesive	B. Braun Surgical, S.A.	1050052
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Pericyclic pump  (CYCLO II)	Carl Roth GmbH	EP76.1	1x
Vertical Pipette Puller Model 700C	David Kopf Instruments		1x
Microscope (Vanox-T AH-2)	Olympus		1x
Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA	Olympus		1x
Digital camera (TK-C1381)	JVC		1x
Perfusion chamber	self-made		1x
Name	Company	Catalog Number	Comments
Drugs and Solutions
Ethanol	Carl Roth GmbH	K928.4
Calcium chloride dihydrate (CaCl2)	Carl Roth GmbH	5239.1
Kalium chloride (KCl)	Carl Roth GmbH	6781.1
Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Carl Roth GmbH	3904.2
Magnesium sulphate (MgSO4)	Carl Roth GmbH	261.2
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265.2
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Carl Roth GmbH	0965.3
α-(D)-(+)- Glucose monohydrate	Carl Roth GmbH	6780.1
9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619)	Cayman Chemical	16450
Acetylcholine chloride	Sigma-Aldrich	A6625-25G