Summary
Mange visjon-truende øyet sykdommer er assosiert med dysfunksjonelle retinal microvessels. Måling av netthinnen arteriole svar er derfor viktig å undersøke de underliggende patofysiologiske mekanismene. Denne artikkelen beskriver en detaljert protokoll for musen retinal arteriole isolasjon og forberedelser for å vurdere effekten av vasoactive stoffer på vaskulær diameter.
Abstract
Vaskulær insuffisiens og endringer i normal retinal perfusjon er blant de viktigste faktorene for patogenesen av ulike sight-truende øyet sykdommer, som diabetisk retinopati, Hypertensiv retinopati og muligens glaukom. Netthinnen mikrovaskulær forberedelser er derfor avgjørende verktøy for fysiologiske og farmakologiske studier for å avgrense de underliggende patofysiologiske mekanismene og design terapi for sykdommer. Til tross for den vide bruken av musen modeller i ophthalmica forskning er studier på netthinnen vaskulær reaktivitet mangelvare i denne arten. En viktig grunn til dette avviket er de utfordrende isolering prosedyrene på grunn av den lille størrelsen på netthinnen blodkar, som er ~ ≤ 30 µm luminal diameter. For å omgå problemet med direkte isolering av disse retinal microvessels for funksjonell studier, etablert vi en isolasjon og forberedelse teknikk som gjør at ex vivo studier av musen retinal vasoactivity under nær fysiologiske forhold . Selv om dagens eksperimentelle forberedelsene spesielt gjelder mus retinal arterioler, kan denne metodikken lett anvendes til microvessels fra rotter.
Introduction
Forstyrrelser i netthinnen perfusjon har vært innblandet i patogenesen av ulike øyet sykdommer, som diabetisk retinopati, Hypertensiv retinopati og glaukom1,2,3. Dermed studier måle vaskulær reaktivitet i netthinnen er viktig å forstå i Patofysiologien ved disse sykdommene, og for å utvikle ny behandling tilnærminger.
På grunn av muligheten for genet manipulasjon i murine genomet, har musen blitt en utbredt dyr modell for studier av kardiovaskulære systemet4. Men på grunn av den lille størrelsen på netthinnen blodkar (≤ 30 µm) er måling av vaskulær reaktivitet i musen netthinnen utfordrende. For eksempel stereomicroscopic teknikker for måling i vivo er begrenset i sin optisk oppløsning og derfor bare tillate å nøyaktig oppdage endringer i diameter eller blod flyte i små blod mindre enn ≤ 30 µm diameter når utstyrt med mer sofistikert enheter, for eksempel et AC confocal mikroskop med fluorescerende fargestoffer eller Adaptive optikk skanning lyset oftalmoskop5,6. Videre endringer tolkningen av i vivo mål som tar sikte på å identifisere lokale signalering mekanismer i netthinnen blodkar kan bli tilbakevist av anestesimidler, i systemisk blodtrykk og påvirkning av retrobulbar blodkar.
Derfor utviklet vi en metode for å måle svar av musen retinal blod fartøy med høy optisk oppløsning ex vivo. Teknikken presenteres her kan visualisering av netthinnen arterioler via overføres * lys. Denne metoden, som kan også brukes i rotter, gir tilgang til fordelene av genet målretting teknologi i okulær vaskulær forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentell prosedyrene for denne studien ble godkjent av dyr omsorg komiteen av Rheinland-Pfalz, Tyskland. Dyr omsorg likedannet institusjonelle retningslinjer og foreningen for forskning i visjon og Oftalmologi (ARVO) erklæringen for bruk av dyr i ophthalmica og visjon forskning. Dyrene ble behandlet i henhold til EUs direktiv 2010/63/EU for dyreforsøk. Mannlige C57BL/6J mus (Jackson laboratoriet, Bar havn, meg, USA) i alderen 3-4 måneder ble brukt for eksperimenter. Dyrene ble plassert under standard betingelser (temperatur 23 ± 2 ° C, luftfuktighet utvalg 55 ± 10% og 12t lys/mørke sykluser), og hadde tilgang til standardmus chow og vann ad libitum.
1. isolering av musen netthinnen
- Plasser disseksjon instrumentene i tabellen forberedelse og sjekke om alle instrumenter er komplett å aktivere en rask forberedelse.
- Ofre musen for CO2 innånding.
- Halshugge musen med stål saks, kutt skallen-sagitally i to halvdeler med samme par saks og fjerne hud og hjerne med øyet saks (figur 1).
- Avskåret hodeskallen bein å forlate bare orbital bein med øyet saks.
- Overføre bane til en disseksjon tallerken med iskald Krebs-Henseleit buffer.
- Holde disseksjon rett på isen eller endre bufferen hvert 10 min.
- Skjær orbital bein med øyet saks og fjerner øye verden sammen med orbital vevet med type 4 presisjon pinsett og Student Vannas våren saks (figur 2).
- Fjern Harderian kjertel, bindevev og extraocular musklene type 5 presisjon pinsett og Vannas capsulotomy saks, ta vare ikke for å skade den viktigste grenen av arteria ophthalmica.
- Ligate orbital grener av ophthalmica arterien og til slutt den proksimale enden av den viktigste grenen av ophthalmica subclavia bruker 10-0 Nylon sømmer (Figur 3).
- Overføre øye verden i en Petriskål med 70% etanol for 10 s bruk Skriv inn 4 presisjon pinsett. Plasser øye verden tilbake i disseksjon fatet og erstatte bufferen med fersk Krebs løsning. Hornhinnen vises hvitaktig etter etanol eksponering.
- Punktering perifere hornhinnen med en 30 gauge nål og dissekere hornhinnen med Vannas capsulotomy saks. Forsiktig kuttet iris vevet, Plasser en skarp spiss Vannas capsulotomy saks mellom akkord og netthinnen, og kuttet akkord og sclera. La noen Innbukking vev rundt den optiske nerven (Figur 4).
2. montere netthinnen i perfusjon kammeret
Merk: Perfusjon kammeret brukes for retinal arteriole eksperimenter er hjemmelaget. Det består av en gjennomsiktig reservoar med en inn- og utløp tube (figur 5). Ene enden av en silikon tube er limt til bunnen av kammeret med histoacryl lim og den andre enden knyttet til en treveis stopcock. Koble en sprøyte som inneholder ferske Krebs buffer treveis stopcock og fylle røret med buffer.
- Ta glass brønnene med en nål holder og skyv den i slutten av røret på bunnen av perfusjon kammeret. Deretter bryte spissen av brønnene med type 4 saks å få et tips av 100 µm diameter.
- Fokus på spissen av brønnene og skyll den via sprøyten koblet til røret. Pass på at av kapillær ikke er okkludert av rusk. Ved okklusjon, fjerne den, tømme slangen og sette inn en annen brønnene.
- Fyll perfusjon kammeret med kaldt Krebs buffer og sette kammeret under stereo mikroskop.
- Plass en gjennomsiktig plast plattform i perfusjon kammeret. Denne plattformen har et innrykk på 1,8 mm bredde for synsnerven og ophthalmica arterien og plasseres på to stål ledninger av 1,6 mm diameter. Deretter plassere en rustfritt stål ring 2,8 mm indre diameter og 4.0 mm ytre diameter på plattformen.
- Overfør netthinnen med den optiske nerven og tilknyttede ophthalmica arterien fra disseksjon kammeret i perfusjon kammeret forsiktig ved hjelp av en skje. Dette trinnet er viktig å unngå potensielle strekking av vev som det kan være skadelig for eksperimentet.
- Avskåret delen sutured i den proksimale enden av arteria ophthalmica plassere to preformed ledd av 10-0 nylon Sutur på brønnene og cannulate ophthalmica arterien med av brønnene. Knytte arterien til brønnene (figur 6), og plasser netthinnen på gjennomsiktig plattformen ved hjelp av fine-punkt-pinsett.
- Forsiktig rive åpne den fremre linsen capsula med to fine punktet pinsett, trekke ut linsen og kuttet av hele linsen capsula med microscissors.
- Deretter lage fire radial incisions i netthinnen halve avstanden fra pars plana til den optiske nerven og plassere en rustfritt stål ring på netthinnen å fikse det til bunnen. Netthinnen er nå klar for eksperimentet (figur 7).
3. forberedelse av netthinnen arterioler for eksperimentet
- Plass perfusjon kammeret under lys mikroskop. Målet er en 100 X vann nedsenking linsen.
- Koble de to produksjonsrør for i - og post-ut - flow til en pericyclic pumpe og sirkulere kammeret med Krebs buffer oksygenert med 95% O2 og kullsyreholdige med 5% CO2 på 37 ° C. Bruke en flow rate mellom 100 og 120 mL/min.
- Koble silikon røret, som er koblet til brønnene, til et reservoar silikon slangen via en treveis stopcock. Deretter Fyll tanken med Krebs buffer til en høyde som tilsvarer 50 mm Hg men ikke åpne treveis stopcock ennå.
- Se gjennom målene av mikroskopet og fokusere på netthinnen overflaten. Søke etter blodkar eller røde blodlegemer. Det er mulig at blodårer helt skjules, så noen ganger bare noen røde blod celler er synlige.
- Når en blodåre blir funnet, fokusere på den og åpne den treveis stopcock. Diameteren på fartøyet skal øke umiddelbart og de røde blodlegemene flytte en centrifugally, hvis det er en arteriole, eller centripetally i en venule. Arterioler er mindre i diameter enn venules i samme rekkefølge.
- Når en blodåre med en godt synlig mur er funnet, kan det anvendes for eksperimenter etter en balanse periode 30 min (Figur 8). I balanse perioden utvikle arterioler bare svake iboende tone som resulterer i mindre enn 10% av luminal diameter reduksjon.
4. utføre eksperimentet
- Teste om fartøy med den thromboxane mimetic 9,11-dideoxy-9α, 11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U46619) ved å legge den til bad løsning. Denne agenten constricts musen retinal arterioler med ca 50% fra hviler diameter på konsentrasjoner av ≥ 10-6 M.
- Når fartøyet er bekreftet levedyktig, vask Agonistiske ut av badet av sirkulerende pumpen og levere fersk Krebs buffer i badekaret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
U-46619 produsert konsentrasjon-avhengige vasoconstrictor svar i netthinnen arterioler fra vill-type mus på C57Bl/6J bakgrunnen. I en konsentrasjon av 10-6 M var reduksjon i luminal diameter ≈50% fra hvile diameter. Figur 9A viser en representant konsentrasjon-respons kurve av en netthinnen arteriole. I arterioler preconstricted med U46619, kumulative administrasjon av acetylcholine fremkalles konsentrasjon-avhengige øker luminal diameter til ≈25% preconstricted diameter på 10-5 M, antyder en intakt vaskulære endotelet ( Figur 9B).
Figur 1: Disseksjon av musen skallen. Huden på decapitated mus hodet fjernes for å utsette øynene og orbital hulrom. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: isolering av verden og orbital øyevevet. Orbital bein ble kuttet med øyet saks og øye verden sammen med retrobulbar vev og synsnerven var forsiktig isolere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: øye globe og utarbeidelse av arteria ophthalmica. Når omkringliggende orbital vev ble dissekert med fine microscissors, arteria ophthalmica ble nøye utsatt og deres små greiner samskrevet med 10-0 nylon monofilament sømmer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Disseksjon av okulære strukturer. For å visualisere netthinnen, ble sclera og uvea dissekert med Vannas capsulotomy saks. Noen Innbukking vev rundt den optiske nerven var igjen for å unngå skade av arteria ophthalmica. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: orgel kammer for sanntids video mikroskopi. Kammeret var hjemmelaget. Den besto av en Petriskål av 100 mm diameter med en i - og post-ut - flow rør. Rørene ble limt med histoacryl lim. Eksternt oksygenrikt og kullsyreholdige Krebs-Henseleit buffer ble sendt av en peristaltiske pumpe via disse rørene. Ene enden av en silikon tube var limt til bunnen av kammeret og den andre enden knyttet til en treveis stopcock. På slutten av røret, glass brønnene med et tips på 100 µm ble satt inn, som tjenestegjorde i cannulation av arteria ophthalmica. Via silikon røret, ophthalmica opplaget ble trykksatte ved å fylle en silikon tube med Krebs buffer til et nivå tilsvarende 50 mm Hg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Cannulation av arteria ophthalmica. Arteria ophthalmica var cannulated med glass brønnene og sutured med en 10-0 nylon Sutur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Cannulation av arteria ophthalmica. Etter å ha netthinnen på gjennomsiktig plattformen, linsen med capsular vesken ble fjernet, fire radial snitt ble gjort i netthinnen og en rustfritt stål ring 2,8 mm indre diameter og 4.0 mm ytre diameter ble plassert på netthinnen å fikse det b nederste. Netthinnen var klar for eksperimentet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: visualisering av netthinnen blodkar. En eksemplarisk retinal arteriole med røde blod celler inne.
Figur 9: funksjonell studier med video mikroskopi. Representant konsentrasjon svar kurver fra en enkelt retinal arteriole. (A) konsentrasjon-respons kurve for vasoconstrictor, U46619 (10-9 til 10-6 M), og (B) for endotelet avhengige av vasodilator, acetylcholine (10-8 til 10-5 M). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Måling av vaskulær svar i musen netthinnen er utfordrende på grunn av den lille størrelsen på netthinnen blodkar. Med presentert teknikken, er netthinnen arterioler visualisert ved overført * lys. Dette er mulig fordi isolert netthinnen er gjennomsiktig. Fordelen med teknikken er høy optisk oppløsning. Den beregnede romlig oppløsningen er 11 px/µm. Men er den virkelige oppløsningen for optisk system som bruker hvitt lys mellom 200 og 300 nm, som forklares ved Abbe Diffraksjon grensen. Siden den første grenen av musen retinal arterioler har en indre diameter på 20 til 30 µm, er diameter på ca 1% synlig med dette systemet. Det er ikke nødvendig med flere tekniske enheter eller fluorescerende fargestoffer som rapportert i andre studier å visualisere små retinal arterioler5,6,7. En ulempe ved teknikken er lang Forberedelsestid, som er mellom 90-120 minutter av utdannet etterforskere. Hvis Tilberedningstid overskrider 180 min, begynner endothelial funksjonen å dempes.
Det er flere kritiske hovedtrinn i denne teknikken. Først er det viktig å nøye ligate alle retrobulbar arterielle grener. Hvis hemorroider er ufullstendig, netthinnen arterioler vil ikke settes under trykk på grunn av lekkasje. Andre, nedsenking i etanol for 10 før åpning øye verden er viktig å deaktivere glatt muskel reaktivitet av arteria ophthalmica. Vi viste tidligere at leve for 10 s i 70% etanol helt deaktiverer ophthalmica arterien glatt muskel8. Derimot er retinal arterioler usannsynlig å bli direkte berørt av etanol, siden de er beskyttet av bulbar veggen. Hvis dette trinnet er utelatt, kan diameter endringer i arteria ophthalmica påvirke perfusjon av netthinnen. Av notatet avvike markert reaktivitet av arteria ophthalmica fra av netthinnen arterioler svar til samme Agonistiske9,10. Tredje, unngå torsjon av arteria ophthalmica. Spesielt mens montering retinal forberedelse på plattformen, kan arteria ophthalmica bli vridd, resulterer i okklusjon av lumen. Sjekk også nøye at spissen av glass kapillær ikke er okkludert for å aktivere pressurization av netthinnen arterioler. Vi foreslår ikke for å utføre mer enn tre påfølgende konsentrasjon svar kurver i samme retinal utarbeidelse, fordi vi observert at Svar å acetylkolin ble svakere da gjenta konsentrasjon svar kurvene for mer enn tre ganger. Men det kan være forskjeller om repeterbarhet konsentrasjon svar kurver avhengig av agent brukt og, dermed bør testes individuelt.
Vi brukt farmakologiske agenter extraluminally i våre studier, men intraluminal perfusjon ved hjelp av en servo kontroll pumpe er også mulig. Siden teknikken kan måle for lokale mekanismer for vaskulær reaktivitet i netthinnen av små forsøksdyr inkludert mus og rotter, kan fordelene med gene målretting teknologi ved hjelp av genmodifiserte dyr nås med denne metoden .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Ernst und Berta Grimmke Stiftung og Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (hunden).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
