Summary
Många syn-hotande okulär sjukdomar är associerade med dysfunktionella retinal microvesselsna. Mätning av retinal arteriole Svaren därför viktigt att undersöka de bakomliggande patofysiologiska mekanismerna. I artikeln beskrivs ett detaljerat protokoll för mus retinal arteriole isolering och förberedelse för att bedöma effekterna av vasoaktiva ämnen på vaskulär diameter.
Abstract
Vaskulär insufficiens och förändringar i normala retinal perfusion är bland de viktigaste faktorerna för patogenesen av olika synhotande okulär sjukdomar, såsom diabetesretinopati, hypertensiv retinopati och eventuellt glaukom. Retinal mikrovaskulära preparat är därför avgörande verktyg för fysiologiska och farmakologiska studier att avgränsa de bakomliggande patofysiologiska mekanismerna och design terapier för sjukdomar. Trots den utbredda användningen av musmodeller i oftalmologiska forskning är studier på retinal vaskulär reaktivitet knappa hos denna art. En viktig orsak till denna diskrepans är utmanande isolering förfaranden på grund av den lilla storleken av dessa retinala blodkärl, som är ~ ≤ 30 µm i luminala diameter. För att kringgå problemet med direkt isolering av dessa retinal microvesselsna för funktionella studier, etablerade vi en isolering och förberedelse teknik som möjliggör ex vivo studier av mus retinal vasoactivity nära-fysiologiska villkor . Även om nuvarande experimentell förberedelserna kommer att specifikt hänvisa till de mus retinal arterioler, kan denna metod lätt användas för att microvesselsna från råttor.
Introduction
Störningar i retinal perfusion har varit inblandade i patogenesen av olika ögonsjukdomar, såsom diabetesretinopati, hypertensiv retinopati och glaukom1,2,3. Således, studier som syftar till att mäta vaskulär reaktivitet i näthinnan är viktigt att förstå patofysiologin av dessa sjukdomar och för att utveckla ny behandling närmar sig.
På grund av möjligheten att genen manipulation i murina genomet blivit musen en allmänt använd djurmodell för studier av det kardiovaskulära system4. Men på grund av den lilla storleken av retinala blodkärl (≤ 30 µm) är mätning av vaskulär reaktivitet i mus näthinnan utmanande. Exempelvis stereomicroscopic tekniker för i vivo mätning är begränsade i sin optisk upplösning och därför endast tillåta exakt upptäcka förändringar i diameter eller blod flöde i små blod understiger ≤ 30 µm diameter när utrustad med ytterligare sofistikerade enheter, till exempel confocal Mikroskop med fluorescerande färger eller adaptiv optik Scanning Light oftalmoskop5,6. Dessutom förändringar signalerar mekanismer i näthinnans blodkärl kan vara tvetydiga på grund av anestetika, tolkningen av i vivo mätningar syftar till att identifiera lokala i systemiska blodtrycket och påverkan av retrobulbär blodkärl.
Därför har vi utvecklat en metod för att mäta Svaren av mus retinala blodkärl med hög optisk upplösning ex vivo. Tekniken presenteras häri gör visualisering av retinal arterioler via överförs ljusmikroskopi. Metoden kan också användas hos råttor, ger tillgång till fördelarna med genmodifiering teknik i okulär vaskulära forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimentella rutiner av denna studie godkändes av Animal Care kommittén av Rheinland-Pfalz, Tyskland. Djurvård överensstämde de institutionella riktlinjer och föreningen för forskning i Vision och oftalmologi (ARVO) redogörelse för användningen av djur i oftalmologiska och vision forskning. Djur behandlades enligt EU direktiv 2010/63/EU för djurförsök. C57BL/6J hanmöss (The Jackson Laboratory, Bar Harbour, mig, USA) som åldern 3-4 månader användes för experiment. Djur har varit inhysta under standart villkorar (temperatur 23 ± 2 ° C, luftfuktighet område 55 ± 10% och 12 h ljus/mörk cykler) och hade tillgång till vanlig mus chow och vatten ad libitum.
1. isolering av mus näthinnan
- Placera de dissektion instrument på tabellen förberedelse och kontrollera att alla instrument är komplett för att möjliggöra en snabb beredning.
- Offra musen av CO2 inandning.
- Halshugga musen med stål sax, klipp den skalle sagittalt i två halvor med samma par av sax och ta bort hud och hjärnan med hjälp av ögat sax (figur 1).
- Skär av skallbenet att lämna endast orbital benet med hjälp av ögat sax.
- Över omloppsbana till en dissektion maträtt som innehåller iskall Krebs-Henseleit buffert.
- Behålla dissektion skålen på is eller byta bufferten var 10 minut.
- Skär orbital benet med ögat sax och ta försiktigt bort ögat Globen tillsammans med orbital vävnaden med hjälp av typ 4 precision pincett och Student Vännäs våren sax (figur 2).
- Ta försiktigt bort denna körtel, bindväv och extraocular muskler använder typ 5 precision pincett och Vännäs capsulotomi sax, noga med att inte skada den viktigaste grenen av oftalmologiska artär.
- Ligera orbital grenar av oftalmologiska artär och så småningom den proximala änden av den viktigaste grenen av oftalmologiska artär med 10-0 Nylon suturer (figur 3).
- Överföra ögat världen i en petriskål som innehåller 70% etanol för 10 s använder typ 4 precision pincett. Placera i ögat världen tillbaka till dissektion skålen och ersätta bufferten med färska Krebs lösning. Hornhinnan visas vitaktig efter etanol exponering.
- Punktering perifera hornhinnan med en 30 gauge nål och dissekera hornhinnan med Vännäs capsulotomi sax. Försiktigt skära av iris vävnaden, placera en vass spets av Vännäs capsulotomi saxen mellan åderhinnan och näthinnan och avbröt den åderhinnan och sklera. Lämna några skleral vävnad runt synnerven (figur 4).
2. montering näthinnan i Perfusion kammaren
Obs: Perfusion kammaren används för retinal arteriole experiment är hemgjorda. Den består av en transparent reservoar med en in- och utflöde tube (figur 5). Ena änden av en silikon tub är limmad längst ned i kammaren med histoacryl lim och andra änden fästs en tre-vägs Avstängningskranen. Anslut en spruta innehållande färska Krebs buffert till trevägs Avstängningskranen och fyll röret med buffert.
- Ta ett glas mikropipett med en nålförare och skjut in slutet av röret på botten av perfusion kammaren. Sedan Bryt spetsen av en mikropipett med typ 4 sax för att få ett tips av 100 µm diameter.
- Fokusera på spetsen av en mikropipett och spola via sprutan ansluten till röret. Ta hand att kapillären inte är ockluderas av skräp. Vid ocklusion, ta bort det, spola slangen och sätt en annan mikropipett.
- Fyll perfusion kammaren med kall Krebs buffert och sätt i kammaren under en stereo Mikroskop.
- Placera en transparent plast plattform i perfusion kammaren. Denna plattform har en inbuktning av 1,8 mm bredd för synnerven och oftalmologiska artär och placeras på två ståltråd 1,6 mm diameter. Sedan placera en rostfritt stål ring av 2,8 mm innerdiameter och 4,0 mm yttre diameter på plattformen.
- Överför näthinnan med synnerven och bifogade oftalmologiska artär från dissektion kammaren till perfusion kammaren med extrem omsorg med en sked. Detta steg är viktigt att förhindra stretching av vävnaderna eftersom det kan vara skadligt för experimentet.
- Skär av den sys delen av den proximala änden av oftalmologiska artär, placera två förformade slingor av 10-0 nylon sutur på mikropipett och hål oftalmologiska artär med en mikropipett. Knyta artären till mikropipett (figur 6) och placera näthinnan på transparent plattformen använder fine-punkt-pincett.
- Försiktigt Riv den främre linsen capsula med två fina punkt pincett, dra ut linsen och skära av den hela objektivet capsula använder microscissors.
- Därefter gör fyra radiella snitt till näthinnan halva avståndet från de pars plana på synnerven och placera en rostfritt stål ring på näthinnan fixar det till botten. Näthinnan är nu redo för experimentet (figur 7).
3. beredning av Retinal arterioler för experimentet
- Placera perfusion kammaren under ett ljusmikroskop. Målet är en 100 X nedsänkning i vatten objektiv.
- Anslut två sladdarna för i - och ut - flow till en pericyclic pump och cirkulera kammaren med Krebs buffert syresatt med 95% O2 och kolsyrade med 5% CO2 vid 37 ° C. Använda ett flöde mellan 100 och 120 mL/min.
- Anslut silikon röret, som är ansluten till mikropipett, till en reservoar silikon slang via en tre-vägs Avstängningskranen. Sedan fylla reservoaren med Krebs buffert till en höjd som motsvarar 50 mm Hg men öppnar inte tre-vägs Avstängningskranen ännu.
- Titta igenom mål av Mikroskop och fokusera på näthinnans yta. Sök efter blodkärl eller röda blodkroppar. Det är möjligt att blodkärlen är helt kollapsade, så ibland bara några röda blodkroppar är synliga.
- När ett blodkärl, fokusera på det och öppna trevägs Avstängningskranen. Diametern på fartyget bör öka omedelbart och de röda blodkropparna flytta antingen Centrifugalgjutna, om det är en arteriole, eller centripetally vid en venule. Arterioler är mindre i diameter jämfört med venoler i samma ordning.
- När ett blodkärl med en väl synlig vägg finns, kan det användas för experiment efter en Jämviktstiden period av 30 min (figur 8). Under perioden Jämviktstiden utveckla arterioler endast svag inneboende ton vilket resulterar i mindre än 10% av luminala diameter minskning.
4. utför experimentet
- Testa lönsamheten för fartyg med den tromboxan mimetiska 9,11-dideoxy-9α, 11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U46619) genom att lägga till bad lösningen. Denna agent constricts mus retinal arterioler med cirka 50% från Vila diameter i koncentrationer på ≥ 10-6 M.
- När fartyget är bekräftat livskraftiga, tvätta agonist ur badkaret av cirkulerande pumpen och leverera färska Krebs buffert in i badet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
U-46619 producerade koncentrationsberoende vasokonstriktor svaren i näthinnans arterioler från vildtyp möss C57Bl/6J bakgrunden. Vid en koncentration på 10-6 M var minskningen av luminala diameter ≈50% från vilande diameter. Figur 9A visar en representativ koncentration-respons kurva av en retinal arteriole. I arterioler preconstricted med U46619, framkallat kumulativa administrering av acetylkolin koncentrationsberoende ökning av luminala diameter till ≈25% från preconstricted diameter på 10-5 M, vägledande av en intakt vaskulära endotel ( Figur 9B).
Figur 1: dissektion av mus skallen. Hud på avhuggna mus huvudet tas bort för att exponera ögonen och omloppsbanor kaviteten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: isolering av globe och orbital ögonvävnaden. Orbital benet skars med ögat sax och ögat Globen tillsammans med retrobulbär vävnader och synnerven var omsorgsfullt isolerade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: I ögat världen och förberedelse av oftalmologiska artär. När omgivande orbital vävnader var dissekeras med fina microscissors, oftalmologiska artär utsattes noggrant och deras små grenar sammanskrivna med 10-0 nylon monofilament suturer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: dissekering av okulära strukturer. För att visualisera näthinnan, var den sklera och uvea dissekerade med Vännäs capsulotomi sax. Vissa skleral vävnad runt synnerven var kvar för att undvika skador av oftalmologiska artär. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: orgel kammare för realtid video mikroskopi. Kammaren gjordes hem. Den bestod av en petriskål med 100 mm diameter med en i - och ut - flow röret. Rören var limmade med histoacryl klister. Externt syresatt och kolsyrade Krebs-Henseleit buffert skickades av en Peristaltisk pump via dessa rör. Ena änden av en silikon tub var limmade till botten av kammaren och den andra änden fästs en tre-vägs Avstängningskranen. I slutet av röret infogades en glas mikropipett med en spets av 100 µm, som tjänade som för kanylering av oftalmologiska artär. Via silikon röret, oftalmologiska cirkulationen var trycksatt genom att fylla en silikon tub med Krebs buffert till en nivå som motsvarar 50 mm Hg. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: kanylering av oftalmologiska artär. Oftalmologiska artär var kanylerade med glas mikropipett och sys med en 10-0 nylon sutur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: kanylering av oftalmologiska artär. Efter att placera näthinnan på transparent plattformen, linsen med kapsulära väskan togs bort, fyra radiella snitt har gjorts till näthinnan och en rostfri ring av 2,8 mm innerdiameter och 4,0 mm ytterdiameter placerades på näthinnan fixar det till b OGA. Näthinnan var sedan redo för experimentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: visualisering av näthinnans blodkärl. En exemplarisk retinal arteriole med röda blodkroppar inuti.
Figur 9: funktionella studier använder video mikroskopi. Representativa koncentrations-responskurvorna från en enda retinal arteriole. (A) koncentration-respons kurva för vasokonstriktor, U46619 (10-9 till 10-6 M), och (B) för endotel-beroende vasodilatorn, acetylkolin (10-8 till 10-5 M). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mätning av vaskulär svaren i mus näthinnan är utmanande på grund av den lilla storleken av näthinnans blodkärl. Med den presenterade tekniken visualiseras retinal arterioler av överförda ljusmikroskopi. Detta är möjligt, eftersom isolerade näthinnan är genomskinlig. Fördelen med tekniken är hög optisk upplösning. Den beräkna rumsliga upplösningen är 11 px/µm. Men är den verkliga upplösningen för detta optiska system som använder vitt ljus mellan 200 och 300 nm, vilket förklaras av Abbe diffraktionsgränsen. Eftersom den första grenen av mus retinal arterioler har en inre diameter av 20 till 30 µm, är diameter förändringar av ungefärligt 1% detekterbara med detta system. Det finns inget behov av ytterligare tekniska anordningar eller fluorescerande färgämnen som rapporterats i andra studier att visualisera små retinal arterioler5,6,7. En nackdel med tekniken är långa förberedelsetiden, som är mellan 90-120 min utbildade utredare. Om förberedelsetiden överstiger 180 min, börjar endotelfunktion dämpas.
Det finns flera stora kritiska steg i denna teknik. Först, är det viktigt att grundligt ligera alla retrobulbär arteriell grenar. Om ligatur är ofullständig, kommer retinal arterioler vara tryckfri på grund av läckage. Andra, nedsänkning i etanol för 10 s innan du öppnar ögat världen är viktigt att inaktivera muskulatur reaktiviteten av oftalmologiska artär. Vi har tidigare visat att doppa för 10 s i 70% etanol helt avaktiverar den oftalmologiska artär muskulatur8. Retinal arterioler är däremot osannolikt att påverkas direkt av etanol, eftersom de skyddas av bulbar väggen. Om detta steg utelämnas, kan diameter förändringar i oftalmologiska artär påverka perfusionen i näthinnan. Notera, reaktivitet av oftalmologiska artär kan markant skiljer sig från retinala arterioler svar på samma agonist9,10. För det tredje, Undvik vridning av oftalmologiska artär. Speciellt vid montering av retinal preparatet på plattformen, kan oftalmologiska artär bli vriden, vilket resulterar i ocklusion av lumen. Kontrollera även noga att spetsen på glas kapillären inte är ockluderas aktivera trycksättning av retinal arterioler. Vi föreslår inte för att utföra fler än tre på varandra följande koncentration-respons kurvor i samma retinal preparatet, eftersom vi observerade att Svaren till acetylkolin blev svagare när upprepande koncentration-respons kurvorna för mer än tre gånger. Men det kan finnas skillnader när det gäller repeterbarhet av koncentration-respons kurvor beroende på agenten tillämpas och, således, bör testas individuellt.
Vi tillämpade farmakologiska medel extraluminally i våra studier, men intraluminal perfusion med kontroll en Servopump är också möjligt. Eftersom tekniken gör det möjligt för att mäta för lokala mekanismer av vaskulär reaktivitet i näthinnan av små försöksdjur som möss och råttor, kan fördelar med gen-inriktning teknik med hjälp av genetiskt modifierade djur nås med den här metoden .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från det Ernst und Berta Grimmke Stiftung och Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (hunden).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
