Summary
Veel visie-bedreigende oogbeschadigingen en/of ziekten worden geassocieerd met disfunctionele retinale microvessels. De meting van de retinale arteriole reacties is daarom belangrijk om te onderzoeken van de onderliggende pathofysiologische mechanismen. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor muis retinale arteriole isolatie en voorbereiding te beoordelen van de effecten van vasoactieve stoffen op vasculaire diameter.
Abstract
Vasculaire insufficiëntie en wijzigingen in de normale netvlies perfusie behoren tot de belangrijkste factoren voor de pathogenese van diverse zicht-bedreigende oogbeschadigingen en/of ziekten, zoals diabetische retinopathie, hypertensieve retinopathie en eventueel glaucoom. Daarom, retinale microvasculaire voorbereidingen zijn cruciale instrumenten voor fysiologische en farmacologische studies af te bakenen van de onderliggende pathofysiologische mechanismen en ontwerp therapieën voor ziekten. Ondanks het ruime gebruik van Muismodellen in ophthalmic onderzoek zijn studies over retinale vasculaire reactiviteit schaars in deze soort. Een belangrijke reden voor dit verschil is de uitdagende isolatie procedures vanwege de geringe omvang van deze netvlies bloedvaten, oftewel ~ ≤ 30 µm in diameter van de luminal. Om te omzeilen het probleem van directe isolatie van deze netvlies microvessels voor functionele studies, opgericht wij een isolatie en voorbereiding techniek waarmee ex vivo studies van de retinale vasoactivity van de muis in de buurt van de fysiologische omstandigheden . Hoewel de huidige experimentele voorbereidingen specifiek naar de muis retinale arteriolen verwijzen zal, kan deze methodologie gemakkelijk worden gebruikt om te microvessels van ratten.
Introduction
Verstoringen in het netvlies perfusie zijn betrokken bij de pathogenese van verschillende oogbeschadigingen en/of ziekten, zoals diabetische retinopathie en hypertensieve retinopathie, glaucoom1,2,3. Dus, studies gericht op het meten van vasculaire reactiviteit in de retina zijn belangrijk om te begrijpen van de pathofysiologie van deze ziekten en voor de ontwikkeling van nieuwe behandeling benaderingen.
Als gevolg van de mogelijkheid van genetische manipulatie in de lymfkliertest genoom, is de muis een gebruikte diermodel voor studies over de cardiovasculaire systeem4geworden. Echter, vanwege de kleine omvang van retinale bloedvaten (≤ 30 µm), meting van vasculaire reactiviteit in de retina van de muis is uitdagend. Bijvoorbeeld, stereomicroscopic technieken voor in vivo meting zijn beperkt in hun optische resolutie en daarom alleen toestaan om precies de opsporing van wijzigingen in diameter of bloed stroom in kleine bloed van minder dan ≤ 30 µm diameter wanneer uitgerust met aanvullende geavanceerde apparaten, zoals een confocal microscoop met fluorescente kleurstoffen of de adaptieve optica Scanning licht oftalmoscoop5,6. Bovendien, de interpretatie van in vivo metingen gericht op het identificeren van lokale signalering mechanismen in netvlies bloedvaten kunnen worden verward door anesthesie, veranderingen in de systemische bloeddruk en de invloed van retrobulbaire bloedvaten.
Daarom ontwikkelden we een methode voor het meten van de reacties van het netvlies bloedvaten muis met hoge optische resolutie ex vivo. De hier vermelde techniek kunt visualisatie van retinale arteriolen via verzonden de lichte microscopie. Deze methode, die ook kan worden gebruikt bij ratten, biedt toegang tot de voordelen van gen targeting-technologie in oogbeschadigingen en/of vasculaire onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimentele procedures voor deze studie werden goedgekeurd door de Animal Care Comité van Rijnland-Palts, Duitsland. Dierenverzorgers voldaan aan de institutionele richtsnoeren en de vereniging voor onderzoek in de visie en oogheelkunde (ARVO) instructie voor het gebruik van dieren in Oogheelkunde en visie onderzoek. Dieren werden behandeld volgens de Europese richtlijn 2010/63/EG voor dierproeven. Mannelijke C57BL/6J muizen (het Jackson Laboratory, Bar Harbour, ME, USA) van 3-4 maanden oud werden gebruikt voor de experimenten. Dieren werden gehuisvest onder normale omstandigheden (temperatuur van 23 ± 2 ° C, luchtvochtigheid bereik 55 ± 10% en 12 h cycli van de licht/donker), en had toegang tot standaardmuis chow en water ad libitum.
1. isolatie van muis Retina
- Plaats van de dissectie-instrumenten op de tafel van de voorbereiding en controleer of alle instrumenten volledig om een snelle voorbereiding.
- Het offeren van de muis bij CO2 inademing.
- Decapitate de muis met een stalen schaar, snijd de schedel-sagitally in twee helften met behulp van hetzelfde paar van schaar en verwijder de huid en de hersenen met behulp van eye schaar (Figuur 1).
- Het bot van de schedel te verlaten alleen het orbitale bot met behulp van eye schaar afgesneden.
- Breng de baan in een dissectie schotel met ijskoude Krebs-Henseleit buffer.
- Houd de dissectie schotel op ijs of wijzigen van de buffer elke 10 min.
- Snij het orbitale bot met behulp van eye schaar en zachtjes Verwijder oog ter wereld samen met de orbitale weefsel met behulp van type 4 precisie pincetten en Student Vannas voorjaar schaar (Figuur 2).
- Verwijder voorzichtig de klier Harderian, bindweefsel en de spieren van de extraocular met behulp van type 5 precisie pincetten en Vannas capsulotomy schaar, verzorgen niet te beschadigen de hoofdtak van de oogheelkundige slagader.
- Afbinden orbitale takken van de oogheelkundige slagader en uiteindelijk het proximale einde van de hoofdtak van de oogheelkundige slagader met 10-0 Nylon hechtingen (Figuur 3).
- Pipetteer oog ter wereld in een petrischaal met 70% ethanol 4 precisie pincetten met behulp van 10 s typt. De oog-globe terug in de dissectie schotel plaatsen en de buffer vervangen door verse Krebs oplossing. Het hoornvlies verschijnt witachtige na ethanol blootstelling.
- Het perifere hoornvlies aanprikken met een naald van 30 meter en het ontleden van het hoornvlies met behulp van Vannas capsulotomy schaar. Zachtjes afgesneden van het iris-weefsel, plaatst u een scherpe punt van de schaar capsulotomy Vannas tussen het vaatvlies en netvlies en afgesneden van het vaatvlies en de sclera. Laat enkele scleral weefsel rond de oogzenuw (Figuur 4).
2. montage van het netvlies in de perfusie-zaal
Opmerking: De zaal van de perfusie gebruikt voor retinale arteriole experimenten is zelfgemaakte. Het bestaat uit een transparant reservoir met een in- en uitstroom buis (Figuur 5). Één uiteinde van een silicone buis is op de bodem van de kamer met histoacryl lijm en het andere uiteinde gekoppeld aan een drieweg afsluiter gelijmd. Verbinding maken met een injectiespuit met verse Krebs buffer naar de afsluiter van de drie-weg en vul de buis met buffer.
- Neem een glas micropipet met een naald houder en duw in het uiteinde van de buis op de bodem van de kamer van de perfusie. Dan breken het topje van de micropipet met een type 4 schaar te verkrijgen van een tip van 100 µm diameter.
- Focus op het puntje van de micropipet en spoel het via de spuit op de buis aangesloten. Zorg dat het capillair is niet geroteerd door puin. In geval van occlusie, verwijderen, de buis spoelen en invoegen van een andere micropipet.
- Vul de perfusie-zaal met koude Krebs buffer en zet de kamer onder een stereomicroscoop.
- Plaats een doorzichtige kunststof platform in de bedwelmingsruimte perfusie. Dit platform heeft een inspringing van 1,8 mm breedte voor de oogzenuw en de oogheelkundige slagader en wordt geplaatst op de twee stalen draden van 1,6 mm diameter. Dan een roestvrij stalen ring van 2,8 mm binnendiameter en buitendiameter van het 4,0 mm op het platform te plaatsen.
- Het netvlies met de oogzenuw en de bijgevoegde ophthalmic slagader van de dissectie-zaal overbrengen in de bedwelmingsruimte perfusie met uiterste zorg met behulp van een lepel. Deze stap is belangrijk om te voorkomen dat potentieel oprekken van de weefsels, zoals het schadelijk voor het experiment zijn kan.
- Afgesneden van het sutured deel van het proximale einde van de oogheelkundige slagader, plaatst u twee voorgevormde lusjes van de 10-0 nylon hechtdraad op de micropipet en cannulate van de oogheelkundige slagader met de micropipet. Bind de slagader aan de micropipet (Figuur 6) en plaats van het netvlies naar de transparante platform met behulp van fine-punt-pincet.
- Zachtjes scheuren open de voorste lens capsula met twee fijne punt pincet, uitlichten van de lens en de hele lens capsula met behulp van de microscissors afgesneden.
- Vervolgens vier radiaal insnijdingen in het netvlies de helft de afstand van de pars plana tot de oogzenuw en plaatst een roestvrij stalen ring op het netvlies te repareren aan de onderkant. Het netvlies is nu klaar voor het experiment (Figuur 7).
3. voorbereiding van de retinale arteriolen voor het Experiment
- Plaats de perfusie kamer onder een lichte Microscoop. Het doel is een 100 X water-immersie objectief.
- De twee buisjes voor in - en uitgaand - flow verbinden met een pericyclische pomp en circuleren van de zaal met Krebs buffer zuurstof met 95% O2 en koolzuurhoudende met 5% CO2 bij 37 ° C. Gebruik een debiet tussen 100 en 120 mL/min.
- Verbinden met de silicone buis, die is aangesloten op de micropipet, een stuwmeer silicone slang via een drieweg afsluiter. Dan, vul het reservoir met Krebs buffer tot een hoogte die overeenkomt met 50 mm Hg maar het drieweg afsluiter nog niet open.
- Kijk door de doelstellingen van de Microscoop en de focus op het netvlies oppervlak. Zoeken naar bloedvaten of rode bloedcellen. Het is mogelijk dat de bloedvaten volledig ingestort zijn, soms slechts dat enkele rode bloedcellen zichtbaar zijn.
- Wanneer een bloedvat wordt gevonden, richten op het en open het drieweg afsluiter. De diameter van het vaartuig onmiddellijk moet verhogen en de rode bloedcellen verplaatsen hetzij centrifugaal, als er een arteriole of centripetaal in geval van een venule. De arteriolen zijn kleiner in diameter t.o.v. venules van dezelfde orde.
- Zodra een bloedvat met een goed zichtbaar muur wordt gevonden, kan het worden gebruikt voor experimenten die na een periode van evenwichtsinstelling van 30 min (Figuur 8). Tijdens de periode van evenwichtsinstelling ontwikkelen de arteriolen enige zwakke intrinsieke Toon wat resulteert in minder dan 10% van vermindering van de diameter van de luminal.
4. het uitvoeren van het Experiment
- Test de levensvatbaarheid van vaartuigen met het Thromboxaan mimetische 9,11-dideoxy-9α, 11α-methanoepoxy prostaglandine F2α (U46619) toe te voegen aan de oplossing van het bad. Deze agent knelpunt muis retinale arteriolen door ongeveer 50% van de diameter rusten bij concentraties van ≥ 10-6 M.
- Zodra het schip is bevestigd levensvatbare, wassen van de agonist uit het bad door de circulatiepomp en leveren verse Krebs buffer in het bad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
U-46619 geproduceerd concentratie-afhankelijke vasoconstrictor reacties in netvlies arteriolen van wild-type muizen van de C57Bl/6J-achtergrond. Bij een concentratie van 10-6 M was afname van de diameter van de luminal ≈50% van de diameter van de rust. Figuur 9A toont een representatieve concentratie-reactie-curve van een retinale arteriole. In arteriolen preconstricted met U46619, cumulatieve beheer van acetylcholine verhoging van de concentratie-afhankelijke luminal diameter opgeroepen tot ≈25% van de preconstricted diameter op 10-5 M, van een intact vasculaire endotheel (indicatieve Figuur 9B).
Figuur 1: dissectie van de muis schedel. Huid op het hoofd van de onthoofde muis is verwijderd om de ogen en de orbitale holte bloot te stellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: isolatie van globe en orbital oogweefsel. Het orbitale bot werd gesneden met een schaar van het oog en oog ter wereld samen met de retrobulbaire weefsels en oogzenuw werden zorgvuldig geïsoleerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: het oog globe en de voorbereiding van de oogheelkundige slagader. Zodra de omliggende orbitale weefsels werden ontleed met fijne microscissors, de oogheelkundige slagader zorgvuldig werd blootgesteld en hun kleine takken afgebonden met 10-0 nylon monofilament hechtingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: dissectie van oogbeschadigingen en/of structuren. Om te visualiseren het netvlies, werden de sclera en uvea ontleed met Vannas capsulotomy schaar. Sommige scleral weefsel rond de oogzenuw werd achtergelaten om te voorkomen beschadiging van de oogheelkundige slagader. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: orgel kamer voor real-time videomicroscopie. De kamer was huisgemaakt. Het bestond uit een petrischaal diameter van 100 mm met een in - en uitgaand - flow buis. De buizen zijn gelijmd met histoacryl lijm. Extern zuurstofrijk en koolzuurhoudende Krebs-Henseleit buffer was verspreid door een peristaltische pomp via deze buizen. Één uiteinde van een Siliconen slang was gelijmd aan de onderkant van de kamer en het andere uiteinde gekoppeld aan een drieweg afsluiter. Aan het einde van de buis, is een glas micropipet met een tip van 100 µm ingevoegd, die diende voor de cannulation van de oogheelkundige slagader. Via de Siliconen slang, de oogheelkundige omloop was drukkend door het invullen van een Siliconen slang met Krebs buffer tot een niveau dat overeenkomt met de 50 mm Hg. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Cannulation van de oogheelkundige slagader. De oogheelkundige slagader was gecanuleerd met glazen micropipet en ingehecht met een 10-0 nylon hechtdraad. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Cannulation van de oogheelkundige slagader. Na het plaatsen van het netvlies naar de transparante platform, de lens met de kapselvorming zak werd verwijderd, vier radiaal incisies werden gemaakt in het netvlies en een RVS ring van 2,8 mm binnendiameter en buitendiameter van 4,0 mm werd gelegd op het netvlies te repareren b Ottom. Het netvlies is dan klaar voor het experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: visualisatie van retinale bloedvaten. Een voorbeeldige retinale arteriole met rode bloedcellen binnen.
Figuur 9: functionele studies met videomicroscopie. Representatieve concentratieresponskrommen uit een enkele retinale arteriole. (A) concentratie-responscurve voor de vasoconstrictor, U46619 (10-9 naar 10-6 M), en (B) voor het endotheel-afhankelijke vaatverwijdende, acetylcholine (10-8 tot 10-5 M). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meting van vasculaire reacties in het netvlies van de muis is uitdagend wegens de kleine grootte van de retinale bloedvaten. Met de voorgestelde techniek, worden retinale arteriolen gevisualiseerd door doorvallend licht microscopie. Dit is mogelijk, omdat de geïsoleerde netvlies doorschijnend is. Het voordeel van de techniek is de hoge optische resolutie. De berekende ruimtelijke resolutie is 11 px/µm. De echte oplossing voor deze optische systeem dat gebruikmaakt van wit licht is echter tussen 200 en 300 nm, die wordt verklaard door de limiet van Abbe diffractie. Aangezien de eerste tak van de retinale arteriolen muis een inwendige diameter van 20 tot 30 µm heeft, zijn diameterovergangen van ongeveer 1% aantoonbaar met dit systeem. Er is geen behoefte van extra technische apparaten of fluorescente kleurstoffen zoals gerapporteerd in andere studies te visualiseren kleine retinale arteriolen5,6,7. Een nadeel van de techniek is de lange voorbereidingstijd, die tussen de 90 tot 120 min door opgeleide onderzoekers ligt. Als de voorbereidingstijd 180 min overschrijdt, wordt de functie van het endotheel begint te worden verzwakt.
Er zijn verschillende belangrijke kritische stappen in deze techniek. Ten eerste is het belangrijk om grondig afbinden alle retrobulbaire arteriële takken. Als afbinding onvolledig is, retinale arteriolen zal niet worden onder druk als gevolg van lekkage. Tweede, de onderdompeling in ethanol voor 10 s voor het openen van het oog globe is belangrijk om te deactiveren van de reactiviteit van de gladde spieren van de oogheelkundige slagader. Wij eerder aangetoond dat onder te dompelen voor 10 s in 70% ethanol volledig deactiveert de oogheelkundige slagader glad spierweefsel8. Netvlies arteriolen zijn daarentegen waarschijnlijk rechtstreeks worden beïnvloed door ethanol, omdat ze beschermd worden door de bulbaire muur. Als deze stap wordt weggelaten, diameterovergangen in de oogheelkundige slagader invloed kunnen hebben op de perfusie van het netvlies. Van de nota, kan reactiviteit van de oogheelkundige slagader aanzienlijk afwijken van de retinale arteriolen in reactie op de dezelfde agonist9,10. Ten derde, Vermijd torsie van de oogheelkundige slagader. Vooral tijdens het monteren van de retinale voorbereiding op het platform, kan de oogheelkundige slagader worden gedraaid, wat resulteert in occlusie van de lumen. Ook, Controleer zorgvuldig dat het puntje van de glazen viscometerbuizen is niet geroteerd zodat drukregeling van retinale arteriolen. Wij stellen voor om niet uit te voeren van meer dan drie opeenvolgende concentratieresponskrommen in de dezelfde retinale voorbereiding, omdat we waargenomen dat reacties op acetylcholine zwakker werd toen de concentratieresponskrommen voor meer dan driemaal herhalen. Nochtans, kunnen er verschillen ten aanzien van de herhaalbaarheid van de concentratieresponskrommen afhankelijk van de agent toegepast en, dus, moeten afzonderlijk worden beproefd.
We farmacologische agenten extraluminally toegepast in onze studies, hoewel intraluminale perfusie met een servo control pomp ook mogelijk is. Aangezien de techniek maakt het mogelijk om te meten voor lokale mechanismen voor vasculaire reactiviteit in de retina van kleine laboratoriumdieren, met inbegrip van muizen en ratten, kunnen de voordelen van gentargeting technologie met behulp van genetisch gemodificeerde dieren worden benaderd met deze methode .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van de Ernst und Berta Grimmke Stiftung en de Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (hond).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
