Summary
هنا نقدم بروتوكول مفصلاً للكشف عن كل مسن والخلايا الجذعية pluripotent في العضلات الهيكلية عند الإصابة أثناء حمل في فيفو إعادة برمجة. هذا الأسلوب مناسبة لتقييم دور الشيخوخة الخلوية أثناء تجديد الأنسجة وإعادة برمجة في فيفو.
Abstract
الشيخوخة الخلوية هو استجابة إجهاد التي تتميز بحملة اعتقال نمو خلوي مستقر، هو أمر مهم لكثير من العمليات الفسيولوجية والمرضية، مثل السرطان والشيخوخة. في الآونة الأخيرة، كما قد تورط الشيخوخة في إصلاح الأنسجة وتجديدها. ولذلك، أصبح متزايد الأهمية لتحديد الخلايا مسن في فيفو. التحليل المرتبطة بالشيخوخة β-جالاكتوسيداسي (SA-β-غال) هو التحليل الأكثر استخداماً للكشف عن خلايا مسن في الثقافة و في فيفوعلى حد سواء. ويستند هذا التحليل محتويات الليزوزومية زيادة في الخلايا مسن، الذي يتيح الكشف عن نشاط الليزوزومية β-جالاكتوسيداسي histochemical في سوبوبتيموم درجة الحموضة (6 أو 5.5). بالمقارنة مع فحوصات أخرى، مثل التدفق الخلوي، وهذا ما يسمح تحديد الخلايا مسن في بيئتهم المقيم، الذي يقدم معلومات قيمة مثل الموقع المتعلقة بهندسة الأنسجة، مورفولوجية، إمكانية اقتران مع علامات أخرى عبر إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة). الحد الرئيسية للمقايسة سا-β-غال هو المطلب للعينات الطازجة أو المجمدة.
نقدم هنا، بروتوكول مفصل لفهم الشيخوخة الخلوية كيف تشجع التجديد اللدونة والأنسجة الخلوية في فيفو. نحن نستخدم سا-β-غال للكشف عن خلايا مسن في العضلات الهيكلية عند الإصابة، ونظام راسخ لدراسة تجديد الأنسجة. وعلاوة على ذلك، يمكننا استخدام المدينة للكشف عن نانج، علامة على الخلايا الجذعية pluripotent، في طراز ماوس المعدلة وراثيا. هذا البروتوكول يتيح لنا لدراسة وتحديد الشيخوخة الخلوية في السياق اللدونة الخلوية المستحثة و في فيفو إعادة برمجة.
Introduction
الشيخوخة الخلوية شكل من إجهاد استجابة تتسم بحملة اعتقال دورة خلية مستقرة. في العقد الماضي، أثبتت البحوث اعتقادا راسخا أن الشيخوخة يرتبط مع مختلف العمليات البيولوجية والمرضية بما في ذلك التنمية الجنينية والتليف والكائن الشيخوخة1،2. للمرة الأولى الشيخوخة الخلوية في الخلايا الليفية البشرية في نهاية حياتها replicative فجرتها telomere تقصير3. بالإضافة إلى الإجهاد ريبليكاتيفي، هناك الكثير من المحفزات الأخرى التي يمكن أن تسبب الشيخوخة، بما في ذلك الأضرار الحمض النووي والأكسدة وإشارات النمطان والتعديلات الجينية/ابيجينوميك، أي منها في نهاية المطاف تنشيط p53/p21 و/أو pRB المسارات إلى إنشاء وتعزيز اعتقال دائمة النمو1. واحدة من الخصائص الهامة للخلايا مسن هو أنها تبقى أيضي نشطة وقوة التعبير عن المرتبطة بالشيخوخة افرازية النمط الظاهري (ساسب): إفراز من كثير من السيتوكينات الالتهابية، وعوامل النمو والمصفوفة خارج الخلية 4من العوامل. واقترحت العوامل ساسب تلعب دوراً مهما في التوسط وتضخيم أثر الشيخوخة، نظراً لما لها من آثار قوية على جذب الخلايا المناعية وتغيير النسيج وجهازيه الأوساط1. من المثير للاهتمام، اقترحت مؤخرا الشيخوخة مهمة للأنسجة إصلاح وتجديد5،6. وباﻹضافة إلى ذلك، اقترحت البيانات من مختبرات عدة، بما في ذلك بلدنا، أن الشيخوخة الناجمة عن تلف الأنسجة قد تعزز اللدونة الخلوية، عن طريق وفقا، لتعزيز التجديد7–9. ولذلك، كافة البيانات الناشئة تسليط الضوء على أهمية دراسة الشيخوخة في الجسم الحي.
في حقبة ما بعد المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (اللجنة التوجيهية)، هو اللدونة الخلوية قدرة خلية للحصول على هوية جديدة واعتماد مصير بديلة عند التعرض لمؤثرات مختلفة سواء في الثقافة و في فيفو10. ومن المعروف أن إعادة برمجة كاملة يمكن أن يتحقق في فيفو11،12، حيث التعبير عن الكاسيت الذي يحتوي على أربعة عوامل ياماناكا: Oct4، Sox2، Klf4، و ج-حركة (أوسكم) يمكن أن يكون المحرض في فيفو لتشجيع تشكيل تيراتوماس في الأجهزة متعددة. ولذلك، يمكن استخدام نموذج ماوس ريبروجرامابل (i4F) كنظام قوي لتحديد المنظمين الحرجة والمسارات التي تعتبر مهمة للهاتف الخلوي اللدونة11.
نظام مناسب والحساسة في فيفو ضروري لفهم الشيخوخة الخلوية كيف ينظم اللدونة الخلوية في سياق تجديد الأنسجة. نقدم هنا، نظام قوي وبروتوكول مفصلة لتقييم العلاقة بين الشيخوخة واللدونه الخلوية في سياق تجديد الأنسجة. تلف العضلات مزيج من كارديوتوكسين (CTX) التي يسببها في مجموعة العضلات الظنبوبي الأمامي (تا)، نظام راسخ لدراسة تجديد الأنسجة، ونموذج الماوس i4F، يتيح الكشف عن الشيخوخة الخلوية و في فيفو إعادة برمجة أثناء تجديد العضلات.
تقييم العلاقة بين اللدونة الخلوية والشيخوخة، أصيب مع CTX للحث على تلف العضلات الحاد الفئران i4F وتعامل مع الدوكسي (0.2 مغ/مل) أكثر من 7 أيام حمل في فيفو إعادة برمجة. في حين CTX الناجم عن تلف العضلات الحاد وتجديد البروتوكول قد نشرت مؤخرا13، لأسباب أخلاقية، سوف يحذف هذا الإجراء في البروتوكول الحالي. جمع عينات العضلات تا في 10 أيام بعد إصابة13في عند ذروة مسن الخلايا وقد لوحظ سابقا14. هنا، يصف هذا البروتوكول مفصلاً جميع الخطوات المطلوبة لتقييم مستوى الشيخوخة (عن طريق سا-β-غال) وإعادة برمجة (عن طريق تلطيخ المدينة من نانوج).
التحليل المرتبطة بالشيخوخة بيتا-جالاكتوسيداسي (SA-β-غال) هو التحليل الأكثر استخداماً للكشف عن خلايا مسن على حد سواء في الثقافة و في فيفو15. مقارنة بالاختبارات الأخرى، مقايسة سا-β-غال يسمح تحديد الخلايا مسن في بيئتها الأصلية مع هندسة الأنسجة سليمة، الذي يكتسي أهمية خاصة للدراسة في فيفو . وعلاوة على ذلك، فمن الممكن الزوجين المقايسة سا-β-غال مع علامات أخرى استخدام المدينة. ومع ذلك، تتطلب المقايسة سا-β-غال العينات الطازجة أو المجمدة، الذي يبقى قيداً رئيسيا. عندما الأنسجة الطازجة أو المجمدة متوفرة بشكل روتيني، مثل عينات العضلات تا المجمدة، سا-β-غال من الواضح أن التحليل الأكثر مناسبة للكشف عن خلايا مسن. نانج هي علامة تستخدم للكشف عن الخلايا ريبروجراميد لسببين: 1) علامة أساسية بلوريبوتينسي؛ 2) والأهم التعبير عن عدم تحركها الدوكسي (دوكس)، ولذلك يكشف المستحث بلوريبوتينسي بدلاً من التعبير القسري من كاسيت ياماناكا.
من المهم أن نلاحظ، البروتوكولات المصبوغة المعروضة في هذه الدراسة يمكن أن تجري بشكل منفصل تبسيط إجراء التقدير الكمي، ولكن يمكن أيضا أن يتم في إجراء المشترك المصبوغة لتصور كل مسن والخلايا الجذعية pluripotent في نفس القسم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم التعامل مع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية "الاتحاد الأوروبي"، ولجنة الأخلاقيات البروتوكولات معهد باستور (سيتا) وافق.
1-الأعمال التحضيرية "الحلول الأسهم"
- إعداد المواد اللازمة لتثبيت عينة العضلات. حل 0.5 غ صمغ تراجاكانث مع المياه 20 مل في الرايت جعل المتوسطة تضمين تجميد لتثبيت العضلات.
- إعداد الحلول لتلطيخ سا-β-غال-
- إعداد المخزون الحلول ك 3 Fe(CN) 6 (100 ملم)، ك 4 Fe(CN) 6 (100 ملم)، مجكل 2 (م 1) بإذابة مساحيق كل منهما في الماء المقطر.
- إعداد الحل الأسهم من 0.2 ٪ ج 20 ح 6 ر 4 غ 2 س 5 (ويوزين) باذابته في المياه-
- إعداد حل الأسهم بركلنو 6 ج 14 ح 15 (X-غال) (50 ملغم/مل) بإذابة مسحوق X-غال في ج 3 ح 7 لا (dimethylformamide، DMF).
- "ك مخزن" 3 Fe(CN) 6 وحلول 4 Fe(CN) 6 ك في 4 درجات مئوية، و مجكل 2 في الرايت
ملاحظة: X-غال يمكن تخزينها في قاسمة في-20 درجة مئوية، تصل إلى 6 أشهر. يمكن الإبقاء على RT حل ويوزين واستخدامها بعد التصفية إذا لزم الأمر. ك 3 Fe(CN) 6 وحلول 4 Fe(CN) 6 كيلو من الضوء بروتيكتيدفرومثي. الحل العاشر-غال ليست مستقرة في المياه، ويجب أن تكون محمية من الضوء.
- إعداد الحلول لتلطيخ نانج: الحل بيرميبيليزيشن يحتوي على 0.1% Na 3 ج 6 ح 5 س 7 (سترات صوديوم)، 0.1% C 14 ح 22 س (ج 2 ح 4 س) n (n = 9-10) (Triton X-100) في الماء المقطر، التي يجب تخزينها في 4 ° C. إعداد عرقلة الحل الذي يحتوي على 5% مصل بقرى الجنين (FBS) في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، التي ينبغي أن تكون مخزنة في الرايت
2. ستينينج سا-β-غال في "تجميد قسم العضلات تا"
- إعداد مواد التثبيت للعضلات تا عن طريق وضع كمية صغيرة من تراجاكانث الصمغ على قطعة من الفلين.
- إصابة الفئران من كلا الجنسين (2 الشهر القديمة، C57/B6) أصيب قبل عشرة أيام مع كارديوتوكسين (CDX) كما هو موضح سابقا 13. استخدام غير مضرورة تا (برنامج تلفزيوني حقن) من الماوس نفسه كعنصر سلبي. إذا كان المطلوب هو في فيفو إعادة برمجة، تعامل كل الماوس مع دوكس (1 ملغ/مل) في مياه الشرب في اليوم نفسه (محمية من الضوء)، الحق بعد إصابة CTX.
ملاحظة: الحل دوكس يحتاج إلى تغيير كل 3 أيام لمدة 7 أيام علاج التام.- عزل كلا العضلات تا (أصيب بجروح والتحكم) من الفئران كما هو موضح سابقا ( الشكل 1A) 13. لضمان مقاطع عرضية، إدراج وتر القاصي عضلة تا الصمغ tragacanth واترك جزء تقريبا ¾ عضلة خارج ( الشكل 1B) وتجميد مباشرة في نيتروجين سائل تبريد إيسوبينتاني عن < 1 الحد الأدنى
ملاحظة: تأكد من العضلات تا في وضع عمودي وفي وسط الفلين. يمكن تخزين العينات في-80 درجة مئوية، أو مباشرة كريوسيكتيونيد في 10 ميكرون المقاطع.
- عزل كلا العضلات تا (أصيب بجروح والتحكم) من الفئران كما هو موضح سابقا ( الشكل 1A) 13. لضمان مقاطع عرضية، إدراج وتر القاصي عضلة تا الصمغ tragacanth واترك جزء تقريبا ¾ عضلة خارج ( الشكل 1B) وتجميد مباشرة في نيتروجين سائل تبريد إيسوبينتاني عن < 1 الحد الأدنى
- معالجة العضلات تا كما هو موضح في الشكل 1B.
- توزيع 1 st-10 th المقاطع بالترتيب الصحيح على عشر شرائح مختلفة في الموضع الأيسر العلوي لكل شريحة. ضع الجزء ال 11 المجاورة إلى قسم ش 1 على الشريحة الأولى؛ وسيتابع الجزء ال 12 بنفس الترتيب لتوضع الحق إلى جانب القسم 2 nd على الشريحة الثانية. كرر هذه العملية حتى يتم الحصول على 10 أقسام/الشريحة للشرائح العشر (المقاطع 100 في المجموع) لضمان الحد الأدنى 1 مم المسافة بين المقطع الأول والمقطع الأخير-
- إصلاح المقاطع لمدة 4 دقائق في برنامج تلفزيوني يتضمن بارافورمالدهيد 1% و 0.2 ٪ glutaraldehyde. يغسل مع برنامج تلفزيوني، 2 × 10 دقيقة. بعد ذلك، احتضان المقاطع في برنامج تلفزيوني (pH = 5.5) 30 دقيقة لتنفيذ كافة الخطوات في الرايت
ملاحظة: التثبيت يجب أن تكون خفيفة للمحافظة على النشاط الأنزيمي. تنفيذ هذه الخطوة تحت غطاء محرك السيارة. الرقم الهيدروجيني لبرنامج تلفزيوني أمر بالغ الأهمية ويجب حماية الحل X-غال من الضوء. - الأقسام إينكوباتي في احتواء حل غال س: 4 مم K3Fe(CN) 6 مم 4 K4Fe(CN) 6، 2 مم MgCl2 و 400 ميكروغرام/مل س-غال في برنامج تلفزيوني، pH = 5.5. احتضان في الظلام في 37 درجة مئوية على الأقل ليغسل 24 h. الشرائح مع برنامج تلفزيوني، 3 × 10 دقيقة، في الرايت
ملاحظة: يتطلب حدا أدنى لمدة 24 ساعة الحضانة ويمكن أن تستمر لمدة 48 ساعة تكبير إشارة سا-β-غال. الحل يحتاج إلى تغيير بعد 24 ساعة حضانة. وينبغي حماية الشرائح من الضوء. إلا إذا كان المطلوب هو تلطيخ سا-β-غال، تابع مع الخطوة 2.5. إذا كان المطلوب هو تلطيخ يشترك مع نانج، الرجاء القفز إلى الأمام للخطوة 3.1.
بارافورمالدهيد - الشرائح الإصلاح في 1% في برنامج تلفزيوني عن 30 دقيقة يغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني، 3 × 10 دقيقة كونتيرستين مع ويوزين 0.2%. تزج الشرائح في الحل ثم لمدة 1 دقيقة وشطف لهم مع الماء المقطر بإيجاز. أخيرا، جبل الشرائح مع مائي متوسط التركيب غير الاستشعاع (انظر الجدول للمواد)-
ملاحظة: من الضروري إجراء التثبيت فيما بعد. تنفيذ هذه الخطوة تحت غطاء محرك السيارة. يتم تنفيذ كافة الخطوات في الرايت
3. جسم نانج مكافحة استخدام إيمونوهيستوتشيميستري
- إصلاح الشرائح مع برنامج تلفزيوني يتضمن بارافورمالدهيد 4% للغسيل 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني، 2 x 10 كحد أدنى إضافة 200 ميليلتر من محلول بيرميبيليزيشن مباشرة على الشرائح واحتضان لمدة 5 دقائق.
- يغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني، 2 × 5 دقيقة وفي الغسيل الأخير، استخدام 200 ميليلتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.25% جيش صرب البوسنة مباشرة على الشرائح. القيام بكافة هذه الخطوات في الرايت
تنبيه: قم بإجراء خطوة التثبيت تحت غطاء محرك السيارة-
- يغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني، 2 × 5 دقيقة وفي الغسيل الأخير، استخدام 200 ميليلتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.25% جيش صرب البوسنة مباشرة على الشرائح. القيام بكافة هذه الخطوات في الرايت
- إينكوباتي الشرائح مع جسم نانج مكافحة الأولية (التركيز النهائي: 1.25 ميكروغرام/مل) في ليلة وضحاها 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني يحتوي على 5% FBS. تغسل شرائح مع برنامج تلفزيوني، 2 × 10 دقيقة وفي الغسيل الأخير، استخدام 200 ميليلتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.25% جيش صرب البوسنة لأدنى 5 إجراء غسل جميع الخطوات في الرايت
ملاحظة: احتضان الشرائح في مربع مع منشفة ورقية مبللة لمنع تبخر.
طقم الشرائح - إينكوباتي مع 100 ميليلتر من جسم الثانوي rAb-برنامج الصحة الإنجابية من استعداد لاستخدام (انظر الجدول للمواد) للشرائح يغسل 45 دقيقة مع برنامج تلفزيوني، 3 x 5 دقيقة، إزالة الأجسام المضادة الثانوية. تنفيذ كافة الخطوات في الرايت مع الحماية من الضوء. أولاً، تضعف
- التصور
- 3,3 '-ديامينوبينزيديني (ج 12 ح 14 ن 4 ج 12 ح 18 Cl 4 ن 4 (4 HCl)، الدأب) في المخزن المؤقت للركيزة قدمتها جاهز لاستخدام طقم (20 ميليلتر من الدأب على 1 مل من محلول المخزن المؤقت الركازة). إضافة 100 ميليلتر من محلول الدأب مباشرة على كل شريحة، واحتضان لمدة أقصاها 10 دقائق في الرايت
ملاحظة: الحل الدأب المخفف ينبغي أن تعد طازجة ويمكن تخزينها لفترة تصل إلى أسبوع واحد في 4 درجات مئوية. فترة حضانة المرض يمكن تعديلها لتقليل الإشارات الخلفية ولكن يجب أن يبقى نفسه بالنسبة لكافة الشرائح. - إزالة الحل الدأب قبل الشطف بالماء. كونتيرستاين الشرائح مع حل سريع أحمر (جاهز لاستخدام، انظر الجدول للمواد) على 20 دقيقة يغسل الشرائح مع المياه مرة أخرى بإيجاز-
- يذوي لهم مع الإيثانول 95% م 5تليها في الإيثانول 100 ٪، 2 × 5 دقيقة. أخيرا، جبل الشرائح مع تصلب سريعة التركيب المتوسطة (انظر الجدول للمواد)-
- مراقبة الشرائح تحت المجهر في الميدان مشرق على 20 X لتجنب الخلفية.
ملاحظة: حل سريع الأحمر يمكن الإبقاء على RT وإعادة استخدامها بعد تصفية.
- 3,3 '-ديامينوبينزيديني (ج 12 ح 14 ن 4 ج 12 ح 18 Cl 4 ن 4 (4 HCl)، الدأب) في المخزن المؤقت للركيزة قدمتها جاهز لاستخدام طقم (20 ميليلتر من الدأب على 1 مل من محلول المخزن المؤقت الركازة). إضافة 100 ميليلتر من محلول الدأب مباشرة على كل شريحة، واحتضان لمدة أقصاها 10 دقائق في الرايت
4. التحليل والتقدير الكمي
- SA-β-غال التقدير الكمي
- مسح الشرائح واختيار الأقسام أفضل على كل شريحة استناداً إلى الصور المكتسبة. استخدام المقاطع على الأقل 2/تا للقياس الكمي. القاضي المقطع ' s الجودة استناداً إلى سلامة الأنسجة، نوعية تلطيخ، وكونتيرستينينج. للتحديد الكمي، اختر فرعين جودة أعلى مع أقصى مسافة ممكنة بين العينات، الذي يتيح تمثيلاً أفضل للقياس الكمي سا-β-غال في جميع أنحاء العضلات تا كله.
- التقدير الكمي للخلايا إيجابية سا-β-غال ( الشكل 2).
- تحديد رتبة حجم بكسل عن طريق يدوياً تحديد أصغر وأكبر الخلايا سا-β-غال إيجابية.
- بفتح الصورة الرقمية للشريحة الممسوحة ضوئياً باستخدام برنامج إيماجيج-
- في الواجهة، انقر فوق ' تحليل ' > ' أدوات ' > ' دوروا مدير ' > ' تحليل ' > ' تعيين القياس ' > ' حدد منطقة '. استخدم أداة التحديد وتحيط أصغر وأكبر إيجابية سا-β-غال الخلية وإضافته إلى إدارة العائد على الاستثمار عن طريق النقر على ' إضافة '. قياس الأحجام تستخدم ' قياس ' زر وحفظ القيم لاستخدامها في وقت لاحق.
- ضبط المعلمة العتبة إلى تأكد من تحديد كافة الخلايا المرئية إيجابية.
- تحويل الصورة إلى تدرج الرمادي بواسطة النقر فوق ' صورة ' > ' نوع ' > ' 8 بت ' ( الشكل 2A). بعد ذلك، انتقل إلى ' الصورة ' > ' ضبط ' > ' عتبة '، حرك المؤشر الثاني حتى يتم تغطية كافة الخلايا سا-β-غال إيجابية باللون الأحمر ( الشكل 2)، ثم انقر فوق ' تطبيق '.
- تحليل الجزيئات بواسطة النقر فوق ' تحليل ' > ' "تحليل الجزيئات" ' > ' الحجم (بكسل ^ 2) '، وتطبيق القيمة المحددة في الخطوة 4.1.2.1، أدخل ' التدوير ': ' 0.00-1.00 '، انقر فوق ' طيب '؛ وملخص لكل ويرد الجسيمات التي تم جردها في إدارة العائد على الاستثمار ( الشكل 2D).
- نقل جميع الجسيمات المحدد للصورة الأصلية. ضبط التحديد يدوياً لضمان دقة القياس الكمي. إضافة خلايا إيجابية (السهم الأخضر، الشكل 2E) و/أو إزالة الخلايا إيجابية كاذبة (سهم أحمر، الشكل 2E). وأخيراً، قياس المنطقة التي تبين استخدام القسم ( الشكل 2D) ' أداة التحديد '. انقر فوق ' دوروا مدير ' > ' إضافة ' > ' قياس '.
- تطبيع عدد الخلايا إيجابية بمجال القسم الأهم من ذلك-
- تحديد رتبة حجم بكسل عن طريق يدوياً تحديد أصغر وأكبر الخلايا سا-β-غال إيجابية.
- الكمي نانوج
- عد الخلايا إيجابية نانوج تحت المجهر في الميدان مشرق يدوياً عند التكبير X 20-
ملاحظة: كونتيرستاينينج حمراء سريعة يسمح التقييم الجيد مورفولوجية العضلات تا. ومع ذلك، تلطيخ خفيف جداً ويفتقر إلى مخطط واضح من المقطع. الماسح الضوئي غالباً ما يفشل لتحديد خط الحدود للمقاطع ولا تركز بشكل صحيح. فمن الممكن استخدام علامة لدائرة حواف المقاطع قبل المسح الضوئي أو استخدام ماسح ضوئي أكثر حساسية للكشف عن المقطع. للبروتوكول الحالي، الأكثر كفاءة عد الخلايا إيجابية نانج يدوياً.
- عد الخلايا إيجابية نانوج تحت المجهر في الميدان مشرق يدوياً عند التكبير X 20-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الكشف عن الشيخوخة الخلوية المستحثة بإصابة العضلات
وقد ثبت مؤخرا أن إصابة العضلات يدفع الشيخوخة الخلوية عابر14. في 10 أيام بعد الإصابة (نقطة في البوصة)، تشهد غالبية ميوفيبيرس التالفة التجدد مع مركزي النوى، سمة مميزة لتجديد ميوفيبيرس، وإعادة تأسيس بنية العضلات. وتنخفض الخلايا التحريضية المتسللة هائلة بينما تبقى مرئية في بعض المناطق. 10 نقطة في البوصة نقطة وقت المناسب للكشف عن خلايا مسن من SA-β-غال، نظراً لوجود خلايا أقل نخرية والتهاب في العضلات للتدخل في تلطيخ. لتحديد خصوصية تلطيخ، تا حقن مع برنامج تلفزيوني من الماوس نفسها (الشكل 1A) كعنصر تحكم سلبية حرجة.
لضمان إجراء تقييم أفضل وأكثر دقة للخلايا إيجابية سا-β-غال، يتم وضع أجزاء من طائرات مختلفة من العضلات تا في نفس الشريحة (الشكل 1B). عداد تلطيخ مع ويوزين مهم للتحديد الكمي التلقائي للخلايا إيجابية سا-β-غال من البرمجيات إيماجيج. تلوين العداد ثم يوجز القسم، الذي يسمح الماسح الرقمي للكشف عن المقاطع مع التركيز الصحيح. من المهم بعناية تحديد النطاق وعتبة الكشف عن (الشكل 2 أ-د). وبالإضافة إلى ذلك، عملية المنسق يدوياً ضروري للسماح لأكثر دقة الكشف والتحديد الكمي (الشكل 2E).
وييسر الشيخوخة الخلوية في فيفو إعادة برمجة في العضلات
يوفر طراز الماوس ريبروجرامابل (i4F) نظام مثالي لتقييم تأثير الشيخوخة على اللدونة الخلوية والتجدد. عند إصابة في العضلات، تعامل فئران i4F مع دوكس للحث على إعادة برمجة في فيفو. 7 أيام من المعالجة دوكس (1 ملغ/مل) غير كافية للحث على إعادة برمجة على المستوى الخلوي، في حين لا يزال يجري جيد التحمل من الفئران (الشكل 3A). ولذلك، نحن حصاد عضلات المصاب في دبس 10 من الفئران i4F تعامل مع دوكس لمدة 7 أيام.
على الرغم من أنه من الممكن لأداء المشترك المصبوغة من SA-β-غال مع نانج، لا ينصح للقياس الكمي بسبب التدخل المحتملة المصبوغة. وكما ذكر أعلاه، تلطيخ العداد ضروري للكشف عن الماسح الرقمي. العداد أفضل تلوين سا-β-غال جنبا إلى جنب مع نانج أورهيماتوكسيلين حمراء سريعة. ومع ذلك، قد قناع تلطيخ العداد عبر إشارة سا-β-غال أو نانج. ولذلك، لتقدير أكثر دقة، فمن الأفضل القيام بها بشكل منفصل على شرائح متتالية (الشكل 3B). بقياس إيجابية سا-β-غال ونانوج الخلايا إيجابية من الشرائح المجاورة، قمنا بإنشاء ارتباط إيجابي بين لهم (الشكل 3)، مما يوحي احتمال اشتراك للشيخوخة الخلوية اللدونة والتجدد.
رقم 1: تقييم مستوى الشيخوخة بعد إصابة في العضلات. (أ) التمثيل التخطيطي استراتيجية إصابة العضلات المستخدمة للحث على الشيخوخة. (ب) التمثيل التخطيطي لإعداد القسم العضلات. (ج) صور الممثل لتلطيخ كونتيرستاينيد مع ويوزين SAβGal. الأسهم تشير إلى الخلايا سا-β-غال+ . تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. (د) القياس الكمي سا-β-غال+ الخلايا في العضلات تا المصابين وغير المضرورة. يتوافق مع كل نقطة لحيوان فردية. قيمت دلالة إحصائية قبل يومين الذيل Student´s الاختبار t: * * * ف < 0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: القياس الكمي للخلايا سا-β-غال+ ببرامج إيماجيج. لقطات الشاشة (أ-د) من قسم العضلات في واجهة البرنامج إيماجيج. لقطة شاشة لتحويل صورة قسم العضلات الرمادي النطاق (A)؛ تحديد جميع SA-β-غال + الخلايا في الجزء (ب)؛ تحليل الجزيئات المحددة (ج)؛ ملخص لجميع بارتيكالس الأصوات التي تم فرزها في إدارة العائد على الاستثمار (د). (ﻫ) شاشة بالرصاص عملية curation اليدوي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تقييم في فيفو إعادة برمجة بعد إصابة في العضلات. (أ) التمثيل التخطيطي لتقييم في فيفو إعادة برمجة والشيخوخة المستوى بعد إصابة في العضلات. (ب) صور الممثل سا-β-غال وتلطيخ نانوج على الأجزاء المجمدة للهيكل العظمى والعضلات التالفة. SAβGal تلطيخ كونتيرستاينيد مع ويوزين (لليسار)؛ المناعي تلطيخ من نانوج كونتيرستاينيد حمراء سريعة (يمين). تظهر عدم إصابة العضلات في عضلة أعلى والجرحى أدناه. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. (ج) القياس الكمي وترابط سا-β-غال + وخلايا نانوج+ في مقاطع متتالية (n = 9 الفئران، تمثل قيمة متوسط المقاطع 2 للماوس). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| حجم 50 مل | |
| الحل6 K3Fe(CN) الأسهم 100 مم | 2 مل |
| الأسهم 100 مم ك4Fe(CN)6 الحل | 2 مل |
| مجكل م 12 | 100 ميكروليتر |
| 50 ملغ/مل س غال | 400 ميكروليتر |
| برنامج تلفزيوني (pH 5.5) | مل 45.50 |
الجدول 1: تكوين 50 مل الحل X-غال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحن نقدم وسيلة للكشف عن كل مسن والخلايا الجذعية pluripotent في العضلات الهيكلية من الفئران ريبروجرامابل. يمكن استخدام هذا الأسلوب تقييم وتقدير كلا الشيخوخة وحمل اللدونة الخلوية في فيفو، ودراسة دور الشيخوخة في إصلاح الأنسجة وتجديدها.
في البروتوكول الحالي، يتم استخدام التحليل المرتبطة بالشيخوخة β-جالاكتوسيداسي (SA-β-غال) للكشف عن خلايا مسن في فيفو في العضلات الهيكلية. هذا التحليل بالكشف عن نشاط زيادة الليزوزومية β-جالاكتوسيداسي على درجة الحموضة سوبوبتيموم (6.0 أو 5.5)، المرتبطة على وجه التحديد خلايا مسن، بينما يتم قياس نشاط هذا الإنزيم عادة في حمضية pH 4.516،17. ولذلك، من المهم لضبط درجة الحموضة (pH = 6 أو 5.5) لضمان كشف محددة من الأنشطة المرتبطة بالشيخوخة. وباﻹضافة إلى ذلك، العداد تلطيخ مع ويوزين ضروري للتحديد الكمي التلقائي للخلايا سا-β-غال+ ، حيث لا تحسب إشارات ضعيفة ومنتشر. لتجنب التقلبات المحتملة، من الأفضل أن الشخص نفسه الذي ينفذ الإجراء الفرز بأكمله.
على الرغم من أن الفحص سا-β-غال الأكثر المستخدمة على نطاق واسع وقبول العلامات البيولوجية للخلايا مسن، أنها ليست علامة حصرية للشيخوخة. وقد اقترح أن الخلايا روافد الإفراط في الثقافة قد يسبب الإيجابية الكاذبة سا-β-غال18. حساسية التحليل يمكن أن يكون نوع من الخلايا والأنسجة اكتب تعتمد في فيفو19. ولذلك، من الضروري استخدام علامات متعارف عليه مستقلة أخرى، مثل عدم الانتشار وزيادة التعبير عن الوسطاء الشيخوخة (p16، والمنتدى الإقليمي للاسيان، p53، p21، و p27)، وإفراز عوامل ساسب مختلفة، لزيادة تأكيد وتميز الشيخوخة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، لا غنى عنها لتفسير النتائج، خاصة بالنسبة للدراسة في فيفو الضوابط السلبية المناسبة.
على الرغم من حقيقة أن المقايسة سا-β-غال ليست مثالية، أنها توفر معلومات قيمة خاصة للدراسة في فيفو . فهو يسمح الكشف عن الخلايا مسن في بيئتهم المقيمين مع هندسة الأنسجة سليمة، توفير المعلومات الحاسمة تيسير زيادة فهم دور الخلايا مسن في مختلف الفسيولوجية والمرضية سياقات. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أن يقترن ذلك إيمونوستينينج علامات أخرى، مثل علامات سطح الخلية لتحديد هوية الخلوية للخلايا مسن؛ أو علامات ستيمنيس لدراسة احتمال اشتراك للشيخوخة في التجدد وتوموريجينيسيس. سابقا، أجرينا المقايسة سا-β-غال مع المناعي تلطيخ من نانج في نفس القسم أو على مقربة من التحقيق في العلاقة المحتملة بين الشيخوخة و في فيفو إعادة برمجة8. بينما يركز هذا البروتوكول على الهيكل العظمى والعضلات، فإنه يمكن التأكيد تمديد للأنسجة الأخرى.
في الآونة الأخيرة، قد تورط الشيخوخة الخلوية في إصلاح الأنسجة وتجديدها، على الأرجح عبر وفقا7،،من89. فهم آليات كيفية الشيخوخة يسهم في إصلاح الأنسجة وتجديدها سيتم التأكيد بأثر هائل على الطب التجديدي. هذا الفحص يوفر أداة هامة وقيمة لتيسير تحديد والتحديد الكمي مسن الخلايا في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونحن مدينون إلى سيمبير كليمر لها الدعم التقني الممتاز. تم تمويل العمل في مختبر H.L. من معهد باستور، "المركز الوطني" "البحوث العلمية"، وفي الوكالة الوطنية للبحث (مختبر d'Excellence أحياء، دعفينير Investissement؛ ANR-10-LABX-73)، الوكالة الوطنية للبحث (ANR-16-CE13-0017-01) ومؤسسة قوس (بيا 20161205028). جيم وميلان تمول بدرجة الدكتوراه وزمالات ما بعد الدكتوراه من "الكونسورتيوم أحياء".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | For SA-β Gal staining solution |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | For SA-β Gal staining solution |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | For SA-β Gal staining solution |
| X-Gal | Sigma | B4252 | For SA-β Gal staining solution |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | For inducing in vivo reprogramming |
| Cardiotoxin | Lotaxan Valence, France | L8102 | For muscle injury |
| Glutaraldehyde | Sigma | 111-30-8 | For Fixation solution |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy science | 50-980-487 | For Fixation solution |
| NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre |
Sigma | 18996-35-5 | For permeabilization solution |
| Triton | Sigma | 93443 | For permeabilization solution |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | Washing solution |
| Antibody anti- Nanog | Cell signalling | 8822S | Rabbit monoclonal antibody |
| EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) | Dako | K4010 | For Nanog revelation |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Counterstainning |
| Fast red | Vector Laboratories | H-3403 | Counterstainning |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Mounting solution |
| Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Mounting solution |
| Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives | Olympus | CKX41 | Microscope for Nanog quantification |
| Mouse: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Reprogrammable mouse model |
| Skeletal muscle, Tibialis Anterior | |||
| Slide Scanner | Zeiss | Axio Scan Z1 | slides scanning |
References
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
- Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
- Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
- Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
- Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
- Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
- Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
- Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence? Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
- Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).
