Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en In Vivo herprogrammering in de skeletspieren

Published: October 26, 2017 doi: 10.3791/56201
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cellular Plasticity & Disease Modelling, Department of Developmental & Stem Cell Biology, CNRS UMR 3738, Institut Pasteur

Summary

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol bij het detecteren van zowel verouderend en pluripotente stamcellen in de skeletspieren op letsel tijdens het inducerende in vivo herprogrammering. Deze methode is geschikt voor de evaluatie van de rol van cellulaire senescentie tijdens Weefselregeneratie en herprogrammering in vivo.

Abstract

Cellulaire senescentie is een stress-respons die wordt gekenmerkt door de arrestatie van een stabiele cellulaire groei, die belangrijk is voor veel fysiologische en pathologische processen, zoals kanker en veroudering. Senescentie heeft onlangs ook betrokken bij weefselherstel en regeneratie. Dus, het is geworden steeds kritischer te identificeren verouderend cellen in vivo. Senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) assay is de meest gebruikte bepaling te detecteren verouderend cellen zowel in cultuur en in vivo. Deze test is gebaseerd op de verhoogde lysosomale inhoud in de verouderend cellen, waardoor de histochemische detectie van lysosomale β-galactosidase-activiteit bij een suboptimale pH (6 of 5.5). In vergelijking met andere testen, zoals de stroom cytometry, hierdoor is de identificatie van verouderend cellen in hun verblijfplaats omgeving, die waardevolle informatie zoals de locatie met betrekking tot de architectuur van weefsel, de morfologie, biedt en de mogelijkheid tot koppeling met andere markeringen via immunohistochemistry (IHC). De grote beperking van de bepaling van de SA-β-Gal is de vereiste van vers of bevroren monsters.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om te begrijpen hoe cellulaire senescentie bevordert cellulaire plasticiteit en weefsels regeneratie in vivo. We SA-β-Gal gebruiken voor het detecteren van verouderend cellen in de skeletspieren van verwonding, dat een gevestigde systeem is te bestuderen van weefselregeneratie. Bovendien gebruiken we IHC voor het detecteren van Nanog, een marker van pluripotente stamcellen, in een transgeen muismodel. Dit protocol laat ons toe om te onderzoeken en kwantificeren van cellulaire senescentie in het kader van geïnduceerde cellulaire plasticiteit en in vivo herprogrammering.

Introduction

Cellulaire senescentie is een vorm van stressrespons gekenmerkt door een stabiel celcyclus arrestatie. In het laatste decennium, heeft onderzoek verankerd dat senescentie geassocieerd met verschillende biologische en pathologische processen wordt, met inbegrip van de embryonale ontwikkeling, fibrose en organisme vergrijzing van1,2. Cellulaire senescentie werd voor het eerst geïdentificeerd in menselijke fibroblasten aan het einde van hun Dr. levensduur getriggerd door telomere verkorting van3. Naast Dr. stress zijn er vele andere stimuli die senescentie induceren kunnen, met inbegrip van DNA schade, oxidatieve stress oncogene signalen en genomische/epigenomic wijzigingen, die kan uiteindelijk het p53/p21 en/of pRB emissieroutes naar de activeren vaststellen en versterken van de permanente groei arrestatie1. Een van de belangrijke kenmerken van verouderend cellen is dat ze metabolisch actief blijven en krachtig express een senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP): afscheiding van vele inflammatoire cytokines, groeifactoren en extracellulaire matrix factoren4. SASP factoren een belangrijke rol in het bemiddelen en versterken het senescentie effect, als gevolg van hun krachtige effecten op het aantrekken van immuuncellen en wijzigen van lokale en systemische weefsel milieus1voorgesteld. Interessant, heeft senescentie onlangs voorgesteld als belangrijk weefsel reparatie en regeneratie5,6. Gegevens uit verschillende labs, met inbegrip van ons, heeft bovendien voorgesteld dat weefsel schade-geïnduceerde senescentie cellulaire plasticiteit, via SASPs, ter bevordering van de regeneratie7-9zou kunnen verbeteren. Daarom, alle opkomende gegevens benadruk het belang van het bestuderen van senescentie in vivo.

In de post geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) tijdperk is cellulaire plasticiteit de capaciteit van een cel om een nieuwe identiteit te verwerven en te nemen een alternatieve lot wanneer blootgesteld aan verschillende stimuli, beide in cultuur en in vivo10. Het is bekend dat volledige herprogrammering bereikt in vivo11,12 worden kan, waar de uitdrukking van de de cassette met vier Yamanaka factoren: Oct4, Sox2, Klf4en c-Myc (OSKM) kunnen geïnduceerde in vivo ter bevordering van de vorming van de teratomas in meerdere organen. Daarom kan een Herprogrammeerbare muismodel (i4F) worden gebruikt als een krachtig systeem om kritische toezichthouders en trajecten die belangrijk voor cellulaire plasticiteit11 zijnte identificeren.

Een geschikt en gevoelige in vivo systeem is essentieel om te begrijpen hoe cellulaire senescentie regelt cellulaire plasticiteit in het kader van weefselregeneratie. Wij presenteren hier een robuust systeem en een gedetailleerd protocol bij het evalueren van het verband tussen senescentie en cellulaire plasticiteit in het kader van weefselregeneratie. De combinatie van cardiotoxin (CTX) geïnduceerde spier schade in de Tibialis Anterior (TA) spiergroep, een gevestigde systeem te bestuderen Weefselregeneratie en de muismodel van i4F, kan de detectie van cellulaire senescentie zowel in vivo herprogrammering tijdens regeneratie van de spier.

Om te beoordelen van het verband tussen cellulaire plasticiteit en senescentie, zijn i4F muizen gewonden met CTX voor het opwekken van acute spier schade en behandeld met doxycycline (0,2 mg/mL) meer dan 7 dagen voor het opwekken van in vivo herprogrammering. Terwijl een CTX acute spier schade geïnduceerde en regeneratie protocol heeft onlangs gepubliceerde13, om ethische redenen, zal deze procedure in het huidige protocol worden weggelaten. TA spier monsters zal worden genomen op 10 dagen post letsel13, wanneer het hoogtepunt van verouderend cellen zijn eerder waargenomen14. Dit gedetailleerde protocol beschrijft hier, alle vereiste stappen voor het evalueren van het niveau van senescentie (via SA-β-Gal) en herprogrammering (via IHC kleuring voor Nanog).

Senescentie-geassocieerde beta-galactosidase (SA-β-Gal) assay is de meest gebruikte test voor de opsporing van beide verouderend cellen in cultuur en in vivo15. Vergeleken met andere testen, maakt de SA-β-Gal-bepaling de identificatie van de verouderend cellen in hun eigen omgeving met intact weefsel architectuur, die vooral belangrijk voor in vivo onderzoek is. Bovendien is het mogelijk om alleen de SA-β-Gal-assay met andere markeringen met behulp van IHC. Echter, de SA-β-Gal assay hoeft vers of bevroren monsters, die nog steeds een belangrijke beperking. Wanneer vers of bevroren weefsels routinematig beschikbaar, zoals bevroren TA spier monsters zijn, is SA-β-Gal uiteraard de meest geschikte test te detecteren verouderend cellen. NANOG is de markering gebruikt om te ontdekken van reprogramed cellen om twee redenen: 1) het is een fundamentele marker voor pluripotent; 2) nog belangrijker, de expressie wordt niet gedreven door doxycycline (dox), dus het detecteert geïnduceerde pluripotent in plaats van de gedwongen expressie van de Yamanaka cassette.

Het is belangrijk op te merken, de kleuring protocollen gepresenteerd in deze studie kunnen afzonderlijk worden uitgevoerd om de kwantificering procedure te vereenvoudigen, maar kunnen ook worden gedaan in een mede kleuring procedure te visualiseren beide verouderend en pluripotente stamcellen op dezelfde sectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

dieren werden behandeld volgens de richtsnoeren van de Europese Gemeenschap en de ethische commissie van het Institut Pasteur (CETEA) goedgekeurde protocollen.

1. voorbereiding van de voorraad-oplossingen

  1. bereiden de materialen voor fixatie van de steekproef van de spier. Los 0,5 g Tragacanthgom met 20 mL water op RT om het bevriezing-insluiting medium voor spier fixatie.
  2. Bereiden van de oplossingen voor de SA-β-Gal kleuring.
    1. Bereiden de voorraadoplossingen van K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), MgCl 2 (1 M) door het oplossen van de respectieve poeders in gedestilleerd water.
    2. De stockoplossing van 0,2% C 20 H 6 Br 4 Na 2 O 5 (eosine) door het verdunnen in water bereiden.
    3. Bereiden de stockoplossing van C 14 H 15 BrClNO 6 (X-gal) (50 mg/mL) door de ontbinding van het poeder van de X-gal in C 3 H 7 geen (dimethylformamide, DMF).
    4. Winkel K 3 Fe(CN) 6 en K 4 Fe(CN) 6 oplossingen bij 4 ° C, en MgCl 2 op RT.
      Opmerking: X-gal kan worden opgeslagen in aliquot deel bij-20 ° C, maximaal 6 maanden. Eosine oplossing kan worden bewaard bij RT en hergebruikt na filtering indien nodig. K 3 Fe(CN) 6 en K 4 Fe(CN) 6 oplossingen zijn protectedfromthe licht. X-gal oplossing is niet stabiel in water en moet worden beschermd tegen licht.
  3. Voorbereiding van de oplossingen voor Nanog kleuring: de permeabilization oplossing bevat 0,1% Na 3 C 6 H 5 O 7 (Trinatriumcitraat citraat), 0,1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton X-100) in gedestilleerd water, die moeten worden bewaard bij 4 ° C. bereid de blokkerende oplossing met 5% foetale runderserum (FBS) in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), die moet worden opgeslagen op de RT.

2. SA-β-Gal Staining op bevroren TA spier sectie

  1. bereiden de fixatie materiaal voor de TA-spier door het plaatsen van een kleine hoeveelheid van de tragacanth tandvlees op een schijfje van cork.
  2. Injured muizen van beide geslachten (2 maanden oud, C57/B6) raakten gewond 10 dagen vóór de met cardiotoxin (CDX) zoals eerder beschreven 13. Gebruik niet-gewond (PBS injectie) TA van de dezelfde muis als de negatieve controle. Desgewenst in vivo herprogrammering is behandelen elke muis met Dox (1 mg/mL) in het drinkwater op dezelfde dag (beschermd tegen het licht), direct na CTX letsel.
    Opmerking: De Dox oplossing dient te worden gewijzigd om de 3 dagen een totale behandeling gedurende 7 dagen.
    1. Isoleren zowel TA spieren (gewond en controle) van muizen zoals eerder is beschreven ( figuur 1A) 13. Te waarborgen de dwarse secties, de distale pees van de spier TA invoegen de Tragacanthgom en laat ongeveer ¾ deel van de spier buiten ( figuur 1B) bevriezen in vloeibare stikstof rechtstreeks gekoeld tolueen voor < 1 min.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de TA spier in een loodrechte positie en in het midden van de kurk. Monsters kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C, of direct cryosectioned in secties van 10 µm.
  3. De TA spieren verwerken zoals beschreven in de figuur 1B.
    1. Verdelen de 1 st -10 th secties in de juiste volgorde in tien verschillende dia's op de linksboven positie van elke dia. Plaats de 11 th sectie grenzend aan de 1 st-sectie op de eerste dia; de 12 th sectie zal volgen dezelfde volgorde rechts naast de 2 nd-sectie op de tweede dia worden geplaatst. Herhaal dit proces tot 10 secties/dia worden verkregen voor tien dia's (100 afdelingen in totaal) om ervoor te zorgen van minimaal 1 mm afstand tussen de eerste en de laatste sectie.
  4. Fix de secties voor 4 min in PBS met 1% paraformaldehyde en 0,2% Glutaaraldehyde. Wassen met PBS, 2 x 10 min. Volgende, Incubeer de secties in PBS (pH = 5.5) voor 30 min. het uitvoeren van alle stappen op RT.
    Opmerking: De fixatie moet worden mild te handhaven enzymatische activiteit. Voer deze stap onder de motorkap. De pH van de PBS is kritisch en de X-gal oplossing moet worden beschermd tegen licht.
  5. Incubate secties in de X-gal oplossing, bevattende: 4 mM K3Fe(CN) 6, 4 mM K4Fe(CN) 6, 2 mM MgCl2 en 400 µg/mL X-Gal in PBS, pH = 5.5. Incubeer in het donker bij 37 ° C gedurende ten minste 24 h. Wash de dia's met PBS, 3 x 10 min., op RT.
    Opmerking: De incubatie vereist een minimum van 24 uur en 48 uur om te maximaliseren van het signaal van de SA-β-Gal kan duren. De oplossing dient te worden gewijzigd na 24 uur incubatie. De dia's moeten worden beschermd tegen licht. Als alleen SA-β-Gal kleuring wordt gewenst, ga verder met stap 2.5. Als mede met Nanog kleuring wordt gewenst, gelieve vooruit naar stap 3.1.
  6. Fix dia's in 1% paraformaldehyde in PBS voor 30 min. Wash dia's met PBS, 3 x 10 min. Counterstain met 0,2% eosine. Onderdompelen van de dia's in de oplossing van eosine voor 1 minuut en spoel ze kort met gedestilleerd water. Tot slot, monteren de dia's met waterige niet-fluorescerende montage medium (Zie Tabel of Materials).
    Opmerking: Het is essentieel voor het uitvoeren van de na fixatie. Voer deze stap onder de motorkap. Alle stappen worden uitgevoerd op RT.

3. Immunohistochemistry met behulp van Anti-Nanog antilichaam

  1. herstellen van de dia's met PBS met 4% paraformaldehyde voor 10 min. wassen met PBS, 2 x 10 min. toevoegen 200 µL van de permeabilization oplossing direct op de dia's en incubeer gedurende 5 min.
    1. -Wash glijbanen met PBS, 2 x 5 min en in de laatste wasbeurt, gebruik 200 µL PBS met 0,25% BSA rechtstreeks op de dia's. Uitvoeren van al deze stappen op RT.
      Let op: Voer de fixatie stap onder de motorkap.
  2. Incubate dia's met de primaire anti-Nanog antilichaam (eindconcentratie: 1,25 mg/mL) overnachting bij 4 ° C in PBS met 5% FBS. Dia's met PBS, 2 x 10 min wassen en in de laatste wasbeurt, gebruik 200 µL PBS met 0,25% BSA voor 5 min. uitvoeren alle het wassen stappen bij RT.
    Opmerking: Dia's in een doos met natte papieren handdoek om te voorkomen dat verdamping Incubeer.
  3. Incubate dia's met 100 µL van rAb-HRP secundair antilichaam uit een gebruiksklare kit (Zie Tabel of Materials) voor 45 min. Wash om dia's met PBS, 3 x 5 min, verwijderen van secundair antilichaam. Uitvoeren van alle stappen op RT met bescherming tegen licht.
  4. Visualisatie
    1. eerste, Verdun de 3,3 '-diaminobenzidine (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), schar) in de buffer van het substraat geboden door de gebruiksklare kit (20 µL van DAB voor 1 mL van de bufferoplossing substraat). Voeg 100 µL van DAB oplossing direct op elke dia en incubeer gedurende maximaal 10 min op RT.
      Opmerking: De verdunde oplossing DAB moet vers worden bereid en kan worden opgeslagen voor tot een week bij 4 ° C. De incubatietijd kan worden aangepast om te minimaliseren van het signaal van de achtergrond, maar moet hetzelfde zijn voor alle dia's.
    2. Verwijderen de DAB-oplossing door te spoelen met water. Counterstain de dia's met snel rode oplossing (klaar om te gebruiken, raadpleegt u de Tabel of Materials) voor 20 min. Wash de dia's met water nogmaals kort.
    3. Uitdrogen hen met 95% ethanol voor 5 min gevolgd door 100% ethanol, 2 x 5 min. Tot slot, monteren de dia's met een snel uithardend montage medium (Zie Tabel of Materials).
    4. Observeren de dia's onder de Microscoop in helder veld 20 X te vermijden achtergrond.
      Opmerking: Snel rode oplossing kan worden bewaard bij RT en hergebruikt na filtering.

4. Analyse en kwantificering

  1. SA-β-Gal kwantificering
    1. scannen van dia's en kies de beste gedeelten op elke dia op basis van de verworven beelden. Gebruik minstens 2 secties/TA voor de kwantificering. Beoordelen van de sectie ' s kwaliteit op basis van weefsel integriteit, kwaliteit van de kleuring en counterstaining. Kies voor de kwantificering, de twee hoogste kwaliteit secties met de maximaal mogelijke afstand tussen monsters, waarmee een betere vertegenwoordiging van SA-β-Gal kwantificering gedurende de hele TA spier.
    2. Kwantificering van SA-β-Gal positieve cellen ( Figuur 2).
      1. Bepalen de rang van de pixelgrootte door handmatig de kleinste en de grootste positieve SA-β-Gal cellen te selecteren.
        1. Open de digitale afbeelding van de gescande dia ImageJ softwarematig.
        2. In de interface, klikt u op ' analyseren ' > ' Tools ' > ' ROI Manager ' > ' analyseren ' > ' meting instellen ' > ' Selecteer gebied '. Gebruik het gereedschap selecteren en omringen de kleinste en grootste positieve SA-β-Gal cel en toevoegen aan de ROI-manager door te klikken op ' toevoegen '. Meet de maten met behulp van de ' maatregel ' knop en de waarden voor later gebruik opslaan.
      2. Aanpassen van de parameter van de drempel om ervoor te zorgen dat alle zichtbare positieve cellen zijn geselecteerd.
        1. Zet de afbeelding om grijstinten door te klikken op ' Image ' > ' type ' > ' 8-bits ' ( figuur 2A). Ga vervolgens naar ' Image ' > ' aanpassen ' > ' drempel ', de tweede cursor totdat alle positieve SA-β-Gal cellen zijn bedekt met rood ( figuur 2B), en klik vervolgens ' toepassen '.
        2. Analyseren deeltjes door te klikken op ' analyseren ' > ' analyseren deeltjes ' > ' grootte (pixel ^ 2) ', en de waarde die is gedefinieerd in stap 4.1.2.1 toepassen, voert u ' cirkelvormigheid ': ' 0.00-1.00 ', klik op ' ok '; een samenvatting van alles wat de getelde deeltjes wordt weergegeven in de ROI-manager ( figuur 2D).
      3. Transfer van alle geselecteerde deeltjes naar de oorspronkelijke afbeelding. Pas de selectie handmatig om ervoor te zorgen nauwkeurige kwantificering. Toevoegen van positieve cellen (groene pijl, 2E figuur) en/of verwijderen van valse positieve cellen (rode pijl, 2E figuur). Ten slotte meten het gebied waarin de sectie ( figuur 2D) met behulp van de ' gereedschap selecteren '. Klik op ' ROI manager ' > ' toevoegen ' > ' maat '.
      4. Nog belangrijker is, het aantal positieve cellen door het gebied van de sectie normaliseren.
  2. Nanog kwantificering
    1. Nanog positieve cellen onder de Microscoop in het heldere veld handmatig 20 X vergroting tellen.
      Opmerking: Het snel rode counterstaining maakt het mogelijk goede evaluatie van de morfologie van de TA spier. De kleuring is echter zeer licht en ontbreekt een duidelijke schets van de sectie. De scanner vaak niet identificeren van de grens van de secties en niet goed kan concentreren. Het is mogelijk om te gebruiken markering aan de randen van de secties cirkel voordat u gaat scannen of gebruiken van een gevoeliger scanner voor het detecteren van de sectie. Voor het huidige protocol, is het meest efficiënt om de Nanog positieve cellen handmatig tellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Opsporen van spier letsel-geïnduceerde cellulaire senescentie

Het heeft onlangs aangetoond dat spier letsel voorbijgaande cellulaire senescentie14 induceert. Op 10 dagen na letsel (DPI), de meerderheid van de beschadigde myofibers ondergaan regeneratie met de centraal gelegen kernen, een kenmerk van het regenereren van de myofibers, en de architectuur van de spier is hersteld. De infiltrating ontstekingscellen worden dramatisch verlaagd terwijl de resterende zichtbaar in bepaalde regio's. 10 DPI is een goed tijdstip om te detecteren verouderend cellen door SA-β-Gal, aangezien er minder necrotische en inflammatoire cellen die aanwezig zijn in de spier te bemoeien met de kleuring. Om te bepalen de specificiteit van de kleuring, wordt TA geïnjecteerd met PBS uit de dezelfde muis (figuur 1A) gebruikt als een kritische negatieve controle.

Om te zorgen voor een betere en meer nauwkeurige evaluatie van de SA-β-Gal positieve cellen, worden secties uit verschillende vlakken van de TA spier geplaatst in dezelfde dia (figuur 1B). Teller kleuring met eosine is belangrijk voor de automatische kwantificering van de SA-β-Gal positieve cellen door ImageJ software. Eosine teller kleuring schetst de sectie waarmee de digitale scanner te sporen van de secties met de juiste focus. Het is belangrijk om zorgvuldig definiëren het bereik en de drempel van de detectie (figuur 2A-D). Daarnaast is een handmatig curator proces essentieel voor het toestaan van meer nauwkeurige detectie en kwantificering (figuur 2E).

Cellulaire senescentie vergemakkelijkt in vivo herprogrammering in spier

Herprogrammeerbare muismodel (i4F) biedt een ideaal systeem om te evalueren van het effect van senescentie op cellulaire plasticiteit en regeneratie. Bij spier letsel, worden i4F muizen behandeld met dox ertoe herprogrammering in vivo. 7 dagen dox (1 mg/mL) behandeling is voldoende voor het opwekken van herprogrammering op cellulair niveau, terwijl nog steeds wordt goed verdragen door muizen (figuur 3A). We oogsten derhalve geblesseerde spieren aan 10 aanmeldingsgebruikersinterface van i4F muizen gedurende 7 dagen behandeld met dox.

Hoewel het mogelijk is om uit te voeren samen kleuring van SA-β-Gal met Nanog, is het niet aanbevolen voor kwantificering toe te schrijven aan de potentiële inmenging kleuring. Zoals hierboven vermeld, is teller kleuring essentieel voor de detectie van de digitale scanner. De beste teller kleuring voor de SA-β-Gal samen met Nanog is snel rode orhematoxylin. Echter kan teller kleuring maskeren over de SA-β-Gal of Nanog signaal. Daarom, voor meer accurate kwantificering is het beter om ze afzonderlijk uitvoeren op opeenvolgende dia's (figuur 3B). Door het kwantificeren van de SA-β-Gal positief en Nanog positieve cellen uit aangrenzende dia's, opgericht wij een positieve correlatie tussen hen (Figuur 3 c), hetgeen wijst op een mogelijke betrokkenheid van senescentie op cellulaire plasticiteit en regeneratie.

Figure 1
Figuur 1: senescentie niveau te evalueren na spier blessure. (A) schematische weergave van de spier letsel strategie gebruikt voor het opwekken van senescentie. (B) schematische weergave van de spier sectie voorbereiding. (C) representatieve beelden van SAβGal counterstained met eosine kleuring. Pijlen wijzen naar de cellen van de SA-β-Gal+ . Schaal bars = 50 µm. (D) kwantificering van SA-β-Gal+ cellen in gewonden en niet-verwonde TA-spier. Elke stip correspondeert met een bepaald dier. Statistische significantie werd beoordeeld door de tweezijdige Student´s t-toets: *** p < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Kwantificering van SA-β-Gal+ cellen door ImageJ software. (A-D) het schermschoten van een spier-sectie in de ImageJ software-interface. Screenshot van het omzetten van een spier sectie afbeelding grijze schaal (A); Selecteren van alle de SA-β-Gal + cellen in de sectie (B); Analyseren van de geselecteerde deeltjes (C); Samenvatting van alle getelde particals in de ROI-manager (D). (E) schermafdruk van de handmatige curatie proces. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Evaluatie van het in vivo herprogrammering na spier blessure. (A) schematische weergave te evalueren in vivo herprogrammering en senescentie niveau na spier blessure. (B) representatieve beelden van SA-β-Gal en Nanog vlekken op bevroren secties van de beschadigde skeletspieren. SAβGal counterstained kleuring met eosine (links); Immunohistochemische kleuring van Nanog counterstained met snel rode (rechts). Non-verwonde spieren worden getoond op de boven- en de geblesseerde spier hieronder. Schaal bars = 50 µm. (C) kwantificering en correlatie van SA-β-Gal + en Nanog+ cellen in opeenvolgende secties (n = 9 muizen, waarde vertegenwoordigt het gemiddelde van 2 secties per muis). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Volume van 50 mL
100 mM K3Fe(CN)6 -stockoplossing 2 mL
100 voorraad mM K4Fe(CN)6 oplossing 2 mL
1 M MgCl2 100 ΜL
50 mg/mL X-Gal 400 ΜL
PBS (pH 5.5) 45.50 mL

Tabel 1: Samenstelling van 50 mL X-gal oplossing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier presenteren we een methode voor het detecteren van zowel verouderend en pluripotente stamcellen in de skeletspieren van Herprogrammeerbare muizen. Deze methode kan worden gebruikt om te beoordelen en kwantificeren van beide senescentie induceren cellulaire plasticiteit in vivoen onderzoeken van de rol van senescentie in weefselherstel en regeneratie.

In het huidige protocol, wordt de bepaling senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) gebruikt voor het detecteren van in vivo verouderend cellen in de skeletspieren. Deze test detecteert de verhoogde lysosomale β-galactosidase-activiteit bij een suboptimale pH (5.5 of 6.0) gekoppeld specifiek verouderend cellen, terwijl de activiteit van dit enzym meestal bij zure pH 4,516,17 gemeten wordt. Het is daarom belangrijk om aan te passen van de pH (pH = 6 of 5.5) om een specifieke detectie van senescentie-geassocieerde activiteiten. Daarnaast is teller kleuring met eosine essentieel voor de automatische kwantificering van SA-β-Gal+ cellen, waar de zwakke en diffuse signalen worden niet meegeteld. Om te voorkomen dat potentiële variabiliteit, verdient het de voorkeur dat dezelfde persoon de hele tellen procedure uitvoert.

Hoewel de bepaling van de SA-β-Gal is de meest gebruikt en geaccepteerd biomerker voor verouderend cellen, is het niet een exclusieve marker voor senescentie. Er is gesuggereerd dat overmatige heuvels cellen in cultuur valse positiviteit voor SA-β-Gal18kunnen veroorzaken. De gevoeligheid van de test kan celtype en weefsel Typ afhankelijk in vivo19. Daarom is het nodig om andere onafhankelijke canonieke markers, zoals gebrek aan proliferatie, verhoogde expressie van senescentie bemiddelaars (p16, ARF, p53, p21 en p27) en de afscheiding van verschillende SASP factoren, gebruiken om verder te bevestigen en karakteriseren senescentie in vivo. Bovendien zijn goede negatieve controles onontbeerlijk voor het interpreteren van de resultaten, met name voor in vivo onderzoek.

Ondanks het feit dat SA-β-Gal assay niet is perfect, het levert bijzonder waardevolle informatie voor in vivo onderzoek. Het maakt de detectie van verouderend cellen in hun verblijfplaats omgeving met intact weefsel architectuur, verstrekken van kritische informatie vergemakkelijken het verder begrip van de verouderend cellen rol in verschillende fysiologische en pathologische contexten. Bovendien, het kan gepaard gaan met de immunokleuring van andere markers, zoals de oppervlakte markeringen cel bepalen de cellulaire identiteit van verouderend cellen; of stemness markeringen te onderzoeken van de mogelijke betrokkenheid van senescentie in regeneratie en tumorvorming. We uitgevoerd eerder, de bepaling van de SA-β-Gal met immunohistochemische kleuring van Nanog in dezelfde sectie of in de nabijheid te onderzoeken van het mogelijke verband tussen senescentie en in vivo herprogrammering van8. Terwijl dit protocol is gericht op de skeletspieren, kan het zeker worden uitgebreid naar andere weefsels.

Cellulaire senescentie heeft onlangs betrokken bij weefselherstel en regeneratie, waarschijnlijk via SASPs7,8,9. Inzicht in de mechanismen van hoe senescentie aan weefselherstel en regeneratie bijdraagt zal zeker een enorme impact hebben op de regeneratieve geneeskunde. Deze test is een belangrijk en waardevol instrument ter vergemakkelijking van de identificatie en kwantificering van verouderend cellen in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Wij zijn Clemire Cimper dank verschuldigd voor haar uitstekende technische ondersteuning. Werk in het laboratorium van H.L. werd gefinancierd door het Institut Pasteur, Centre National pour la Recherche wetenschappelijke, en het Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d'Excellence Revive, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-73), de Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) en Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. en A.C. worden gefinancierd door de Ph.D. en postdoctorale beurzen van het Consortium doen herleven.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
K3Fe(CN)6 Sigma 13746-66-2 For SA-β Gal staining solution
K4Fe(CN)6 Sigma 14459-95-1 For SA-β Gal staining solution
MgCl2 Sigma 7786-30-3 For SA-β Gal staining solution
X-Gal Sigma B4252 For SA-β Gal staining solution
Doxycycline Sigma D3447 For inducing in vivo reprogramming
Cardiotoxin Lotaxan Valence, France L8102 For muscle injury
Glutaraldehyde Sigma 111-30-8 For Fixation solution
Paraformaldehyde Electron microscopy science 50-980-487 For Fixation solution
NaCitrate :
Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre		 Sigma 18996-35-5 For permeabilization solution
Triton Sigma 93443 For permeabilization solution
Bovine Serum Albumin Sigma A3608 Washing solution
Antibody anti- Nanog Cell signalling 8822S Rabbit monoclonal antibody
EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) Dako K4010 For Nanog revelation
Eosin 1% Leica 380159EOF Counterstainning
Fast red Vector Laboratories H-3403 Counterstainning
Thermo Scientific Shandon Immu-Mount Fisher scientific 9990402 Mounting solution
Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® Sigma 25608-33-7 Mounting solution
Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives Olympus CKX41 Microscope for Nanog quantification
Mouse: i4F-A Abad et al., 2013 N/A Reprogrammable mouse model
Skeletal muscle, Tibialis Anterior
Slide Scanner Zeiss Axio Scan Z1 slides scanning

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
  2. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  3. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
  4. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  5. Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
  6. Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
  7. Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
  8. Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
  9. Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
  10. Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
  11. Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
  12. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  13. Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
  14. Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  16. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence? Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
  19. Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).

Tags

Ontwikkelingsbiologie kwestie 128 cellulaire senescentie in vivo herprogrammering pluripotente stamcellen Herprogrammeerbare muismodel spier letsel cardiotoxin regeneratie senescentie-geassocieerde β-galactosidase kleuring
Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en <em>In Vivo</em> herprogrammering in de skeletspieren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cazin, C., Chiche, A., Li, H.… More

Cazin, C., Chiche, A., Li, H. Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (128), e56201, doi:10.3791/56201 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter