Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Utvärdering av nervskade-inducerad åldras och In Vivo omprogrammering i skelettmuskulaturen

Published: October 26, 2017 doi: 10.3791/56201
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cellular Plasticity & Disease Modelling, Department of Developmental & Stem Cell Biology, CNRS UMR 3738, Institut Pasteur

Summary

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll att upptäcka både senescent och pluripotenta stamceller i skelettmuskulaturen vid skada samtidigt förmå i vivo omprogrammering. Denna metod är lämplig för att utvärdera rollen av cellulära åldras under vävnadsregenerering och omprogrammering i vivo.

Abstract

Cellulärt åldrande är en stressreaktion som kännetecknas av en stabil cellulära tillväxt gripandet, vilket är viktigt för många fysiologiska och patologiska processer, såsom cancer och åldrande. Nyligen, åldras har också varit inblandad i vävnad reparation och förnyelse. Därför har det blivit alltmer kritisk till identifiera senescent celler i vivo. Åldras-associerade β-galaktosidas (SA-β-Gal) analysen är den vanligaste analysen att upptäcka senescent celler både kultur och i vivo. Denna analys bygger på ökad lysosomala innehållet i senescent cellerna, vilket gör histochemical detektion av lysosomala β-galaktosidas aktivitet vid suboptimum pH (6 eller 5.5). I jämförelse med andra analyser, såsom flödescytometri, Detta tillåter identifiering av senescent celler i deras inhemska miljö, som ger värdefull information såsom platsen avser vävnad arkitekturen, morfologi, och den möjlighet till koppling med andra markörer via immunhistokemi (IHC). Den största begränsningen av SA-β-Gal analysen är kravet på färska eller frysta prover.

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att förstå hur cellulära åldras främjar cellulär plasticitet och vävnad förnyelse i vivo. Vi använder SA-β-Gal för att upptäcka senescent celler i skelettmuskulaturen vid skada, som är ett väl etablerat system att studera vävnadsregeneration. Dessutom använder vi IHC för att upptäcka Nanog, en markör av pluripotenta stamceller, i en transgen musmodell. Detta protokoll gör det möjligt för oss att undersöka och kvantifiera cellulära åldras i samband med inducerad cellulär plasticitet och i vivo omprogrammering.

Introduction

Cellulärt åldrande är en form av stressreaktion som kännetecknas av en stabil cellcykelarrest. Under det senaste decenniet, har forskning etablerat att åldras är associerade med olika biologiska och patologiska processer inklusive embryonal utveckling, fibros och organismen åldrande1,2. Cellulära åldras först identifierades i mänskliga fibroblaster i slutet av sin replikationsförmåga livslängd som utlöses av telomerförkortning3. Förutom replikationsförmåga stress finns det många andra stimuli som kan inducera åldras, inklusive DNA skador, oxidativ stress, onkogena signaler och genomisk/epigenetisk förändringar, något som så småningom kan aktivera p53/p21 eller pRB vägar till upprätta och förstärka den permanent tillväxt gripande1. En av de viktiga egenskaperna hos senescent celler är att de förblir metaboliskt aktiva och kraftfullt uttrycka en åldras-associerade sekretoriska fenotyp (SASP): utsöndring av många inflammatoriska cytokiner, tillväxtfaktorer och extracellulär matrix faktorer4. SASP faktorer har föreslagits att spela en viktig roll i medla och förstärka åldras effekt, på grund av sin potenta effekter på att locka immunceller och förändra lokala och systemiska vävnad FOI1. Intressant, har åldras nyligen föreslagits vara viktigt för vävnad reparation och förnyelse5,6. Data från flera labs, däribland vår, har dessutom föreslagit att vävnad skada-inducerad åldras kan förbättra cellulär plasticitet, via SASPs, att främja regenerering7–9. Därför belysa alla framväxande data vikten av att studera åldras i vivo.

I inlägget inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) eran är cellulär plasticitet en cell förmåga att skaffa sig en ny identitet och att anta en alternativ öde när de utsätts för olika stimuli både i kultur och i vivo10. Det är känt att full omprogrammering kan uppnås i vivo11,12, där uttrycket av den kassett som innehåller fyra Yamanaka faktorer: Oct4, Sox2, Klf4och c-Myc (OSKM) kan vara inducerade i vivo att främja Teratom formation i flera organ. Därför kan kan programmeras om musen modell (i4F) användas som ett kraftfullt system för att identifiera kritiska regulatorer och vägar som är viktiga för cellulär plasticitet11.

En lämplig och känslig i vivo -system är viktigt att förstå hur cellulära åldras reglerar cellulär plasticitet i samband med vävnadsregeneration. Här presenterar vi ett robust system och ett detaljerat protokoll att utvärdera sambandet mellan åldras och cellulär plasticitet i samband med vävnadsregeneration. Den kombination av cardiotoxin (CTX) inducerad muskelskada i gruppen muskeln Tibialis Anterior (TA), ett väl etablerat system att studera vävnadsregenerering och i4F musmodell, tillåter upptäckt av både cellulära åldras och i vivo omprogrammering under muskel regenerering.

För att utvärdera sambandet mellan cellulär plasticitet och åldras, är i4F möss skadade med CTX inducera akuta muskelskador och behandlas med doxycyklin (0,2 mg/mL) under 7 dagar att framkalla i vivo omprogrammering. Medan en CTX inducerad akut muskelskada och regenerering protokoll har varit nyligen publicerad13, av etiska skäl, kommer detta förfarande utelämnas i det nuvarande protokollet. TA muskel prover samlas på 10 dagar post skada13, när toppen av senescent celler har observerats tidigare14. Här, beskriver denna detaljerade protokollet alla steg krävs för att utvärdera den nivå av åldras (via SA-β-Gal) och omprogrammering (via IHC färgning av Nanog).

Åldras-associerade beta-galaktosidas (SA-β-Gal) analysen är den vanligaste analysen att upptäcka senescent celler både i kulturen och i vivo15. Jämfört med andra analyser, möjliggör SA-β-Gal analysen identifiering av de senescent cellerna i deras infödda miljö med intakt vävnad arkitektur, vilket är särskilt viktigt för i vivo studie. Dessutom är det möjligt att par SA-β-Gal analysen med andra markörer med IHC. Dock kräver SA-β-Gal analysen färsk eller fryst prover, som fortfarande är en stor begränsning. När färska eller frysta vävnader finns rutinmässigt, såsom frysta TA muskel prover, är SA-β-Gal uppenbarligen den mest lämpliga analysen att upptäcka senescent celler. Nanog är markören används för att upptäcka reprogramed celler av två skäl: 1) det är en viktig markör för pluripotens; 2) viktigare, dess uttryck drivs inte av doxycyklin (dox), därför den upptäcker inducerade pluripotenta i stället för uttrycket påtvingad av Yamanaka kassetten.

Det är viktigt att Observera att de olika färgprotokollen presenteras i denna studie kan ske separat för att förenkla förfarandet för kvantifiering, men kan också göras i en samtidig färgningsproceduren att visualisera både senescent och pluripotenta stamceller på samma avsnitt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

djur har hanterats enligt Europeiska gemenskapens riktlinjer och etikkommittén Institut Pasteur (CETEA) godkända protokoll.

1. förberedelserna av de lösningar som lager

  1. förbereda material för muskel provet fixering. Lös 0,5 g tragacanth tuggummi med 20 mL vatten på RT att göra frysning-inbäddning medium för muskel fixering.
  2. Förbereda lösningarna för SA-β-Gal färgning.
    1. Förbereda stamlösningar av K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), MgCl 2 (1 M) genom att lösa upp respektive pulver i destillerat vatten.
    2. Förbereda stamlösning av 0,2% C 20 H 6 Br 4 Na 2 O 5 (Eosin) genom att späda ut det i vatten.
    3. Förbereda stamlösning av C 14 H 15 BrClNO 6 (X-gal) (50 mg/mL) genom upplösning av X-gal pulvret i C 3 H 7 ingen (dimetylformamid, DMF).
    4. Store K 3 Fe(CN) 6 och K 4 Fe(CN) 6 lösningar vid 4 ° C, och MgCl 2 på RT.
      Obs: X-gal kan lagras i alikvot vid-20 ° C, upp till 6 månader. Eosin lösning kan förvaras vid RT och återanvändas efter filtrering vid behov. K 3 Fe(CN) 6 och K 4 Fe(CN) 6 lösningar är protectedfromthe ljus. X-gal lösning är inte stabila i vatten och måste skyddas från ljus.
  3. Beredning av lösningar för Nanog färgning: den permeabilisering lösningen innehåller 0,1% Na 3 C 6 H 5 O 7 (Trinatriumcitrat), 0,1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton x-100) i destillerat vatten, som ska förvaras vid 4 ° C. förbereda blockerande lösningen innehållande 5% fetalt bovint serum (FBS) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), som ska förvaras vid RT.

2. SA-β-Gal färgningen på fryst TA muskel avsnitt

  1. förbereda fixering materialet för TA muskel genom att placera en liten mängd av tragacanth tuggummi på en skiva av kork.
  2. Skadade möss av båda könen (2 månad gammal, C57/B6) skadades 10 dagar innan med cardiotoxin (CDX) som tidigare beskrivits 13. Använda icke-skadade (PBS injektion) TA från samma mus som den negativa kontrollen. Önskas i vivo omprogrammering, behandla varje mus med Dox (1 mg/mL) i dricksvattnet samma dag (skyddade från ljus), direkt efter CTX skada.
    Obs: Dox lösningen behöver ändras varje 3 dagar för en total behandlingstid på 7 dagar.
    1. Isolera båda TA muskler (skadade och styra) från möss som tidigare beskrivits ( figur 1A) 13. Att säkerställa de tvärgående avsnitten, infoga distala senan av TA muskeln i tragacanth tandköttet och lämnar ungefär ¾ del av muskeln utanför ( figur 1B) och frysa direkt i flytande kväve kyldes isopentan för < 1 min.
      Obs: Kontrollera TA muskeln är i en vinkelrät position och i mitten av korken. Prover kan lagras vid-80 ° C eller direkt cryosectioned i 10 µm sektioner.
  3. Bearbeta TA musklerna som beskrivs i den figur 1B.
    1. Fördela 1 st -10 th sektioner i rätt ordning på tio olika bilder på den övre vänstra positionen för varje bild. Placera avsnittet 11 th bredvid avsnittet 1 st i den första bilden; avsnittet th 12 kommer att följa samma ordning ska placeras rätt förutom avsnittet 2 nd på den andra bilden. Upprepa denna process tills 10 sektioner/bild erhålls för tio bilder (100 avsnitt totalt) för att säkerställa lägsta 1 mm avstånd mellan det första avsnittet och det sista avsnittet.
  4. Fixa avsnitten för 4 min i PBS med 1% PARAFORMALDEHYD och 0,2% glutaraldehyd. Tvätta med PBS, 2 x 10 min. Nästa, inkubera avsnitten i PBS (pH = 5,5) för 30 min. utföra alla steg på RT.
    Obs: Upptagning måste vara milt att upprätthålla enzymaktivitet. Utför det här steget under huven. PH-värdet i PBS är kritisk och X-gal lösningen måste skyddas från ljus.
  5. Inkubera sektioner i den X-gal lösning innehållande: 4 mM K3Fe(CN) 6, 4 mM K4Fe(CN) 6, 2 mM MgCl2 och 400 µg/mL X-Gal i PBS, pH = 5,5. Inkubera i mörker vid 37 ° C i minst 24 h. Tvätta bilderna med PBS, 3 x 10 min, vid RT.
    Obs: Ruvning kräver minst 24 timmar och kan pågå i 48 timmar för att maximera SA-β-Gal signalen. Lösningen behöver ändras efter 24 timmars inkubation. Bilderna bör skyddas från ljus. Om bara SA-β-Gal färgning önskas, fortsätter du med steg 2.5. Om samtidig färgning med Nanog önskas, vänligen hoppa fram till steg 3.1.
  6. Fixa bilderna i 1% PARAFORMALDEHYD i PBS för 30 min. Tvätta glider med PBS, 3 x 10 min. motfärg med 0,2% eosin. Doppa glasen i eosin lösningen för 1 min och skölj dem med destillerat vatten kort. Slutligen montera bilderna med vattenhaltiga icke fluorescerande monteringsmedium (se Tabell för material).
    Obs: Det är viktigt att utföra efter fixering. Utför det här steget under huven. Alla åtgärder utförs på RT.

3. Immunhistokemi med Anti-Nanog antikropp

  1. fixa bilderna med PBS som innehåller 4% PARAFORMALDEHYD för 10 min. Tvätta med PBS, 2 x 10 min. Tillsätt 200 µL av permeabilisering lösningen direkt på bilderna och inkubera i 5 min.
    1. Tvätta glider med PBS, 2 x 5 min och i den sista tvättningen, Använd 200 µL PBS som innehåller 0,25% BSA direkt på bilderna. Utföra alla dessa steg på RT.
      Försiktighet: Utför fixering steg under huven.
  2. Inkubera bilder med den primära anti-Nanog antikroppen (slutlig koncentration: 1,25 ug/mL) övernattning på 4 ° C i PBS som innehåller 5% FBS. Tvätta diabilder med PBS, 2 x 10 min och i den sista tvättningen, Använd 200 µL PBS som innehåller 0,25% BSA för 5 min. utför alla tvätt kliver på RT.
    Obs: Odling av objektglas i en låda med våt pappershandduk för att förhindra avdunstning.
  3. Inkubera bilder med 100 µL av rAb-HRP sekundär antikropp från en klar att använda kit (se Tabell för material) för 45 min. Tvätta diabilder med PBS, 3 x 5 min, till ta bort sekundära antikroppar. Utföra alla steg på RT med skydd från ljus.
  4. Visualisering
    1. först, späd 3,3 '-Diaminobenzidin (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), DAB) i Substratbufferten som tillhandahålls av klar att använda kit (20 µL av DAB för 1 mL buffert substratlösning). Tillsätt 100 µL av DAB lösning direkt i varje bild och inkubera i 10 min vid RT. maximalt
      Obs: Den utspädda DAB-lösningen bör beredas på nytt och kan lagras i upp till en vecka vid 4 ° C. Inkubationstiden kan justeras för att minimera den bakgrund signalen men måste hållas samma för alla diabilder.
    2. Ta bort DAB lösningen genom att skölja med vatten. Counterstain bilderna med snabbt röd lösning (klar att använda, se Tabell för material) för 20 min. Tvätta bilderna med vatten igen kort.
    3. Torkar dem med 95% etanol för 5 mi följt av 100% etanol, 2 x 5 min. Slutligen montera bilderna med quick-härdning monteringsmedium (se Tabell för material).
    4. Observera glasen under lupp i ljusa fält 20 X att undvika bakgrund.
      Obs: Snabbt röd lösning kan förvaras vid RT och återanvändas efter filtrering.

4. Analys och kvantifiering

  1. SA-β-Gal kvantifiering
    1. Skanna bilderna och välja de bästa avsnitten på varje bild baserat på förvärvade bilderna. Använd minst 2 sektioner/TA för kvantifiering. Domare i avsnittet ' s kvalitet baserat på vävnad integritet, kvalitet av färgning och counterstaining. För kvantifiering, välja de två högsta kvalité avsnitten med största möjliga avstånd mellan prover, som tillåter bättre representation av SA-β-Gal kvantifiering i hela hela TA muskeln.
    2. Kvantifiering av SA-β-Gal positiva celler ( figur 2).
      1. Bestäm rang av pixelstorlek genom att manuellt välja den minsta och de största positiva SA-β-Gal cellerna.
        1. Öppna den digitala bilden av den skannade bilden med ImageJ programvara.
        2. i gränssnittet, klicka på ' analysera ' > ' verktyg ' > ' ROI Manager ' > ' analysera ' > ' ställ mätning ' > ' Välj område '. Använd markeringsverktyget och omger den minsta och största positiva SA-β-Gal cell och lägga till den till ROI manager genom att klicka på ' Lägg till '. Mäta de storlekar som använder den ' åtgärd ' knappen och spara värdena för senare användning.
      2. Justera parametern tröskeln för att säkerställa att alla synliga positiva celler är markerade.
        1. Konvertera bilden till gråskala genom att klicka på ' bild ' > ' typ ' > ' 8-bitars ' ( figur 2A). Nästa, gå till ' bild ' > ' justera ' > ' tröskel ', flytta den andra markören tills alla positiva SA-β-Gal celler omfattas i rött ( figur 2B) och sedan på ' Använd '.
        2. Analysera partiklar genom att klicka ' analysera ' > ' analysera partiklar ' > ' storlek (pixel ^ 2) ', och tillämpa värdet som definieras i steg 4.1.2.1, ange ' loopkontroll ': ' 0,00-1,00 ', klicka på ' ok '; en sammanfattning av alla de räknade partiklar visas i ROI manager ( figur 2D).
      3. Överföra alla valda partiklar till den ursprungliga bilden. Justera markeringen manuellt för att säkerställa korrekt kvantifiering. Lägga till positiva celler (grön pil, figur 2E) och/eller ta bort falska positiva celler (röd pil, figur 2E). Slutligen, mäta området av beskriver den avsnitt ( figur 2D) med den ' markeringsverktyget '. Klicka på ' ROI manager ' > ' Lägg till ' > ' åtgärd '.
      4. Viktigt, normalisera antalet positiva celler av området för avsnittet.
  2. Nanog kvantifiering
    1. räkna Nanog positiva cellerna under lupp i fältet ljusa manuellt på 20 X förstoring.
      Obs: Den snabbt röda counterstaining tillåter bra utvärdering av TA muskeln morfologi. Färgningen är dock mycket ljus och saknar en tydlig beskrivning av avsnittet. Skannern ofta misslyckas identifiera gränsen för avsnitten och kan inte fokusera korrekt. Det är möjligt att använda markör för att cirkeln kanterna på avsnitten innan du skannar eller använda en känsligare scanner för att identifiera avsnittet. För det nuvarande protokollet, det är mest effektivt att räkna Nanog positiva cellerna manuellt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Att upptäcka muskel skada-inducerad cellulära åldras

Det har nyligen visats att muskelskada inducerar övergående cellulära åldras14. På 10 dagar efter skada (DPI), majoriteten av den skadada myofibers genomgår regenerering med centralt belägna kärnor, ett kännetecken för regenererande myofibers, och arkitekturen av muskeln har återupprättats. Infiltrating inflammatoriska celler reduceras dramatiskt samtidigt synliga i vissa regioner. 10 DPI är en bra tidpunkt att upptäcka senescent celler av SA-β-Gal, eftersom det finns färre nekrotisk och inflammatoriska celler som finns i muskeln stör färgningen. För att bestämma specificiteten av färgningen, används TA injiceras med PBS från samma mus (figur 1A) som en kritisk negativ kontroll.

För att säkerställa en bättre och mer exakt utvärdering av SA-β-Gal positiva celler, är avsnitt från olika plan av TA muskeln placerade i samma bild (figur 1B). Räknaren färgning med eosin är viktigt för den automatisk kvantifieringen av SA-β-Gal positiva celler av ImageJ software. Eosin counter färgning beskriver avsnittet, som tillåter den digital scannern för att identifiera avsnitten med rätt fokus. Det är viktigt att noggrant definiera intervallet och tröskeln för att upptäcka (figur 2A-D). En manuellt handplockade process är dessutom nödvändigt att tillåta mer exakt upptäckt och kvantifiering (figur 2E).

Cellulära åldras underlättar i vivo omprogrammering i muskel

Kan programmeras om musmodell (i4F) ger ett idealiskt system för att utvärdera effekterna av åldrande på cellulär plasticitet och förnyelse. Vid muskelskada behandlas i4F möss med dox att framkalla omplanering i vivo. 7 dagar dox (1 mg/mL) behandling är tillräcklig för att framkalla omprogrammering på cellnivå, medan fortfarande väl tolereras av möss (figur 3A). Därför, vi skördar skadade muskler på 10 pulverinhalatorer från i4F möss behandlades med dox i 7 dagar.

Även om det är möjligt att utföra samtidig färgning av SA-β-Gal med Nanog, rekommenderas det inte för kvantifiering på grund av potentiella störande färgning. Som nämnts ovan, är counter färgning väsentliga för digital scanner upptäckt. Den bästa counter färgning för SA-β-Gal tillsammans med Nanog är snabbt röda orhematoxylin. Dock kan counter färgning maskera över antingen SA-β-Gal eller Nanog signal. Därför, för mer exakt kvantifiering är det bättre att utföra dem separat på varandra följande bilder (figur 3B). Kvantifiera SA-β-Gal positiva och Nanog positiva celler från intilliggande bilder, etablerade vi en positiv korrelation mellan dem (figur 3 c), vilket tyder på en potentiell medverkan av åldras på cellulär plasticitet och förnyelse.

Figure 1
Figur 1: utvärdera åldras nivå efter muskelskada. (A) schematisk representation av muskel skada strategi används för att framkalla åldras. (B) Schematisk bild av muskel avsnitt preparatet. (C) representativa bilder av SAβGal färgning counterstained med eosin. Pilarna pekar på SA-β-Gal+ cellerna. Skala barer = 50 µm. (D) kvantifiering av SA-β-Gal+ celler i skadade och icke-skadade TA-muskel. Varje prick motsvarar ett enskilt djur. Statistisk signifikans bedömdes genom tvåsidiga Students t-test: *** p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Kvantifiering av SA-β-Gal+ celler av ImageJ software. (A-D) skärmdumpar av en muskel avsnitt i ImageJ programvarugränssnitt. Skärmdump av att konvertera en muskel avsnitt bilden till gråskala (A); Att välja alla SA-β-Gal + celler i avsnitt (B); Analysera de valda partiklarna (C); Sammanfattning av alla de räknade particals i ROI manager (D). (E) skärmdump av manuell curation processen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Utvärdering av i vivo omprogrammering efter muskelskada. (A) schematisk representation att utvärdera i vivo omprogrammering och åldras nivå efter muskelskada. (B) representativa bilder av SA-β-Gal och Nanog färgning på frysta delar av skadade skelettmuskulaturen. SAβGal färgning counterstained med eosin (vänster); immunhistokemisk färgning nanog counterstained med snabb röd (höger). Icke-skadade muskler visas på topp och skadade muskeln nedanför. Skala barer = 50 µm. (C) kvantifiering och korrelation av SA-β-Gal + och Nanog+ celler i på varandra följande sektioner (n = 9 möss, värde representerar medelvärdet av 2 avsnitt per mus). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Volym för 50 mL
100 mM stamlösning K3Fe(CN)6 2 mL
100 lager mM K4Fe(CN)6 lösning 2 mL
1 M MgCl2 100 ΜL
50 mg/mL X-Gal 400 ΜL
PBS (pH 5,5) 45.50 mL

Tabell 1: Sammansättningen av 50 mL X-gal lösning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenterar vi en metod för att upptäcka både senescent och pluripotenta stamceller i skelettmuskulaturen kan programmeras om möss. Denna metod kan användas för att utvärdera och kvantifiera båda åldras och framkalla cellulär plasticitet i vivooch undersöka rollen som åldras i vävnad reparation och förnyelse.

I det nuvarande protokollet används åldras-associerade β-galaktosidas (SA-β-Gal) analysen för att upptäcka i vivo senescent celler i skelettmuskulaturen. Denna analys identifierar aktiviteten ökade lysosomala β-galaktosidas vid suboptimum pH (6.0 eller 5.5), förknippas särskilt med senescent celler, medan detta enzym aktivitet mäts vanligen vid surt pH 4,516,17. Därför är det viktigt att justera pH (pH = 6 eller 5.5) att säkerställa en viss upptäckt av åldras-associerade aktiviteten. Dessutom är counter färgning med eosin viktigt för den automatisk kvantifieringen av SA-β-Gal+ celler, där de svaga och diffusa signalerna inte räknas. För att undvika potentiella variabilitet, är det att föredra att samma person utför hela räknande förfarandet.

Även om den SA-β-Gal-analysen är mest använda och accepterade biomarkör för senescent celler, är det inte en exklusiv markör för åldras. Det har föreslagits att alltför konfluenta celler i kultur kan orsaka falsk positivitet för SA-β-Gal18. Analysens känslighet kan vara celltyp och vävnad skriver beroende i vivo19. Därför är det nödvändigt att använda andra oberoende kanoniska markörer, såsom bristande spridning, ökat uttryck av åldras mediatorer (p16, ARF, p53, p21 och M27) och utsöndring av olika SASP faktorer, att ytterligare bekräfta och karakterisera åldras i vivo. Dessutom är korrekt negativa kontroller oumbärliga för att tolka resultat, särskilt för i vivo studie.

Trots att SA-β-Gal-analysen inte är perfekt, det ger särskilt värdefull information för i vivo studie. Det möjliggör upptäckt av senescent celler i deras hemvist miljö med intakt vävnad arkitektur, vilket ger viktig information underlätta ytterligare förståelse av senescent cellernas roll i olika fysiologiska och patologiska sammanhang. Dessutom kan det kopplas till immunfärgning av andra markörer, såsom cell yta markörer att bestämma cellulära identitet senescent celler; eller stemness markörer för att undersöka potentiella medverkan av åldras i förnyelse och uppkomst. Tidigare har utfört vi SA-β-Gal analysen med immunhistokemisk färgning av Nanog i samma avsnitt eller i närheten av att undersöka det potentiella sambandet mellan åldras och i vivo omprogrammering8. Detta protokoll är fokuserat på skelettmuskulaturen, kan det säkerligen utvidgas till andra vävnader.

Nyligen, cellulära åldras har varit inblandad i vävnad reparera och förnyelse, troligen via SASPs7,8,9. Förstå mekanismerna bakom hur åldras bidrar till vävnad reparation och förnyelse kommer säkerligen har en enorm inverkan på regenerativ medicin. Denna analys ger ett värdefullt verktyg för att underlätta identifiering och kvantifiering av senescent celler i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Vi står i skuld till Clemire Cimper för hennes utmärkt teknisk support. Arbete i laboratoriet för H.L. finansierades av Institut Pasteur, Centre National pour la Recherche vetenskapliga, och den Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d'Excellence Revive, Investissement pris; ANR-10-labx-73), den Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) och Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. och A.C. finansieras av Ph.D. och postdoktorala stipendier från återuppliva konsortiet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
K3Fe(CN)6 Sigma 13746-66-2 For SA-β Gal staining solution
K4Fe(CN)6 Sigma 14459-95-1 For SA-β Gal staining solution
MgCl2 Sigma 7786-30-3 For SA-β Gal staining solution
X-Gal Sigma B4252 For SA-β Gal staining solution
Doxycycline Sigma D3447 For inducing in vivo reprogramming
Cardiotoxin Lotaxan Valence, France L8102 For muscle injury
Glutaraldehyde Sigma 111-30-8 For Fixation solution
Paraformaldehyde Electron microscopy science 50-980-487 For Fixation solution
NaCitrate :
Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre		 Sigma 18996-35-5 For permeabilization solution
Triton Sigma 93443 For permeabilization solution
Bovine Serum Albumin Sigma A3608 Washing solution
Antibody anti- Nanog Cell signalling 8822S Rabbit monoclonal antibody
EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) Dako K4010 For Nanog revelation
Eosin 1% Leica 380159EOF Counterstainning
Fast red Vector Laboratories H-3403 Counterstainning
Thermo Scientific Shandon Immu-Mount Fisher scientific 9990402 Mounting solution
Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® Sigma 25608-33-7 Mounting solution
Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives Olympus CKX41 Microscope for Nanog quantification
Mouse: i4F-A Abad et al., 2013 N/A Reprogrammable mouse model
Skeletal muscle, Tibialis Anterior
Slide Scanner Zeiss Axio Scan Z1 slides scanning

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
  2. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  3. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
  4. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  5. Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
  6. Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
  7. Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
  8. Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
  9. Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
  10. Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
  11. Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
  12. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  13. Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
  14. Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  16. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence? Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
  19. Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 128 cellulära åldras i vivo omprogrammering pluripotenta stamceller kan programmeras om musmodell muskelskada cardiotoxin regenerering åldras-associerade β-galaktosidas färgning
Utvärdering av nervskade-inducerad åldras och <em>In Vivo</em> omprogrammering i skelettmuskulaturen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cazin, C., Chiche, A., Li, H.… More

Cazin, C., Chiche, A., Li, H. Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (128), e56201, doi:10.3791/56201 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter