Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Laser Microirradiation at studere In Vivo cellulære svar til Simple og komplekse DNA-skader

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56213
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2,3,4, 1
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine
* These authors contributed equally

Summary

Målet med denne protokol er at beskrive, hvordan du bruger laser microirradiation til at fremkalde forskellige typer af DNA-skader, herunder relativt simple strand pauser og komplekse skader, at studere DNA skader signalering og reparation faktor forsamling på skade steder in vivo .

Abstract

DNA-skader inducerer specifikke signalering og reparation reaktioner i cellen, som er afgørende for beskyttelsen af genom integritet. Laser microirradiation blev en værdifuld eksperimentelle redskab til at undersøge DNA skader svar (DDR) i vivo. Det giver mulighed for real-time høj opløsning encellede analyse af makromolekylære dynamics svar til laser-induceret skade er begrænset til en submicrometer region i cellekernen. Men forskellige laser betingelser har været brugt uden påskønnelse af forskelle i typer af skader induceret. Som følge heraf arten af skaderne er ofte ikke godt karakteriseret eller kontrolleret, forårsager tilsyneladende inkonsistens i ansættelse eller ændring af profiler. Vi viste, at forskellige bestråling betingelser (dvs., forskellige bølgelængder samt forskellige input beføjelser (irradiances) af en femtosekund (fs) nær-infrarødt (NIR) laser) induceret særskilte DDR og reparation protein forsamlinger. Dette afspejler typen af DNA skade produceret. Denne protokol beskriver hvordan titrering af laser effektoptag tillader induktion af forskellige beløb og kompleksiteten af DNA-skader, som kan nemt overvåges af påvisning af base og crosslinking skader, differential poly (ADP-ribose) (PARI) signalering, og pathway-specifikke reparation faktor forsamlinger på skade steder. Når skader betingelser bestemmes, er det muligt at undersøge virkningerne af forskellige skader kompleksitet og differentieret skader signalering og udtynding af upstream faktorer på enhver faktor af interesse.

Introduction

In Vivo DNA skader signalering er ikke velbeskrevet
In vivo, DNA er kompleksbundet med histoner og andre faktorer til form kromatin fibre. Regulering af kromatin struktur er af afgørende betydning for DNA stofskifte. For eksempel er Histon variant H2AX fosforyleret af ataksi-telangiectasia muteret (ATM) og andre kinaser følgende dobbelt-strenget pauser (DSB) induktion, og er vigtig for DSB skader signal forstærkning samt give en docking-site for andre faktorer. Spredning af skader signalering og reparation pathway valg synes at være kritisk påvirket af lokale kromatin struktur på skade steder1. En række kromatin remodeling faktorer, Histon chaperoneproteiner og Histon ændre enzymer er faktisk ansat til at skade websteder og er vigtige for effektiv DNA reparation, fremhæver betydningen af kromatin forordning i DDR og reparere2 , 3 , 4. Desuden skade site klynger eller repositionering blev observeret i gær og drosophila5,6,7,8, der minder om relocalization af genet loci i de subnuclear rum forbundet med gen forordning9,10. Nylige undersøgelser i mus og humane celler viste også mobilisering af DSB websteder, hvilke påvirkninger reparere troskab og pathway valg11,12. Dette øger muligheden for, at DDR/reparation kan også være tæt knyttet til nukleare arkitektur, højere-ordens kromatin organisation og kromosom dynamics i cellekernen. Det er således afgørende for at udvikle høj opløsning metoder til at studere DDR og reparation processer i forbindelse med den endogene nukleare miljø i en levende celle for at forstå kort - og langsigtede konsekvenser af DNA-skader.

Afgørende rolle for PAR Polymerase (PARP) i måle omfanget og typen af skader og regulere Protein forsamling på webstedet skader
PARP1 er et DNA nick sensor hurtigt aktiveres af DNA-skader, der spiller en afgørende rolle i DNA reparation13. PARP1 var oprindeligt tænkt til at fungere sammen med X-Ray reparation Cross supplerer 1 (XRCC1) til at fremme base excision reparation (BER), men nylige undersøgelser afslører sin rolle i andre DNA reparation veje, herunder DSB reparation14. Aktiveret PARP1 bruger nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD+) som substrat til ADP-ribosylate flere mål proteiner, herunder sig selv. Dette enzym og andre medlemmer af familien har tiltrukket stor opmærksomhed i de seneste år, som PARP hæmmere er dukket op som lovende terapeutiske lægemidler til kræft. Selvom PARP hæmmere blev oprindeligt fundet for at være effektiv i brystkræftgen (BRCA)-muteret brystkræftceller, der er nu en overflod af beviser for deres effekter i mono- og kombination behandlinger sammen med DNA skader agenter/bestråling mod et bredt spektrum af kræftformer med mutationer ikke begrænset til BRCA15,16,17,18,19,20.

På det molekylære niveau, var PARP aktivering vist at spille en kritisk rolle i at organisere lokale kromatin struktur på skade steder. PARI-afhængige rekruttering af kromatin ændring enzymer letter DSB reparation og dikterer reparere pathway valg, foreslår vigtige stilladser rolle PAR ændring på skade steder. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 vi for nylig viste udelukkelse af p53-bindende protein 1 (53BP1) fra skader websteder af PAR 32, giver en alternativ forklaring for 53BP1-afhængige hyperactivation af () ikke-homologe endjoining NHEJ) af PARP inhibitor og fremhæve betydningen af PARP i DSB reparation pathway valg33,34. PARP1 også faktorer direkte PARylates og påvirker aktiviteten af flere DNA reparation14.

Ved hjælp af Laser Microirradiation som et redskab til at studere DDR/reparation In Vivo
Laser microirradiation til at producere sub micron ændringer på individuelle kromosomer blev først beskrevet i 196935 og gennemgået i detaljer i 198136. Flere årtier senere, laser microirradiation blev vist sig at fremkalde DNA skader på en defineret submicrometer region i cellekernen, og var vist sig for at være en værdifuld teknik til at studere ansættelse eller ændring af forskellige faktorer til DNA læsioner in vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. denne metode giver mulighed for påvisning af de faktorer, som ikke udgør særskilte bestråling-induceret foci (IRIF) på skade steder39,42. Det er også muligt at undersøge den spatiotemporelle dynamics af kromatin strukturelle ændringer både på skade steder og i resten af kernen. Vi omhyggeligt sammenlignet DDRs induceret af forskellige lasersystemer og input beføjelser til at vurdere forholdet mellem typen af DNA-skader og microirradiation betingelser32,43,44, 45. Afvigende rekruttering mønstre af 53BP1 og telomeric gentage bindende faktor 2 (TRF2) blev observeret i de tidligere laser skade undersøgelser, som dannede grundlag for den tilbagevendende bekymring for den "ikke-fysiologiske" karakter af laser-induceret skade46 ,47,48,49. Vi fandt, at disse tilsyneladende uoverensstemmelser nu kunne forklares med differentieret PARP signalering, som måler mængden og kompleksiteten af inducerede skader32. Vi har bekræftet, at: 1) laser-microirradiated celler (selv efter høje input-power bestråling) er anholdt i interfase i en skade checkpoint kontrol-afhængige måde og forblive levedygtige (mindst op til 48 h)32,50; og 2) reparation faktor rekruttering/ændringer trofast sammenfatte dem observeret med behandling med konventionelle DNA skadelige agenser og DSB induktion af endonucleases32,39,42, 44,50,51,52. Disse resultater støtter kraftigt den fysiologiske relevansen af at studere laser skade-induceret cellulære svar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. grundlæggende celle forberedelse

Bemærk: Dette trin er for standard immunofluorescens påvisning af endogene protein ansættelse eller ændring, og for brugen af en cellelinje stabilt udtrykker en fluorescently mærkede rekombinante proteiner. For eksempel, undersøgelse Potorustridactylus (PtK2) pungdyr nyre epitelceller stabilt udtryk for EGFP-53BP11220-1711 eller TRF2-YFP blev brugt i vores tidligere (figur 1)32. I førstnævnte tilfælde fokus danner 53BP1-regionen (aminosyre 1220-1711), der indeholder oligomerisering domæne, den Tudor domæne og ubiquitylation-afhængige rekruttering (UDR) motiv, var smeltet til forbedret normal god landbrugspraksis (EGFP-53BP11220-1711). Denne fusion protein sammenfatter skade site rekruttering af fuld længde 53BP153,54,55. I HeLa celler, skal fluorescently mærket underenheder af cohesin (f.eks.hSMC1-NGL51, normal god landbrugspraksis-Scc1 (Rad21)52og normal god landbrugspraksis-SA2 51) være stabilt udtrykt at sikre effektiv integration i komplekset og at sammenfatte S/G2 cellecyklus fase-specifik skade site ansættelse af endogene cohesin51.

  1. Seed nogen vedhængende celletype på en 35 mm vævskultur parabol med en inddelte coverslip at give mulighed for individuelle celle identifikation. Justere den oprindelige celle nummer for at nå 60% confluency i 36-48 h baseret på spredning sats på linjen bestemt celle. For eksempel:
    1. For PtK2 pungdyr nyre epitelceller (enten vildtype eller dem stabilt udtryk for EGFP-53BP11220-1711 eller TRF2-YFP): plade 2.0 x 104 celler i 2 mL avanceret Minimum afgørende Medium (MEM) suppleret med 2 mM L-glutamin, 4% føtal kvæg serum (FBS) og antibiotika (100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin), og der inkuberes ved 37 ° C med 7% CO2.
    2. For HeLa celler med stabilt at udtrykke fluorescently mærkede rekombinante proteiner normal god landbrugspraksis-SA2: frø 1,0 x 105 celler i 2 mL Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin, og der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2. Andre HeLa celler kan også bruges, herunder umodificerede celler eller celler, der udtrykker hSMC1-normal god landbrugspraksis.
  2. Tillad celler til at overholde og formere sig i 36-48 timer før DNA skader induktion på 30-60% confluence (at tillade visualisering af nettet antal). Gå til afsnit 4.

2. forbigående Transfektion

Bemærk: Nogle gange godt antistoffer er ikke tilgængelige til at opdage de endogene proteiner. Hvis cellelinjer stabilt udtrykker markør proteiner ikke er tilgængelige, udføre forbigående transfections til at overvåge fluorescently mærket proteiner for levende celle analyser.

  1. HeLa celler, dag 1, seed 6-8 x 104 celler i 0,5 mL kultur medier i et godt af en 24-godt plade og inkuberes i en 100% befugtet inkubator ved 37 ° C og med 5% CO2. Se trin 1.1 for kulturmediers betingelser.
  2. Dag 2, brug et pattedyr udtryk plasmid kodning en fluorescently mærkede DNA reparation faktor (f.eks.normal god landbrugspraksis-NTH1 eller normal god landbrugspraksis-OGG1 for base skader32,44,56, normal god landbrugspraksis-Ku for høj dosis DSBs57, normal god landbrugspraksis-53BP1 32 for relativt simple DSBs eller andre proteiner af interesse smeltet til fluorescerende tag) til at udføre Liposom-medieret DNA Transfektion. Fortynd 0,3 µg plasmid DNA i 25 µL serum-fri kultur medier i en 1,5 mL tube.
  3. I en anden 1,5 mL tube, fortyndes 1 µL Liposom-baseret DNA Transfektion reagens i 25 µL af serumfrit dyrkningsmedier og bland forsigtigt.
  4. Bland den fortyndede DNA og Transfektion agent forsigtigt, og der inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur (RT) til form DNA-lipid komplekser.
  5. Skyl celler med 0,5 mL kultur medier en gang, fjerne medier og tilføje 0,5 mL frisk dyrkningsmedier til celler (som i trin 1.1).
  6. Tilføj DNA-lipid komplekser til cellerne. Bland forsigtigt af vuggende pladen et par gange. Sætte cellerne tilbage i inkubatoren som i trin 2.1.
  7. Efter 4-6 h, Fjern kultur medier fra cellerne og tilsæt 300 µL 0,05% Trypsin-EDTA. Fjerne det, tilføje 200 µL Trypsin-EDTA, og Inkuber i 37 ° C inkubator for 3-4 min.
  8. Efter at have bekræftet, at cellerne er frakoblet, tilføje 800 µL dyrkningsmedier og resuspend cellerne ved forsigtigt pipettering for at bryde op celle klumper. Overføre cellesuspension til en 35 mm kultur parabol med en inddelte coverslip, og tilføje dyrkningsmedier til en endelige mængden af 2 mL.
  9. Inkuber celler i rugemaskinen som trin 2.1 for 48 h, derefter gå til afsnit 4.
    Bemærk: Hvis udtrykket af af rekombinante protein er giftigt (transfekteret celler viser rund eller uregelmæssig morfologi efter inkubation i trin 2.8), forkorte tid, udtryk, og udføre laser microirradiation (afsnit 4) på 16-20 h efter Transfektion så længe den protein udtryk kan bekræftes (til registrering af fluorescens, se trin 4.3). I dette tilfælde udføre Transfektion direkte i 35 mm parabol. Frø 3.0 x 105 HeLa celler i en 35 mm parabol med en inddelte coverslip at opnå ca 50-70% sammenløbet efter 30 h. Transfect DNA plasmider, og ændre media 2-6 h efter Transfektion. Fortsætte med laser microirradiation 12-20 h senere hvis protein udtryk er rimelig og celler vises sund.

3. cellecyklus synkronisering

Bemærk: For homologe rekombination reparation (HR) proteiner, såsom Rad51 og cohesin, rekruttering er mere fremtrædende i S/G2 fase af cellecyklus, i hvilke HR reparation finder sted51. Således, for at overvåge ansættelse af disse proteiner, celle synkronisering S/G2-fasen er nødvendige.

  1. S/G2 fase-synkronisering
    1. Bruge dobbelt thymidine block-protokol for celle synkronisering til S/G2 fase50,51. Efter såning celler i en 35 mm inddelte coverslip parabol (Se trin 1.1), inkuberes celler med thymidine (til en endelig koncentration på 2,5 mM) i kultur medier (som i trin 1.1) til 17 h ved 37 ° C og 5% CO2.
    2. Skyl celler med 1 mL thymidine-fri kultur medier (som i trin 1.1) to gange, og Inkuber celler i 2 mL thymidine-fri Kulturmedier til 9 h som i trin 1.1.
    3. Tilføje 200 µL af 27,5 mM thymidine stamopløsning (opløst i kultur medier) i dyrkningsmedier med celler til en endelig koncentration på 2,5 mM thymidine. Inkuber celler som trin 3.1.1 for en anden 15 h. Skyl og inkuberes celler i thymidine-fri kultur medier til 4-6 h og inducerer DNA-skader (afsnit 4).
    4. Bekræfte synkronisering effektivitet ved hjælp af cellecyklus markører (Cyclin A2 og B1 for S/G2 og G2, henholdsvis), S/G2 fase-specifikke DNA skader reparation faktorer (f.eks., Rad51 eller cohesin), eller ved IdU/EdU vedtægter (for S fase celler)51.
  2. G1 fase synkronisering
    1. Seed 6-8 x 104 HeLa celler i en 35 mm kultur fad med inddelte coverslip (trin 2.1).
    2. Efter 2 dage, identificere metafase celler, som er lidt løftet og runde-formet, under en inverteret mikroskop ved hjælp af 10 X mål og 10 X okulær linser. Erhverve billeder hvis du vil registrere placeringen af metafase celler på den inddelte coverslip.
    3. Efter 3-4 h, bekræfte celledeling i to datterceller (i G1 fase) samt inducerer DNA-skader (afsnit 4).

4. titreringen af Laser Input magt

Bemærk: I denne protokol, vi inducerer DNA-skader ved hjælp af en 780 nm pulserende fs NIR laser system er knyttet til en Konfokal mikroskop eller en 800 nm pulserende fs NIR laser koblet til en inverteret epi-fluorescens mikroskop. Selv om input magt (faktiske irradians på laser omdrejningspunkt i modellen) er nødvendig for at fremkalde sammenlignelige DDR er forskellige i disse systemer, er det grundlæggende princip om effektoptag titrering gældende for begge, eller nogen, NIR systemer32,57 . I situ -energi pr. laser puls og peak irradians på knudepunkt for to laser systemerne var i rækken af 5,33 × 10-2-4 × 10-1 nJ og 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, henholdsvis32.

  1. Tænd NIR laser og laser systemet til warm-up for 1 time før brug.
  2. Placere en skål af celler på et opvarmet (37 ° C) etape i et kammer, der tillader CO2 (5%) og fugtstyring (100%).
    Bemærk: Hvis der ikke findes et CO2 kammer, bruge CO2-uafhængige medier for op til 5-6 h. Hvis der ikke findes en varme fase, holde celler under mikroskop for < 20 min og straks erstatte i vævskultur kuvøse med rette temperatur, CO2og fugtstyring. Disse kultur betingelser kan variere afhængigt af specifikke celletype brugt samt organisme af afledning (fx, pattedyr og padder).
  3. For levende celle analyse af fluorescently mærket proteiner, Vælg en normal god landbrugspraksis filter (450-490 nm excitation, 515-586 nm emission) eller et Cy3 filter (540-552 nm excitation, > 590 nm emission) for normal god landbrugspraksis eller mCherry-smeltet protein, henholdsvis ved hjælp af en 100 X eller 63 X immersionsolie mål.
  4. Søgning efter celler, der har tilsvarende fluorescens signaler, som afspejler sammenlignelige niveauer af protein udtryk. Undgå celler, der har for svage eller alt for stærke udtryk for at reducere celle til celle variabilitet i fluorescens målinger.
  5. Titreres laser input magt.
    1. 780 nm NIR laser knyttet til en Konfokal mikroskop
      1. Brug funktionen software blegemiddel til at målrette lineære spor inde i cellekernen for eksponering for enkelt laser scanninger (opløsning 512 x 512 pixel, zoom X1, bleget region 50 x 4 pixels, 12,8 µs pixel hviletid, iteration x1) gennem olieobjektiv (100 X / 1.3 NA).
      2. Justere den laser transmission procentdel (ved hjælp af software/hardware indbygget i laser mikroskop system af fabrikanten) til 5% uden at ændre andre indstillinger.
      3. Marker en celle i midten af feltet. Klik på regionen af interesse (ROI) værktøj, og tegne en linje eller boks (ca 50 x 4 pixels) i cellekernen ved hjælp af musen, og klik på knappen "Blegemiddel" at fremkalde DNA-skader.
        Bemærk: I efterfølgende bestråling skridt, "blegning" bør øges i 5% trin til 40% eller op til 100% hvis det er nødvendigt.
      4. 800 nm NIR laser tilknyttet epi-fluorescens mikroskop
      5. Styre input magt gennem et (63 X / 1.4 NA) fase kontrast oliebestandighedsobjektet motoriseret rotation af en polarisering filter indført i strålegangen og monteret på en computer-styrede motoriseret roterende scene32,39 , 58.
      6. Justere ryglænets polarisator (°) og måle de input magt (mW) ind i mikroskop, ved hjælp af en laser power meter. Bestemme de polarisator vinkler, der giver input beføjelser der spænder fra 20 mW-155 mW på 5-10 mW ad gangen.
      7. Indstille polarisator vinkel, der svarer til 20 mW input magt.
        Bemærk: For vores laser system, hvis polarisator vinkel er 40 °, de input magt er 65 mW. Øge effektoptag med 5-10 mW ad gangen.
  6. For levende celle analyse, gå til trin 6.1 og 6.3. For immunofluorescens påvisning af endogene proteiner eller ændringer gå videre til afsnit 5. Efter analyse, skal du gå til trin 4.7 for yderligere titrering af laser power. For at analysere kravet opstrøms faktor, gå til afsnit 7.
    Bemærk: Rekruttering af BER og NHEJ faktorer er hurtig (inden for et par minutter) og forbigående (< ~ 30 min - 1 h afhængigt af faktor og < ~ 4 h stillingen skade induktion, henholdsvis). Derimod ansættelse af HR faktorer Rad51 og cohesin kan spores på ~ 30 min - 1 h og de har tendens til at vare mere end 8 timer på unrepaired DNA læsioner44,50,51. Det er således nødvendigt at undersøge forskellige gang point post bestråling for forskellige faktorer.
  7. Øge effektoptag ved ønskede intervaller (dvs.5% til 780 NIR laser og 5-10 mW for 800 NIR) som i trin 4.4, og Gentag trin 4.5-4.7 på et nyt sæt af celler til at bestemme den tærskel (50% af beskadigede celler Vis rekruttering) og peak (100% af celler viser rekruttering) for hvert protein.

5. immunofluorescens farvning

Bemærk: For påvisning af kovalent protein ændring, som PAR (komplekse skader markør) og H2AX fosforylering (γH2AX) (DSB markør), samt cyclobutane pyrimidin dimer (CPD)/(6-4) photoproducts (6-4PP) og 8-oxoguanine (8-oxoG) (crosslinking og base skader markører, henholdsvis), celler skal være fast og farves med specifikke antistoffer. Derudover er det bedst at bekræfte resultaterne med fluorescently mærkede rekombinante proteiner af antistof påvisning af de endogene proteiner, at skelne artefakter induceret af overekspression af rekombinant fusion proteiner.

  1. Fix celler på forskellige tidspunkter efter skader induktion (trin 4.5) afhængigt af faktorer ved at erstatte Kulturmedier (Se trin 1.1) med 1,5 mL 4% PARAFORMALDEHYD/1 X PBS for 10 min på RT.
    Forsigtig: PARAFORMALDEHYD dampe er toksiske og alt arbejde skal gøres i en ventileret stinkskab.
  2. Fjern 4% PARAFORMALDEHYD/PBS og tilsæt 1 mL 0,5% vaskemiddel/PBS for 10 min på RT.
  3. Fjerne 0,5% vaskemiddel/PBS og skyl celler med 2 mL PBS for 5 min to gange, og Inkuber celler i 2 mL blokerende løsning (10% kalveserum, 1% BSA/PBS) i 1 time på RT.
  4. Fjern blokering løsning og tilsættes 2 mL PBS til celler og erstatte PBS med 250 µL primære antistof løsning på 3% BSA/PBS natten over ved 4 ° C eller 1 h på RT. Brug en 1:200-1: 500 fortynding (typisk koncentrationen ca. 1 µg/mL, empirisk bestemt) til antistoffer specifikke for forskellige DNA skader markører (f.eks.γH2AX/53BP1 (DSB); KU (DSB, NHEJ); Rad51/cohesin (DSB, HR); CPD/6-4PP (crosslinking skader); 8-oxoG/DNA glycosylases (f.eks.NTH1) (base skader); PAR (høj dosis komplekse skader)).
  5. Fjern antistof løsning og skyl med 2 mL PBS for 5 min to gange, Fjern PBS og inkuberes med 250 µL 0,1% sekundær antistof i 3% BSA/PBS for 1 h i mørke ved RT.
  6. Sekundær antistof-opløsning og tilsættes 2 mL PBS for 5 min to gange og holde celler i 1,5-2 mL PBS ved 4 ° C for billeddannelse i trin 6.1 og 6.2.

6. kvantitative fluorescens analyse af Immunostained eller levende celler

  1. Fange billeder af bejdset eller levende celler (n > 10) ved hjælp af mikroskop bruges til bestråling. I epi-fluorescens mikroskop system, bruge 1.344 x 1.024 pixels opløsning og gemme billeder som TIFF 16-bit-filer. For en Konfokal mikroskop, bruge 1 X forstørrelse; Argon laser for normal god landbrugspraksis/FITC, HeNe 594 laser til Cy3/mCherry; 512 x 512 eller 1.024 x 1.024 pixel for billedopløsning; Skan hastighed 5, antal: 1 for hurtig scanning eller 2 + for gennemsnit over flere scanninger til at forbedre signal / støjforhold.
  2. Bruge et billedanalyse programmer designet til at måle pixel intensitet.
    1. Brug rektangelværktøjet volumen til at tegne en ROI rundt webstedet skader i den enkelte celle billede. Brug den samme størrelse ROI til at måle baggrund fluorescens signal i nukleoplasmaet støder op til, men ikke overlapper med skade websteder. Dette er vigtigt for normalisering af photobleaching forbundet med den ikke-Konfokal mikroskop system.
    2. For at måle fluorescens signaler ved hjælp af billede analyse programmet, skal du klikke på "Volumen analyserapport" fundet i værktøjskassen. Et nyt vindue vises. Under afsnittet "Data at vise" check kun felterne "Navn" og "Tæthed". Klik på "Gjort" for at visualisere målinger.
    3. Eksportere værdierne til et regnearksprogram ved at klikke på tabelikonet fundet i bunden af volumen rapport-vinduet og vælg "faner (excel-format)" for feltet separatorer og "Fil" eksportere destination.
    4. For at opnå relative signaler, bruge regnearksprogrammet til at opdele fluorescens-intensiteten på webstedet skader (kolonne 1) af som i kontrolelementet baggrund region (kolonne 2) i nukleoplasmaet og fratræk af 1 til normalisering.
  3. Real-time kvantitativ fluorescens tidsforløb analyse ved hjælp af en Konfokal mikroskop
    1. Identificere fluorescently mærkede protein-positive celler ved hjælp af mikroskop som i trin 4.3.
    2. Udføre time-lapse fluorescens imaging før skaden og på forskellige tidspunkter efter skader induktion i afsnit 4. Først tegne blegemiddel ROI (for skader induktion) og derefter vælge den "erhverve > tidsserier" undermenuen, indstille "Antal" som 20, og "cyklus forsinkelse" som 30 s, skal du vælge "bleach én gang efter første scanning" og derefter klikke på "start B". I dette tilfælde er det første billede erhvervet umiddelbart før skaden induktion, efterfulgt af 19 billede erhvervelser på et 30 s interval. Mellemrum ("cyklus forsinkelse") kan ændres alt efter formålet med undersøgelsen.
    3. Når image erhvervelse er fuldført, skal du klikke på "Betyder", og tegne ROI på regionen skader. Klik på "Vis tabel" for at få en tabel over intensitet inden for de valgte ROIs. Normalisere dataene ved at dividere fluorescens intensiteten af webstedet skader på forskellige tidspunkter af intensiteten af den samme region før skaden, og fratræk af 1.

7. små at RNA (siRNA) Transfektion

Bemærk: Udtynding af target proteinet er en effektiv måde at afgrænse kravet opstrøms faktor for de observerede protein rekruttering at skade websteder (afsnit 4). Desuden, strategien er den bedste måde at løse specificiteten af et antistof, der bruges til registrering af immunofluorescens (Se afsnit 5).

  1. Dag 1: Forbered 2 brønde HeLa celler i en 24-godt plade ved såning 6-8 x 104 HeLa celler i 0,5 mL kultur medier i hver brønd, én for kontrol siRNA Transfektion og én til PARP1 siRNA (5'-CCG AGA AAT CTC TTA FTT CAA-3').
  2. Dag 2: Bekræfte, at cellerne er ca 40-50% sammenflydende. Udføre den første runde af siRNA Transfektion: fortyndes 5 pmol siRNA i 25 µL serum-fri kultur medier, tilføje 3 µL lipider baseret Transfektion reagens ind i røret, blandes forsigtigt, og Inkuber i 5-10 min. ved RT.
  3. Skyl celler med 0,5 mL frisk kultur medier én gang, og holde cellerne i 0,5 mL frisk Kulturmedier (Se trin 1.1).
  4. Tilføje RNA-lipid komplekser til cellerne, og bland forsigtigt ved at vippe fad frem og tilbage. Sætte cellerne tilbage i inkubatoren som i trin 2.1.
  5. Opsug Transfektion mix og tilføje 0,5 mL frisk Kulturmedier (trin 1.1) efter 6 h.
  6. Dag 3: Udføre anden runde af siRNA transfections (Se trin 7.2). Derefter, seed 60-100% af cellerne i en 35 mm inddelte coverslip skål som beskrevet i trin 2.3.
  7. Dag 5: Fortsætte med laser microirradiation ved hjælp af den optimale laser power betingelse for maksimal rekruttering af faktoren af interesse, som fastsat i afsnit 4. Typisk, effektiv udtømning kan observeres i ca 60-90% af HeLa celler.
    Bemærk: Som et alternativ og komplementær tilgang, hæmmere, hvis den er tilgængelig, kan bruges til at hæmme funktionen af faktoren for interesse32,44. Til at analysere effekten af hæmme DDR signalering, tilføje 20 µM PARP inhibitor, 1 µM PAR glycohydrolase (PARG) hæmmer eller 10 µM DNA-afhængige protein kinase med katalytisk subunit (DNA-PKcs) hæmmer og 10 µM ATM inhibitor i dimethylsulfoxid (DMSO) til den retter 1 h før skaden induktion. Tilføje DMSO kun til kontrol celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af PtK2 celler stabilt udtryk for EGFP-53BP11220-1711 eller TRF2-YFP, laser effektoptag titreringen blev foretaget til at bestemme den optimale betingelse for deres ansættelse (figur 1)32.

På høje input-power laser skade steder, den betydelige klynger af CPD (crosslinking skader typisk genereres af ultraviolet (UV) skader) samt normal god landbrugspraksis-NTH1 DNA glycosylase, som specifikt genkender base skader blev observeret. Desuden blev højere XRCC1 og CtIP signaler observeret, afspejler det øgede antal strand pauser, og demonstrerer, at komplekse DNA-skader induceret under denne betingelse (figur 2A). Andre DNA glycosylases sammenvoksede til fluorescerende proteiner (fx, normal god landbrugspraksis-nei liv1975 VIII-lignende 2 (NEIL2) og normal god landbrugspraksis-8-Oxoguanine glycosylase (OGG1)) samt condensin kan jeg også bruges som base skader markører44,59. I overensstemmelse med dette, fandt vi at PAR svar er induceret betydeligt ved høje input-power laser (dvs., energi og irradians i den fokale sted i modellen), men kun svagt af lavt laser power i fokale stedet (figur 2B, øverst til venstre). PAR lydsignaler, men ikke PARP1 protein lokalisering, på skade steder var følsomme over for PARP inhibitor (data ikke vist). Derudover siRNA specifikke for PARP1 formindsket både PAR og PARP1 på skade steder (figur 2B, øverst til højre)32. På betingelse af høj effekt, γH2AX i første omgang vises på skade steder, og breder sig hurtigt til hele kernen i en ATM/DNA-PK-afhængige måde (figur 2B, nederst). Lignende ATM/DNA-PK-afhængige spredning af γH2AX blev rapporteret til γ-bestråling60. Ensartede resultater blev opnået med 800 og 780 nm NIR laser systemer32. Tilsammen resultaterne afslører, at det er muligt at titrere laser effektoptag (og derfor, energi og irradians i den fokale inde i cellen) til at finde de betingelser, der inducerer forskellige grader af PARP svar korrelerede med antallet af DSBs og den kompleksiteten af DNA-skader.

De ovennævnte resultater foreslog oprindeligt, at tilstedeværelsen af komplekse DNA skader kunne have forårsaget differential ansættelse af 53BP1 og TRF2. Interessant, dog var 53BP11220-1711 rekruttering til en lav-effekt skade site effektivt hæmmet af tilstedeværelsen af den anden skade site induceret af høj-input-strøm i samme cellekernen (figur 3A i modsætning til figur 3B ). Resultaterne viser, at høj-input-magt laser skade undertrykker 53BP1 ansættelse i trans. Hæmning af PAR af PARP hæmmer samt hæmning af nuklear-dækkende γH2AX spredning af ATM/DNA-PK hæmmere genindføre denne rekruttering selv til webstedet høj effektoptag skader (figur 3A). Dette er adskilt fra rekrutteringen af mægler af DNA skade Checkpoint 1 (MDC1) at skade websteder, som var primært hæmmet af γH2AX spredning, og derfor blev restaureret af ATM/DNA-PK hæmmere, ikke PARP inhibitoren (figur 3A, nederst). Vigtigere, hyperactivation af PAR af PARG hæmning (uden at det påvirker γH2AX status) effektivt undertrykt indledende 53BP1 rekruttering selv ved lav input-power skade websteder, der normalt rekrutterer 53BP1 effektivt (figur 3B)32. Taget sammen, disse resultater viser, at PAR signalering, og ikke typen af skader i sig selv, forstyrrer ansættelse af 53BP132. Dette er et eksempel på alsidigheden af laser microirradiation, som tillader os at undersøge hvordan flere skader steder indflydelse og interagere med hinanden.

Figure 1
Figur 1 : Titrering af laser input magt. For at bestemme laser power til brug for fremtidige eksperimenter, PtK2 celler stabilt udtrykker EGFP-53BP1 og TRF2-YFP blev udsat for at laser microirradiation med input beføjelser mellem 20 mW og 155 mW ved hjælp af de 800 nm NIR laser/inverteret epi-fluorescens mikroskop system. EGFP-53BP1 rekruttering blev overvåget for 15 min post bestråling (PI), mens TRF2-YFP celler blev fulgt til 6 min p.i. Tal direkte over søjlerne repræsenterer antallet af celler, der viste positiv ansættelse af EGFP-53BP1 eller TRF2-YFP at skade websteder over det samlede antal celler testet. Dette tal blev ændret fra Saquilabon Cruz32. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Induktion af komplekse skader og robust DDR signalering af høj input-power laser. (A) High-input-magt laser microirradiation inducerer komplekse skade herunder strand pauser (både SSBs og DSBs), crosslinking og base skader. CPD, XRCC1 (SSB og DSB reparation), NTH1 DNA glycosylase (BER) og CtIP (alternative NHEJ og HR) er vist (kun normal god landbrugspraksis-NTH1 er en levende celle billede og resten er observeret efter immunofluorescens farvning). Kvantitative fluorescens intensitet målinger af skaden site ansættelse blev gjort som anført i protokollen afsnit 7 og er vist i boxplots. Det samlede antal celler (n) testet kan ses under hver kvantificerede protein. p-værdien < 0,05. (B) Top (venstre): Robust PAR og PARP1 signaler på høje input-power skade websteder. Top (til højre): PARP1 siRNA udtynding er tilstrækkeligt til at afskaffe PAR signal32,44. Bund: Tid kursus analyse af γH2AX i celler med lav (øverst) og høj (nederst) input magt skader som angivet. Skalere barer = 10 µm. Dette tal blev ændret fra Saquilabon Cruz32. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Differential aktivering af DDR signalering påvirker 53BP1 rekruttering for at skade websteder. (A) Top: PtK2 celler stabilt udtrykker EGFP-53BP11220-1711 var microirradiated med både lav (15%) og høj (25%) input magt (hvid og gul pilespidser, henholdsvis) i den samme kerne ved hjælp af 780 nm NIR/Konfokal mikroskop system. Dette blev udført i DMSO, PARP inhibitor (Pi) eller kombinationen af ATM, DNA-PK og PARP hæmmere (Ai + Di + Pi) som angivet. Live-celle billeddannelse af EGFP-53BP11220-1711 blev fanget på 30 min efter DSB induktion. Celler blev derefter fast og farves med et antistof bestemt til γH2AX som DSB markør. Ændringer af fluorescens intensiteten af EGFP-53BP11220-1711 på skade steder er vist til højre med p-værdier (mener værdier er: DMSO, 0,03 ± 0,02; Pi, 0,34 ± 0,19; AI + Di + Pi, 0.98 ± 0,23). Bund: Effekten af Pi og Ai + Di behandling på MDC1 lokalisering med høj input-power skader som anført. Skalalinjen er 10 µm. Højre: Ændringer af fluorescens signaler af MDC1 ved høj input-effekt skade websteder DMSO, Pi eller Ai + Di med p-værdier (mener værdier er: DMSO, 0,07 ± 0,10; Pi, 0,05 ± 0,07; AI + Di, 0,86 ± 0,26). Skalalinjen = 10 µm. N = 10 for hver intensitet måling. (B) virkningen af forbedringen af PAR signaler af PARGi behandling på endogene 53BP1 rekruttering til lav input-power skade websteder. Højre: Boxplots repræsenterer den kvantitative analyse af endogene 53BP1 rekruttering (fundet ved immunfluorescens farvning) med lav input-power laser (60 mW i 800 nm NIR laser/inverteret epi-fluorescens mikroskop system) på 15 min post bestråling i nærheden af DMSO eller PARGi som angivet. Venstre: PARI og 53BP1 immunofluorescens farvning billeder af celler beskadiget under de samme betingelser med DMSO eller PARGi behandling. For DMSO behandling, 100% af celler undersøges (N = 25) udstillet robust 53BP1 rekruttering (til højre). Derimod 20/25 viste ingen 53BP1 ansættelse i PARGi (nederst til højre), og 5 celler viste svage rekruttering. Skalalinjen = 10 µm. Dette tal blev ændret fra Saquilabon Cruz32. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fordelene ved at bruge laser microirradiation til DDR forskning er:

1. det er muligt at fremkalde forskellige typer og mængder af DNA skade fra simple strand pauser til komplekse DNA-skader, og for at opdage forskellige reparation faktorer på DNA skader websteder ved at justere parametrene laser bestråling. Det er også muligt at påføre skade flere gange i den samme cellekerne for at evaluere trans effekter (som i figur 3).

2. vigtigere, kan begivenheder der sker på skade steder og sekundære hændelser, som forekommer andre steder i kernen nemt adskilles.

3. det er muligt at foretage høj opløsning real-time målinger af fluorescently mærket protein dynamics som reaktion på skade på en enkelt celle niveau, herunder, men ikke begrænset til: Förster resonans energi overføre (FRET), fluorescens levetid Imaging ( FLIM), par korrelationsfunktionen (pCF), osv., til at fange DDR i levende celler.

4. Ved at kombinere med RNA interferens eller hæmmer behandling, er det relativt let at teste opstrøms faktor krav i et lille antal celler.

5. det bør også bemærkes, at NIR (eller grønne) laserstråling kræver ikke forudgående sensibilisering af DNA med nukleotid analoger eller DNA-intercalating farvestoffer, således at man undgår uønskede bivirkninger på kromatin pakning. Dette er i modsætning til UV laser system, der kræver sensibilisering på lav dosis og forårsager afvigende DDR på høj dosis39,49,61.

Kritiske trin i protokollen/ændringer og fejlfinding
Det er vigtigt, at cellerne er i sunde betingelser når DDR analyser er udført for at minimere artefakt og experimental variationer. DNA - eller siRNA-transfekteret celler er som regel mere følsomme eller let fritliggende når vokser på den inddelte coverslip. Det hjælper til at holde cellerne for kortere gange i Transfektion reagens, så længe Transfektion virker, og frø mere transfekteret celler på den inddelte coverslip parabol i forhold til de untransfected celler. Dette er nødvendigt for at opnå sammenlignelige celle sammenløb for forsøgene.

Det er blevet rapporteret, at thymidine blokken fører til øgede niveauer af γH2AX i det synkroniserede celler62, som kan påvirke DDR og skew resultaterne. Derudover blev base line γH2AX signal vist sig at være højere i S og G2/M fase selv uden nogen udefrakommende skade63,64. Vi overholder imidlertid ikke nogen betydelig γH2AX signal i den nukleoplasmaet, der ville påvirke eller forstyrre den specifikke γH2AX svar på laser-induceret skade websteder i cellerne synkroniseret i S/G2 fase af en dobbelt thymidine blok51.

For at opnå ensartede resultater, er det nødvendigt med jævne mellemrum kontrollere laser system outputparametre (hver 2 til 4 uger) og optisk tilpasningen (hver 2 måneder). Over tid, laser systemkomponenter kan være nødvendigt at re justeret mål linse kan være beskadiget og skal udskiftes og stabiliteten af det samlede effektoptag kan ændre. Centrale er at vurdere tilstedeværelsen af skader (crosslinking (CPD og/eller 6-4PP) og base skader (8-oxoG)), markør proteiner (f.eks.DNA glycosylases, Rad51, cohesin og Ku) og PAR modifikation er beskrevet i denne protokol til at bestemme dosis og kompleksiteten af DNA-skader induceret af laser mikroskop system anvendes.

Begrænsninger af teknikken
Laser microirradiation har sine begrænsninger. DNA-skader induceret af laserstrålen er yderst grupperet på ét område i kernen i forhold til naturligt forekommende skader, der kan være spredt over hele kernen. Dette kan ændre, hvordan skader signalering er opformeret i den nærliggende kromatin eller i kernen. Da et relativt lavt antal celler kan bestråles ad gangen, befolkningsbaseret biokemiske analyser (f.eks., vestlige skamplet, protein kompleks rensning, kromatin immunoprecipitation (ChIP)), let kan ikke udføres. Afhængighed af fluorescently mærket proteiner (med over udtryk af de eksogene rekombinante proteiner eller endda med dem udtrykt endogent ved hjælp af CRISPR-medieret tag indsættelse) for dynamic imaging gør undersøgelserne sårbare over for protein fusion-induceret artefakter. Den unikke karakter af laser-induceret skade og potentielle kunstig virkninger af mærket proteiner, derfor, skal vurderes ved sammenligning med resultater ved hjælp af konventionelle DNA skader metoder (IR, kemiske skadelige agenser) og med den endogene ukodede proteiner (selv om nogle gange det ikke er muligt at udføre komplet parallelle eksperimenter).

Betydning med hensyn til eksisterende metoder
Brug af sekvens-specifikke endonucleases-SceI, FokI, AsiSI og PpoI giver en alternativ strategi for at fremkalde lokationsspecifikke DSBs (strengt simpel DSBs). Faktor ansættelse eller modifikationer kan analyseres af lokationsspecifik eller genome-wide ChIP analyse65,66,67,68,69. Relativt synkron induktion af DSBs kan opnås ved at tagge liv1975 med en steroid hormon receptor og en nedbrydning signal (degron) for hurtig nukleare omplantning og nedbrydning, henholdsvis65,66 , 67 , 68 , 69. man må tage i betragtning, men der liv1975 udtryk og målet site tilgængelighed, effektivitet og løbende reparationsstatus kan være variabel i forskellige celler og på forskellige målwebsteder. Disse heterogeneities vil være gennemsnit i befolkningen-baserede ChIP analyse, som kan forvrænge resultater. Laser microirradiation, på den anden side tilbyder den højeste mulige tidsmæssige opløsning (millisekunder) samt rumlig opløsning (submicrometer) af skader svar dynamik, som kan analyseres på én celle-niveau. Høj skade tæthed, dog kan påvirke resultatet. Begge strategier kan være følsomme over for artefakter forårsaget af antistof tilgængelighed og/eller peptid tagging. Det er derfor vigtigt at forstå fordele og ulemper ved begge strategier, som potentielt kan bruges til at supplere hinanden.

Fremtidige ansøgninger
Med hurtige forfremmelse af fluorescens imaging og dynamics teknikker, alsidighed af lasersystemer til at fremkalde forskellige mængder og typer af DNA-skader på bestemte steder og cellecyklus fase giver en værdifuld mulighed for at afhøre cellulære og Molekylær svar til DNA skader med høj spatiotemporelle opløsning på en enkelt celle niveau. Det vil være muligt, for eksempel, at drille ud skader lokationsspecifikke og kerne - og celle-dækkende DDR signal transduktion med millisekund-opløsning (f.eks.opdager molekylære interaktioner eller ændringer, der sker udelukkende på skade steder, undersøge dynamiske ændringer af kromatin struktur i realtid, eller observere real-time spredning af skader signalering fra skade websteder til hele kernen). Det er også muligt at følge den samme celle i en lang periode af tid til at undersøge virkningerne af DNA-skader på cellen skæbne. Vi forestiller os, at laser microirradiation metoder, hvis de anvendes korrekt, vil fortsat bidrage betydeligt til fremme af feltet DNA reparation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Akira Yasui ved Tohoku Universitet, Japan for normal god landbrugspraksis-NTH1 udtryk plasmid, og Dr. Eros Lazzerini Denchi på Scripps Research Institute, La Jolla, Californien for TRF2-YFP og EGFP-53BP11220-1711 udtryk plasmider. Dette arbejde blev støttet af Air Force Office for videnskabelig forskning (FA9550-04-1-0101) og Beckman Laser Institute Inc. Foundation (til M.W.B), Ford Foundation stipendium fra National Academy of Sciences (til B.A.S), og NSF MCB-1615701 og CRCC CRR-17-426665 (til K. Y.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread--chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R. Jr, Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed? Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A. Jr, Piccart, M. An update on PARP inhibitors--moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27 (2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68 (2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548 (2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219 (2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460 (2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Tags

Genetik sag 131 Laser microirradiation lasere i medicin DNA-skader DNA skader svar DNA reparation poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) komplekse skader strand pauser base skader
Laser Microirradiation at studere <em>In Vivo</em> cellulære svar til Simple og komplekse DNA-skader
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B.… More

Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter