Summary

Vurdering av antikoagulerende og anti-inflammatorisk egenskaper av endotelceller 3D cellekultur og ikke-anticoagulated fullblod

Published: September 05, 2017
doi:

Summary

Vi presenterer en i vitro modell som tillater undersøkelse og analyse av koagulering i hele, ikke-anticoagulated blod. Anticoagulation i systemet avhenger naturlig anticoagulation effekt av sunn endotelceller og endothelial celle aktivering fører til blodpropp.

Abstract

I vivo, endotelceller er avgjørende for den naturlige anticoagulation av sirkulerende blod. Følgelig fører endothelial celle aktivering til blodpropp. Dette fenomenet er observert i mange kliniske situasjoner som organtransplantasjon i nærvær av pre-formet anti-giver antistoffer, inkludert xenotransplantation, samt iskemi/reperfusion skade. For å redusere dyr eksperimentering ifølge 3R standarder (reduksjon, utskifting og forbedring), i vitro modeller å studere effekten av endothelial celle ville aktivering på blod koagulasjon være svært ettertraktet. Felles flatbed systemer endothelial celle kultur gir imidlertid en overflate-til-volum forholdet mellom 1-5 cm2 endotelet per mL blod, som ikke er tilstrekkelig for naturlige, endothelial-mediert anticoagulation. Dyrking endotelceller på microcarrier perler kan øke overflate-til-volum forholdet mellom 40-160 cm2/mL. Dette økt forholdet er tilstrekkelig for å sikre den “naturlige” anticoagulation av fullblod, slik at bruk av antikoagulanter kan unngås. Her er en i vitro microcarrier-systemet beskrevet å studere virkningene av genetisk modifisering av svin endotelceller på koagulering av hele, ikke-anticoagulated menneskeblod. I beskrevet analysen, primære svin aorta endotelceller, enten wild type (WT) eller transgene for CD46 og thrombomodulin, ble dyrket på microcarrier perler og deretter utsatt for fersk trukket ikke-anticoagulated menneskeblod. Denne modellen gir måling og kvantifisering av cytokin utgivelsen samt aktivisering markører supplement og koagulering i blod plasmaet. I tillegg ble imaging aktivert endothelial celle og deponering av immunglobuliner komplement- og koagulering proteiner på endothelialized perler utført av AC confocal mikroskopi. Denne analysen kan også brukes til å teste medisiner som skal hindre endothelial celle aktivering, og dermed koagulering. På dens potensial for å redusere antall dyr som brukes til slike undersøkelser, er beskrevet analysen enkel å utføre og konsekvent reproduserbar.

Introduction

Vaskulære endotelet består av en monolayer av endotelceller (EC) som linje lumen av blod fartøy. I en fysiologisk tilstand, quiescent EU er ansvarlig for vedlikehold av en antikoagulerende og anti-inflammatorisk miljø. 1 dette er formidlet av uttrykk for antikoagulerende og anti-inflammatoriske proteiner på EC overflaten. For eksempel EC aktivisering skyldes iskemi/reperfusion skade eller vaskulær avvisning av (xeno-) transplantert organene resulterer i en endring av endothelial overflaten fra en antikoagulerende og anti-inflammatorisk staten Pro koagulere og pro-inflammatoriske staten. 1

For å studere fascinerende og komplekse samspillet mellom de endotel, og koagulering faktorene, i vitro modeller som etterligner som nært i vivo situasjonen er svært ettertraktet. En vanlig begrensning som preger konvensjonelle i vitro koagulering analyser er bruken av anticoagulated blod som gjør analysen av koagulering-mediert effekter krevende og selv recalcification citrerte hele blod ikke kan gjengi resultater oppnåelig med friske ikke-anticoagulated blod. 2 dessuten i tradisjonelle flat-bed celle kultur systemer er det umulig å utnytte egenskapene antikoagulerende endotelet som en tilstrekkelig endothelial celle-overflate per blodvolum ikke kan nås. Modellen presentert her overvinner disse begrensningene av dyrking EC på overflaten av sfærisk microcarrier perler, slik at en EC overflate-til-blod forholdet > 16 cm2/mL kan nås, som ligner situasjonen i små arterioler eller årer, og som ble beskrevet for å være tilstrekkelig til at “naturlig” anticoagulation blod av EC overflaten. 3 , 4 fullblod kan brukes uten ekstra antikoagulanter i denne innstillingen. Blodprøver kan samles under eksperimentet og cytokiner, koagulering faktorer og løselig supplement aktivisering markører kan oppdages og kvantifisert. Videre kan EC-belagt microcarrier perler bli analysert for utfylle og immunglobulin avsettelse som uttrykk for EF aktivisering markører av AC confocal mikroskopi. Et annet interessant program inkluderer testing av narkotika som skal hindre endothelial celle aktivering, og dermed koagulering. 5 men denne modellen ikke kan helt erstatte dyr eksperimentering, det tilbyr en metode for å teste spesifikke funksjonelle hypoteser ex vivo bruke celler og dermed redusere antall dyr som brukes i grunnleggende forskning på iskemi/reperfusion skade eller (xeno) transplantasjon.

Beskrevet modellen ble brukt til å etterligne en xenotransplantation i som svin aorta endotelceller (PAEC) er dyrket på microcarrier perler og inkubert med hele, ikke-anticoagulated menneskeblod. Forskjellige transgene PAEC, bærer flere menneskelige gener som CD46 for regulering av komplement systemet eller thrombomodulin (hTBM) for regulering av koagulasjonssystemet, ble analysert for sine antikoagulerende egenskaper. Endothelial celle aktivering, supplement og koagulering systemer tett kontrollert og sammen. 6 det er derfor viktig å forstå hvordan ulike transgene cellene oppfører seg etter eksponering for menneskelig blod vedheft molekyl uttrykk og cytokin utgivelse, utgytelsen av glycocalyx og tap av antikoagulerende proteiner. 7

Protocol

tysk Landrace griser (vill-type avlet i en lokal gård og transgene avlet på instituttet for molekylær Animal avl og bioteknologi, Ludwig-Maximilian University, München, Tyskland), veier mellom 30 kg til 40 kg, ble brukt i Denne studien. Alle dyrene ble plassert under standard betingelser med vann og mat ad lib. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med den britiske dyr Act (vitenskapelig prosedyrer) og NIH guiden for omsorg og bruk av forsøksdyr, samt sveitsiske Dyrevern loven. Alle dyrestudier overholdt …

Representative Results

Etter 7-10 dager av kultur i spinner kolbe (figur 1) var cellene confluent, som dekker hele overflaten av microcarrier perler (figur 2). Bekreftelse av confluency er et viktig skritt fordi en ikke-confluent monolayer av EC på microbeads vil føre til en markant nedgang i clotting tid, gitt microcarrier perler overflate er sterkt Pro koagulere (clotting tid: 4 ± 1 min) ( Figur 3). <p class="jove…

Discussion

Modellen presentert her er egnet for koagulering relaterte studier slik at analyse av ulike aspekter av koagulering og dets interaksjon med EC. 8 i xenotransplantation forskning, det er en nyttig system å teste antikoagulerende egenskapene til ulike genmodifiserte svin ECs etter inkubasjon med menneskeblod 9.

De viktigste trinnene av protokollen er de sikre komplett celle dekning (confluency) av microbeads før du starter eksperimentet og de gje…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne studien ble støttet av det sveitsiske National Science Foundation (SNSF, Grant No. 320030_156193). Forfatterne takker Dr. Benoît Werlen for å gi Biosilon microcarrier perler. Vi takker også Prof Hans Peter Kohler og Prof André Haeberli for hjelp med å sette opp microcarrier perle modellen.

Materials

PAEC Isolated from pig aorta in our Lab
Microcarrier beads (Biosilon) Thermo Fisher Scientific 160-250
Collagen I, Bovine Gibco A10644-01
DMEM Gibco 21885-025
Medium 199 Sigma M7528
RPMI Gibco 32404-014
Neutral tubes Sarstedt 02.1726.001
Polypropylene tubes Simport T406-2A
Stirrer flasks Tecnomara
Biological stirrer Brouwer MCS-104S
Rat anti CD31 R&D Systems MAB33871 Dilution 1:100
Goat anti-rat IgG-Cy3 Jackson Immuno Research 112-166-003 Dilution 1:500
Goat anti VE-cadherin Santa Cruz sc-6458 Dilution 1:100
Rabbit anti vWF DAKO A0082 Dilution 1:100
Dk anti Gt IgG – Alexa 488 Molecular Probes A11055 Dilution 1:500
Goat anti Rabbit – FITC Southern Biotech 4050-02 Dilution 1:500
DAPI Sigma 32670-25MG-F Dilution 1 µg/mL
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
FBS Gibco 10270-106 Concentration: 10% in cell culture medium
Needle Becton Dickinson 367286 Size: 0.8×19 mm (21ɢ 3/4")
Adapter Sarstedt 14.1205
Confocal microscope Carl Zeiss LSM 710
Image analysis software Image J Available for free at: https://imagej.net
Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix PromoCell C-39216 2mL in 500mL of DMEM
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Concentration: 1% in cell culture medium
L-Glutamine Gibco 25030-024 Concentration: 1% in cell culture medium
Heparinun natricum Drossa Pharm AG Stock concentration: 5000 U.I./ mL
Chamberslides Bioswisstec AG 30108
CaCl2 x 2H2O Merck 2382.0500
MgCl2 x6 H2O Merck 1.5833.1000
Tween 20 Axon Lab AG 9005-64-5
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7030
Glycergel mounting medium Dako C0563

References

  1. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
  2. Rajwal, S., Richards, M., O’Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood – a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
  3. Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
  4. Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
  5. Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
  6. Cowan, P. J., d’Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
  7. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
  8. Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
  9. Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
  10. Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
  11. Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).

Play Video

Cite This Article
Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).

View Video