Vurdering av antikoagulerende og anti-inflammatorisk egenskaper av endotelceller 3D cellekultur og ikke-anticoagulated fullblod
Summary
Vi presenterer en i vitro modell som tillater undersøkelse og analyse av koagulering i hele, ikke-anticoagulated blod. Anticoagulation i systemet avhenger naturlig anticoagulation effekt av sunn endotelceller og endothelial celle aktivering fører til blodpropp.
Abstract
I vivo, endotelceller er avgjørende for den naturlige anticoagulation av sirkulerende blod. Følgelig fører endothelial celle aktivering til blodpropp. Dette fenomenet er observert i mange kliniske situasjoner som organtransplantasjon i nærvær av pre-formet anti-giver antistoffer, inkludert xenotransplantation, samt iskemi/reperfusion skade. For å redusere dyr eksperimentering ifølge 3R standarder (reduksjon, utskifting og forbedring), i vitro modeller å studere effekten av endothelial celle ville aktivering på blod koagulasjon være svært ettertraktet. Felles flatbed systemer endothelial celle kultur gir imidlertid en overflate-til-volum forholdet mellom 1-5 cm2 endotelet per mL blod, som ikke er tilstrekkelig for naturlige, endothelial-mediert anticoagulation. Dyrking endotelceller på microcarrier perler kan øke overflate-til-volum forholdet mellom 40-160 cm2/mL. Dette økt forholdet er tilstrekkelig for å sikre den “naturlige” anticoagulation av fullblod, slik at bruk av antikoagulanter kan unngås. Her er en i vitro microcarrier-systemet beskrevet å studere virkningene av genetisk modifisering av svin endotelceller på koagulering av hele, ikke-anticoagulated menneskeblod. I beskrevet analysen, primære svin aorta endotelceller, enten wild type (WT) eller transgene for CD46 og thrombomodulin, ble dyrket på microcarrier perler og deretter utsatt for fersk trukket ikke-anticoagulated menneskeblod. Denne modellen gir måling og kvantifisering av cytokin utgivelsen samt aktivisering markører supplement og koagulering i blod plasmaet. I tillegg ble imaging aktivert endothelial celle og deponering av immunglobuliner komplement- og koagulering proteiner på endothelialized perler utført av AC confocal mikroskopi. Denne analysen kan også brukes til å teste medisiner som skal hindre endothelial celle aktivering, og dermed koagulering. På dens potensial for å redusere antall dyr som brukes til slike undersøkelser, er beskrevet analysen enkel å utføre og konsekvent reproduserbar.
Introduction
Vaskulære endotelet består av en monolayer av endotelceller (EC) som linje lumen av blod fartøy. I en fysiologisk tilstand, quiescent EU er ansvarlig for vedlikehold av en antikoagulerende og anti-inflammatorisk miljø. 1 dette er formidlet av uttrykk for antikoagulerende og anti-inflammatoriske proteiner på EC overflaten. For eksempel EC aktivisering skyldes iskemi/reperfusion skade eller vaskulær avvisning av (xeno-) transplantert organene resulterer i en endring av endothelial overflaten fra en antikoagulerende og anti-inflammatorisk staten Pro koagulere og pro-inflammatoriske staten. 1
For å studere fascinerende og komplekse samspillet mellom de endotel, og koagulering faktorene, i vitro modeller som etterligner som nært i vivo situasjonen er svært ettertraktet. En vanlig begrensning som preger konvensjonelle i vitro koagulering analyser er bruken av anticoagulated blod som gjør analysen av koagulering-mediert effekter krevende og selv recalcification citrerte hele blod ikke kan gjengi resultater oppnåelig med friske ikke-anticoagulated blod. 2 dessuten i tradisjonelle flat-bed celle kultur systemer er det umulig å utnytte egenskapene antikoagulerende endotelet som en tilstrekkelig endothelial celle-overflate per blodvolum ikke kan nås. Modellen presentert her overvinner disse begrensningene av dyrking EC på overflaten av sfærisk microcarrier perler, slik at en EC overflate-til-blod forholdet > 16 cm2/mL kan nås, som ligner situasjonen i små arterioler eller årer, og som ble beskrevet for å være tilstrekkelig til at “naturlig” anticoagulation blod av EC overflaten. 3 , 4 fullblod kan brukes uten ekstra antikoagulanter i denne innstillingen. Blodprøver kan samles under eksperimentet og cytokiner, koagulering faktorer og løselig supplement aktivisering markører kan oppdages og kvantifisert. Videre kan EC-belagt microcarrier perler bli analysert for utfylle og immunglobulin avsettelse som uttrykk for EF aktivisering markører av AC confocal mikroskopi. Et annet interessant program inkluderer testing av narkotika som skal hindre endothelial celle aktivering, og dermed koagulering. 5 men denne modellen ikke kan helt erstatte dyr eksperimentering, det tilbyr en metode for å teste spesifikke funksjonelle hypoteser ex vivo bruke celler og dermed redusere antall dyr som brukes i grunnleggende forskning på iskemi/reperfusion skade eller (xeno) transplantasjon.
Beskrevet modellen ble brukt til å etterligne en xenotransplantation i som svin aorta endotelceller (PAEC) er dyrket på microcarrier perler og inkubert med hele, ikke-anticoagulated menneskeblod. Forskjellige transgene PAEC, bærer flere menneskelige gener som CD46 for regulering av komplement systemet eller thrombomodulin (hTBM) for regulering av koagulasjonssystemet, ble analysert for sine antikoagulerende egenskaper. Endothelial celle aktivering, supplement og koagulering systemer tett kontrollert og sammen. 6 det er derfor viktig å forstå hvordan ulike transgene cellene oppfører seg etter eksponering for menneskelig blod vedheft molekyl uttrykk og cytokin utgivelse, utgytelsen av glycocalyx og tap av antikoagulerende proteiner. 7
Protocol
Representative Results
Discussion
Modellen presentert her er egnet for koagulering relaterte studier slik at analyse av ulike aspekter av koagulering og dets interaksjon med EC. 8 i xenotransplantation forskning, det er en nyttig system å teste antikoagulerende egenskapene til ulike genmodifiserte svin ECs etter inkubasjon med menneskeblod 9.
De viktigste trinnene av protokollen er de sikre komplett celle dekning (confluency) av microbeads før du starter eksperimentet og de gje…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av det sveitsiske National Science Foundation (SNSF, Grant No. 320030_156193). Forfatterne takker Dr. Benoît Werlen for å gi Biosilon microcarrier perler. Vi takker også Prof Hans Peter Kohler og Prof André Haeberli for hjelp med å sette opp microcarrier perle modellen.
Materials
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit – FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Needle | Becton Dickinson | 367286 | Size: 0.8×19 mm (21ɢ 3/4") |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2mL in 500mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
References
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
- Rajwal, S., Richards, M., O’Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood – a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
- Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
- Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
- Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
- Cowan, P. J., d’Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
- Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
- Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
- Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
- Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
- Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).
