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Medicine

3 डी सेल संस्कृति और गैर anticoagulated पूरे रक्त का उपयोग कर Endothelial कोशिकाओं के थक्कारोधी और विरोधी भड़काऊ गुणों का आकलन

doi: 10.3791/56227 Published: September 5, 2017

Summary

हम एक इन विट्रो मॉडल जो अध्ययन और पूरे, गैर anticoagulated रक्त में जमावट के विश्लेषण की अनुमति देता है पेश करते हैं । प्रणाली में एंटिकोगुलेशन स्वस्थ endothelial कोशिकाओं के प्राकृतिक एंटिकोगुलेशन प्रभाव पर निर्भर करता है और endothelial कोशिका सक्रियण के थक्के में परिणाम होगा ।

Abstract

vivo में, endothelial कोशिकाओं रक्त संचार के प्राकृतिक एंटिकोगुलेशन के लिए महत्वपूर्ण हैं । नतीजतन, endothelial सेल सक्रियण रक्त जमावट की ओर जाता है । यह घटना कई नैदानिक स्थितियों में मनाया जाता है, पूर्व की उपस्थिति में अंग प्रत्यारोपण की तरह-विरोधी दाता एंटीबॉडी xenotransplantation सहित, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ischemia में/reperfusion चोट । आदेश में 3R मानकों के अनुसार पशु प्रयोग को कम करने के लिए (कमी, प्रतिस्थापन और शोधन), इन विट्रो मॉडल रक्त जमावट पर endothelial कोशिका सक्रियण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक वांछनीय होगा. हालांकि, endothelial सेल संस्कृति के आम flatbed प्रणालियों के 1-5सेमी 2 रक्त की प्रति मिलीलीटर, जो प्राकृतिक, endothelial मध्यस्थता एंटिकोगुलेशन के लिए पर्याप्त नहीं है की एक सतह से मात्रा अनुपात प्रदान करते हैं । microcarrier मोतियों पर संवर्धन endothelial कोशिकाओं ४०-१६० cm2/mL. के लिए सतह से मात्रा अनुपात बढ़ सकता है यह बढ़ा हुआ अनुपात पूरे रक्त के ' प्राकृतिक ' एंटिकोगुलेशन को सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है, ताकि थक्का के उपयोग से बचा जा सके. यहां एक इन विट्रो microcarrier-आधारित प्रणाली पूरी, गैर anticoagulated मानव रक्त के जमावट पर सुअर endothelial कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए वर्णन किया गया है । वर्णित परख में, प्राथमिक सुअर महाधमनी endothelial कोशिकाओं, या तो जंगली प्रकार (WT) या ट्रांसजेनिक मानव CD46 और thrombomodulin के लिए, microcarrier मोतियों पर बड़े हो रहे थे और फिर हौसले से तैयार गैर anticoagulated मानव रक्त से अवगत कराया । यह मॉडल माप और cytokine रिहाई के साथ ही पूरक और रक्त प्लाज्मा में जमावट के सक्रियण मार्कर के ठहराव के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, सक्रिय endothelial सेल और इम्युनोग्लोबुलिन के जमाव की इमेजिंग, पूरक और endothelialized मोतियों पर जमावट प्रोटीन फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदर्शन किया गया । इस परख भी दवाओं जो endothelial सेल सक्रियकरण को रोकने के लिए और, इस प्रकार, जमावट माना जाता है परीक्षण किया जा सकता है । अपनी क्षमता के शीर्ष पर इस तरह की जांच के लिए इस्तेमाल जानवरों की संख्या को कम करने के लिए, वर्णित परख प्रदर्शन करने के लिए और लगातार प्रतिलिपि आसान है ।

Introduction

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संवहनी endothelium endothelial कोशिकाओं (ईसी) जो रक्त वाहिकाओं के लुमेन लाइन की एक monolayer के होते हैं । एक शारीरिक स्थिति में, quiescent चुनाव आयोग एक थक्कारोधी और विरोधी भड़काऊ वातावरण के रखरखाव के लिए जिंमेदार हैं । 1 यह चुनाव आयोग की सतह पर थक्कारोधी और विरोधी भड़काऊ प्रोटीन की अभिव्यक्ति द्वारा मध्यस्थता है । उदाहरण के लिए, चुनाव आयोग के ischemia/reperfusion चोट या संवहनी अस्वीकृति की वजह से (एक्सो-) प्रत्यारोपण अंगों एक थक्कारोधी और विरोधी भड़काऊ राज्य से एक समर्थक कौयगुलांट और समर्थक भड़काऊ करने के लिए endothelial सतह के परिवर्तन में परिणाम राज्य. 1

endothelium और जमावट कारकों के बीच आकर्षक और जटिल बातचीत का अध्ययन करने के लिए, इन विट्रो मॉडल जो के रूप में निकटता के रूप में संभव के रूप में नकल में vivo स्थिति अत्यधिक वांछनीय हैं । एक आम सीमा है जो इन विट्रो जमावट परख में पारंपरिक की विशेषता है anticoagulated रक्त जो जमावट की मध्यस्थता प्रभाव दुरूह और यहां तक कि recalcification पूरे रक्त की प्रतिलिपि नहीं बना सकते है के विश्लेषण बनाता है का उपयोग है ताजा गैर anticoagulated रक्त के साथ परिणाम प्राप्य । 2 इसके अलावा, पारंपरिक फ्लैट बिस्तर सेल संस्कृति प्रणालियों में यह endothelium के थक्कारोधी गुणों का दोहन करने के लिए असंभव है के रूप में रक्त की मात्रा प्रति पर्याप्त endothelial कोशिका सतह तक नहीं पहुंचा जा सकता है । यहां प्रस्तुत मॉडल गोलाकार microcarrier मोतियों की सतह पर संवर्धन चुनाव आयोग द्वारा इन सीमाओं पर काबू पा, इतना है कि एक चुनाव आयोग की सतह के लिए रक्त अनुपात & #62; 16 सेमी2/mL तक पहुंचा जा सकता है, जो छोटे धमनियों या नसों में स्थिति के समान है, और जिसमें ईसी सरफेस द्वारा खून की "नेचुरल" एंटिकोगुलेशन को अनुमति देने के लिए पर्याप्त बताया गया था । 3 , 4 पूरे रक्त का उपयोग इस सेटिंग में जोड़े गए थक्का के बिना किया जा सकता है । रक्त के नमूनों प्रयोग और साइटोकिंस के दौरान एकत्र किया जा सकता है, जमावट कारकों और घुलनशील पूरक सक्रियण मार्करों का पता लगाया जा सकता है और मात्रा. इसके अलावा, चुनाव आयोग लेपित microcarrier मोती पूरक के लिए विश्लेषण किया जा सकता है और immunoglobulin बयान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा चुनाव आयोग सक्रियकरण मार्करों की अभिव्यक्ति । एक और दिलचस्प आवेदन endothelial सेल सक्रियण को रोकने के लिए और, इस प्रकार, जमावट माना जाता है जो दवाओं के परीक्षण भी शामिल है । 5 हालांकि इस मॉडल को पूरी तरह से पशु प्रयोग की जगह नहीं कर सकते, यह एक विधि प्रदान करता है विशिष्ट कार्यात्मक परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए पूर्व vivo कोशिकाओं का उपयोग और इस प्रकार ischemia पर बुनियादी अनुसंधान में इस्तेमाल जानवरों की संख्या को कम/reperfusion चोट या (एक्सो) ट्रांसप्लांटेशन ।

वर्णित मॉडल एक xenotransplantation सेटिंग जिसमें सुअर महाधमनी endothelial कोशिकाओं (PAEC) microcarrier मोतियों पर बड़े हो रहे है और पूरे, गैर anticoagulated मानव रक्त के साथ मशीन की नकल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । विभिंन ट्रांसजेनिक PAEC, इस तरह के पूरक प्रणाली के विनियमन के लिए CD46 के रूप में कई मानव जीन ले जाने और/या जमावट प्रणाली के विनियमन के लिए thrombomodulin (hTBM), उनके थक्कारोधी गुणों के लिए विश्लेषण किया गया । Endothelial सेल सक्रियण, पूरक, और जमावट प्रणालियों कसकर नियंत्रित कर रहे हैं और परस्पर । 6 यह समझने के लिए कि कैसे अलग ट्रांसजेनिक कोशिकाओं आसंजन अणु अभिव्यक्ति और cytokine रिहाई के संबंध में मानव रक्त के संपर्क के बाद व्यवहार महत्वपूर्ण है, glycocalyx और थक्कारोधी प्रोटीन के नुकसान का छप्पर । 7

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Protocol

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< p class = "jove_content" > जर्मन Landrace सूअर (जंगली प्रकार एक स्थानीय फार्महाउस में नस्ल और आणविक पशु प्रजनन और जैव प्रौद्योगिकी, लुडविग-मैक्सीमिलियन विश्वविद्यालय, म्यूनिख, जर्मनी) के संस्थान में नस्ल ट्रांसजेनिक, 30 किलो के बीच वजन ४० किलो, में इस्तेमाल किया गया इस अध्ययन । सभी जानवरों पानी और खाद्य विज्ञापन lib के साथ मानक शर्तों के तहत घर में थे । सभी पशु प्रयोगों के अनुसार ब्रिटेन जानवरों अधिनियम (वैज्ञानिक प्रक्रियाओं) और देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए NIH गाइड, साथ ही स्विस पशु संरक्षण कानून के रूप में प्रदर्शन किया गया । सभी पशु अध्ययन आने के दिशा निर्देशों के अनुरूप । कैंटर पशु चिकित्सा सेवा (बर्न के गुआंगज़ौ, स्विट्जरलैंड) की पशु प्रयोग समिति ने सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दी, अनुमति नहीं । BE70 14/ प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल 3R सिद्धांतों और राज्य के अत्याधुनिक संज्ञाहरण और दर्द प्रबंधन के अनुसार परिष्कृत किया गया जानवरों की संख्या को कम करने और प्रयोगों के दौरान तनाव और दर्द के लिए जानवरों के जोखिम को कम करने के लिए इस्तेमाल कर रहे थे ।

< p class = "jove_content" > बर्न यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल के स्विस क्षेत्राधिकार और आचार दिशा-निर्देशों के अनुसार बंद सिस्टम venipuncture द्वारा स्वस्थ व्यक्तियों से रक्त तैयार किया गया । वाक्यांश & #34; नॉन anticoagulated ब्लड & #34; मतलब यह है कि किसी भी थक्कारोधी से खून का इलाज नहीं हुआ है ।

< p class = "jove_content" > निम्न चरणों बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है । बुनियादी कोशिका संस्कृति बाँझ तकनीक के साथ अपनेपन की आवश्यकता है.

< p class = "jove_title" > 1. अलगाव की PAEC

< p class = "jove_content" > नोट: वक्ष महाधमनी खंड 6 से 10 सेमी की आयु के 3 से 6 महीने के euthanized जर्मन Landrace सूअरों से प्राप्त किए गए (vivo प्रयोगों में अन्य के लिए प्रयुक्त) और तुरंत एक ५००-एमएल ग्लास बोतल में स्थानांतरित परिवहन माध्यम से युक्त (DMEM + 1% पेनिसिलिन/

  1. प्री-कोट एक 6-वेल प्लेट विथ fibronectin १२.५ & #181; g/mL में एमएल 1x और यह ३७ पर एक मशीन में जगह & #176; C for 1 h.
  2. पूर्व गर्म बाँझ पंजाबन 1x और सेल कल्चर मीडियम (DMEM).
  3. परिवहन माध्यम से सुअर महाधमनी बाहर ले.
  4. महाधमनी को polystyrene प्लेट पर रखें ।
  5. धीरे पहले से गर्म पंजाबियों के साथ फ्लश ।
  6. महाधमनी longitudinally को काट कर उसे सुइयों के साथ ठीक कर लें.
  7. भीतरी पोत सतह पर गर्म कोशिका संस्कृति माध्यम जोड़ें ।
  8. महाप्राण fibronectin-कोशिका संस्कृति माध्यम और ताजा सेल कल्चर मीडियम जोड़ें (DMEM 10% FBS के साथ पूरक, 1% पेनिसिलिन/streptomycin और ०.४% Endothelial सेल ग्रोथ मीडियम सप्लीमेंट मिक्स).
  9. सेल संस्कृति माध्यम में एक कपास झाड़ू सोख । भीतरी पोत की सतह के बहुत ऊपर धीरे और एक ही दिशा में धीरे से कपास ऊन कली झाड़ू ।
  10. एक अच्छी तरह से 6-खैर प्लेट दौर से गोल में कोशिकाओं रगड़ ।
  11. बाकी कुओं के लिए भी ऐसा ही करते हैं.
  12. माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें और ३७ पर मशीन में 6-खैर प्लेट जगह & #176; ग, 5% कं 2 .
  13. दूसरे दिन पर मध्यम परिवर्तन और इसे फिर से बदल हर 2-3 दिन ।
  14. जब कोशिकाओं को धाराप्रवाह होने जा रहे हैं, trypsinize कोशिकाओं और उंहें एक T75 कुप्पी (PAEC P1) में बीज ।
< p class = "jove_title" > 2. PAEC लक्षणा

  1. पूर्व कोट एक 8 अच्छी तरह से chamberslide with fibronectin १२.५ & #181; g/मब में एमएल 1x और यह ३७ पर एक मशीन में जगह & #176; ग के लिए 1 ज.
  2. बीज 5 x 10 4 कक्ष/३७ & #176; C.
  3. पर मशीन में रातोंरात मशीन/
  4. के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें + + (पंजाबियों के साथ पूरक CaCl 2 और MgCl 2 ), ३०० & #956; L/ठीक है ।
  5. फिक्स कोशिकाओं ३.७% paraformaldehyde के लिए 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर, २०० & #956; L/
  6. वॉश सेल 3 बार के साथ पंजाब + + , ३०० & #956; L/
  7. Add ३०० & #956; पंजाबन 1x के एल-3% BSA (बफर अवरुद्ध) और कमरे के तापमान पर 30 मिनट छोड़ दें ।
  8. लागू प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटी-VE-cadherin, एंटी-CD31, एंटी vWF) पंजाबियों में पतला 1x-1% BSA-०.०५% डिटर्जेंट, १६० & #956; L/ठीक है और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
  9. धो 3 बार के साथ पंजाब + + (२०० & #956; L/
  10. लागू माध्यमिक एंटीबॉडी और पंजाब में पतला DAPI 1x-1% BSA-०.०५% डिटर्जेंट, १६० & #956; L/ठीक है, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
  11. धो 3 बार के साथ पंजाब + + (२०० & #956; L/
  12. माउंट ग्लिसरॉल आधारित बढ़ते मध्यम और सत्यापित endothelial सेल मार्करों अभिव्यक्ति एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत के साथ स्लाइड ।
    नोट: Culture सुअर महाधमनी endothelial कोशिकाओं में एक T175 कुप्पी (DMEM कम ग्लूकोज मीडियम + 10% FBS, 1% पेनिसिलिन/streptomycin और ०.४% endothelial सेल ग्रोथ मीडियम सप्लीमेंट मिक्स) तक ९०% संगम तक पहुँच गया है । (सीडिंग घनत्व १ x १० कक्ष, ९०% संगम मोटे तौर पर ५ एक्स १० कोशिकाओं के अनुरूप).
< p class = "jove_title" > 3. Microcarrier मोतियों की कोटिंग

  1. एक ५०-एमएल ट्यूब में ४२ मिलीलीटर कोलेजन समाधान के साथ Microcarrier मोतियों की 7 मिलीलीटर मिश्रण (१०० & #956; g/एमएल, एक ०.२% एसिटिक एसिड समाधान में पतला) और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
  2. धो मोती दो बार पंजाब के 25 मिलीलीटर पीएच ७.४ के साथ (पंजाब के 25 मिलीलीटर जोड़ें, प्लास्टिक के साथ अच्छी तरह से मिश्रण है और इंतजार जब तक मोती नीचे बसा रहे है तो supernatant और दोहराने) और DMEM मध्यम के 25 मिलीलीटर के साथ एक बार छोड़ दें ।
  3. ५०-एमएल ट्यूब मध्यम १९९ 10% FBS के साथ पूरक के 10mL के साथ में मोतियों को कवर, 1% पेनिसिलिन/streptomycin, 1% L-Glutamine, ०.४% Endothelial सेल ग्रोथ मीडियम सप्लीमेंट मिक्स और 25 & #956; एल ऑफ हेपरिन (५००० IU/एमएल) और 10 मिनट के लिए equilibration की अनुमति आगे उपयोग करने से पहले.
< p class = "jove_title" > 4. कोशिकाओं का संग्रह

  1. PAEC युक्त T175 कुप्पी से सेल संस्कृति माध्यम को हटाने और पंजाब पीएच ७.४ के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. निकालो T175 कुप्पी से.
  3. Trypsin के 5 मिलीलीटर जोड़ें-०.०५% EDTA और 3-4 मिनट के लिए मशीन ३७ & #176; C.
  4. सेल संस्कृति माध्यम के 15 मिलीलीटर के साथ कुप्पी धोने और निलंबन एक ५०-एमएल ट्यूब में स्थानांतरण द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा ।
  5. कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए १,२०० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक, अतिरिक्त मध्यम निकालें और सेल संस्कृति माध्यम के 5 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
< p class = "jove_title" > 5. चमचे में कोशिकाएं बोने की कुप्पी

  1. सेल संस्कृति माध्यम के 20 मिलीलीटर सेल निलंबन और reसस्पेंड करने के लिए जोड़ें ।
  2. 20 मिलीलीटर सेल संस्कृति मध्यम (w/५००-मिलीलीटर चुंबकीय सरगर्मी कुप्पी में जोड़ें ।
  3. कदम ३.३ से धोया microcarrier मोतियों के लिए कोशिकाओं को जोड़ने और एक 25 मिलीलीटर सीरम पिपेट के साथ ध्यान से मिश्रण ।
  4. चुंबकीय स्पिनर कुप्पी में मोती/सेल मिश्रण स्थानांतरण ।
  5. कुल्ला ५०-एमएल ट्यूब सेल संस्कृति मध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ।
  6. स्पिनर कुप्पी में सेल संस्कृति माध्यम के एक अतिरिक्त ८५ मिलीलीटर जोड़ें और यह रात भर मशीन में ३७ & #176 पर; सी एक शेखर पर (१०० एक्स जी, मिश्रण अंतराल: 3 मिनट हर ४५ मिनट).
  7. जोड़ें ५० एमएल सेल संस्कृति मध्यम (कुल मात्रा २०० मिलीलीटर) और अतिरिक्त 24 के लिए सरगर्मी जारी रखें ३७ & #176 पर; C एक शेखर पर (१०० x g, मिश्रण अंतराल: 3 मिनट हर ४५ मिनट).
  8. जोड़ बेरंग RPMI मध्यम (पूरक के साथ 10% FBS, 1% पेनिसिलिन/streptomycin, 1% L-Glutamine, ०.४% के Endothelial सेल विकास मध्यम पूरक मिश्रण और 25 & #956; L of हेपरिन) तक कुल मात्रा का ३२० मिलीलीटर तक पहुँच गया है.
  9. हर ४८ एच माध्यम की जगह: पुराने मध्यम के १०० मिलीलीटर निकालें और ताजा पूरक बेरंग RPMI के १०० मिलीलीटर जोड़ें ।
  10. संस्कृति 5 से 7 दिनों के लिए कोशिकाओं । समय कोशिका लेपित मोतियों की संगम अवस्था पर निर्भर करता है ।
< p class = "जोve_title "> 6. संगम सत्

  1. कलेक्ट २०० & #956; सेल लेपित मोतियों की एल एक पिपेट का उपयोग कर और उंहें एक इंच ट्यूब में स्थानांतरण ।
  2. धो के मोतियों को 3 बार ६०० & #956 के साथ; पंजाबज़ 1x के एल (पंजाबियों जोड़ें, ट्यूब झुकाव और धीरे मिश्रण कोशिकाओं की टुकड़ी से बचने के लिए, नीचे बसने के लिए मोती इंतजार, पंजाबियों और दोहराने को छोड़).
  3. 10 मिनट के लिए मोतियों को जोड़कर ठीक कर २०० & #956; parapicric अम्ल के एल.
  4. धो 3 बार ६०० & #956 के साथ; पंजाबज़ 1x के L
  5. DAPI पंजाब में पतला जोड़ें 1x और 10 min.
  6. के लिए मशीन
  7. एक गिलास स्लाइड पर मोती हस्तांतरण और एक coverslip लागू ग्लिसरॉल आधारित बढ़ते माध्यम का उपयोग कर ।
  8. एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत मोतियों की कल्पना ।
< p class = "jove_title" > 7. प्रयोगात्मक प्रक्रिया

  1. चुंबकीय सरगर्मी से सेल लेपित मोती निकालें कुप्पी (प्रक्रियाओं बाँझ शर्तों के तहत किया जा करने के लिए नहीं है) एक 10-एमएल सीरम पिपेट के साथ और उन्हें 12 मिलीलीटर राउंड-बॉटम के ट्यूब में हस्तांतरण.
  2. चलो मोती नीचे (1-2 मिनट के आसपास) बसने और अतिरिक्त मध्यम निकालें ।
  3. ट्यूबों के लिए और अधिक मोती जोड़ने जब तक हर ट्यूब बिल्कुल मोती के 2 मिलीलीटर शामिल हैं ।
  4. प्रत्येक ट्यूब के लिए 5 मिलीलीटर स्पष्ट RPMI जोड़ें और ध्यान से एक 10 मिलीलीटर सीरम पिपेट.
  5. का उपयोग कर मिश्रण
  6. चलो मोती नीचे बसने और अतिरिक्त मध्यम निकालें ।
  7. RPMI के साथ एक और समय धोने की प्रक्रिया को दोहराने और सभी अतिरिक्त माध्यम को हटा दें ।
< p class = "jove_title" > 8. गैर के साथ मशीन anticoagulated रक्त

  1. ध्यान से और धीरे (न तो जेट और न ही vacutainers का उपयोग) एक स्वस्थ स्वयंसेवक से रक्त आकर्षित और यह 9 मिलीलीटर तटस्थ के ट्यूब (कोई थक्कारोधी) में इकट्ठा ।
  2. धीरे से एक 10 मिलीलीटर सीरम पिपेट के साथ रक्त के 8 मिलीलीटर हस्तांतरण सेल लेपित मोती के 2 मिलीलीटर (कुल मात्रा 10 मिलीलीटर होगा) युक्त के प्रत्येक में । हमेशा समय से पहले ईसी सक्रियण से बचने के लिए रक्त या मोतियों की किसी न किसी से निपटने से बचें । प्रक्रिया लेता है 1-2 min.
  3. ध्यान से रक्त/मनका मिश्रण को बराबर मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए झुकाव और तेल फिल्म के साथ टोपी सील ।
  4. जगह एक क्षैतिज झुकाव मेज पर ट्यूबों (केवल कोमल झुकाव सेटिंग्स के साथ) एक ३७ & #176 के अंदर, सी मशीन और रिकॉर्ड थक्के बार ।
    1. निर्धारित समय अंतराल पर, जैसे 10, 20, 30, ५०, ७०, ९० मिनट के बाद, सीरम या प्लाज्मा विश्लेषण के लिए रक्त-मनका मिश्रण के कम से कम १.५-2 मिलीलीटर निकालें.
      नोट: 6 समय अंक के लिए हम अधिक से अधिक 3 कोशिकाओं के एक समूह के भीतर दोहराने की, के रूप में रक्त का नमूना अलग ट्यूबों में किया जाएगा सुझाव ।
    2. सीरम के संग्रह के लिए
    3. , coagulate के लिए रक्त छोड़ दें । प्लाज्मा इकट्ठा करने के लिए, रक्त के नमूनों को जोड़ने से पहले 2 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए EDTA या साइट्रेट जोड़ें ।
    4. स्टोर बर्फ पर ट्यूबों, २,५०० पर 10 मिनट के लिए एक्स जी में 4 & #176; सी और स्टोर सीरम/प्लाज्मा पर ८० & #176; c तक उपयोग.
      नोट: सामग्री पर विवरण सामग्री के तालिका में प्रदान की जाती हैं

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Representative Results

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ऑफ कल्चर के 7-10 दिनों के बाद ऑफ स्पिनर कुप्पी(चित्रा १) में कोशिकाएँ धाराप्रवाह थीं, microcarrier मोतियों की पूरी सतह(चित्रा २) को कवर कर रही थीं. microbeads पर चुनाव आयोग के एक गैर-धाराप्रवाह monolayer के थक्के समय में एक चिह्नित कमी को बढ़ावा मिलेगा, क्योंकि प्रभावित राज्य के सत्यापन एक महत्वपूर्ण कदम है microcarrier ' मोती सतह दिया जोरदार समर्थक कौयगुलांट (थक्के समय: 4 ± 1 मिनट) ( चित्रा 3) ।

एक अंय महत्वपूर्ण बिंदु है जो ध्यान की जरूरत है झुका प्लेट की गति है । एक उच्च झुकाव गति रक्त के थक्के में वृद्धि होगी । अगर चुनाव आयोग के एक monolayer microcarrier मोतियों की सतह पर मौजूद था थक्के समय की एक लालसा मनाया जा सकता है । GalTKO/hCD46/hTBM ट्रांसजेनिक PAEC के उपयोग के थक्के समय में एक महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई WT PAEC की तुलना में (चित्रा 3) । लड़की के अभाव-α-1, 3-PAEC पर लड़की xenoantigen (GalTKO) थक्के समय में वृद्धि (PAEC WT के लिए 25 ± 8 मिनट और PAEC GalTKO के लिए ६८ ± 30 मिनट) दिखाया । थक्के समय में एक और मजबूत वृद्धि मनाया गया जब PAEC GalTKO/hCD46/hTBM microcarrier मोती (२०५ ± ३२ मिनट) है, जो दोनों पूरक (hCD46) और जमावट प्रणालियों (hTBM) के एक सफल मॉडुलन पता चलता है पर मौजूद थे । प्रयोग के अंत में परिभाषित किया जाता है जब एक दिखाई थक्का बना है । समूह के एक ही के नमूनों के भीतर परिवर्तनशीलता दोनों अंतर परख-परिवर्तनशीलता और रक्त दाता के कारण है । हर प्रयोग 3 दोहराने और हर बार एक अलग रक्त दाता के लिए डेटा की विश्वसनीयता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । प्रत्येक दाता के लिए, एक रक्त विश्लेषण (प्लेटलेट काउंट, WBC, आरबीसी, HCT और अंय मापदंडों) बाहरी स्वास्थ्य प्रयोगशालाओं द्वारा किया गया था । चित्रा 3 में दिखाए गए परिणाम अलग अलग रक्त दाताओं के साथ प्रदर्शन किया विभिन्न प्रयोगों से प्राप्त कर रहे हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: Microcarrier के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व-परख आधारित है । (क) चुनाव आयोग T175 कुप्पी में विस्तार किया और (ख) स्पिनर कुप्पी में एक साथ कोलेजन-लेपित microcarrier मोतियों के साथ हस्तांतरित कर रहे हैं । (ग) ताजा गैर anticoagulated रक्त एक स्वस्थ स्वयंसेवक से एकत्र किया जाता है, (डी) चुनाव आयोग लेपित microcarrier मोतियों के साथ मिश्रित है, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन । वाक्यांश "गैर anticoagulated रक्त" का मतलब है कि रक्त किसी भी थक्कारोधी के साथ इलाज नहीं किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: चुनाव आयोग पर धुंधला इम्यूनोफ्लोरेसेंस-लेपित Microcarrier मोती । Microcarrier मोतियों को प्राप्त किया गया था और CD31 के लिए दाग (PECAM-1) के लिए प्रवाह का आकलन । नाभिक नीले (DAPI) में दाग थे और CD31 लाल (Cy3) में दाग था । स्केल बार: १०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: अलग चुनाव आयोग के थक्के बार. थक्के बार नेत्रहीन निर्धारित किए गए थे और प्रयोग के अंत में परिभाषित किया गया था जब एक दृश्य थक्का मनाया गया था । एक मजबूत procoagulant प्रभाव मनाया जब गैर चुनाव आयोग लेपित microcarrier मोती पूरे गैर anticoagulated मानव रक्त के संपर्क में थे । लड़की के अभाव-α-1, 3-PAEC पर लड़की xenoantigen (GalTKO) थक्के समय में वृद्धि (PAEC WT के लिए 25 ± 8 मिनट और PAEC GalTKO के लिए ६८ ± 30 मिनट) दिखाया । PAEC GalTKO/hCD46/hTBM microcarrier मोतियों पर मौजूद थे, जो दोनों पूरक (hCD46) और जमावट प्रणालियों (hTBM) का एक सफल मॉडुलन पता चलता है जब थक्के समय में एक और वृद्धि मनाया गया था. डेटा मतलब ± मानक विचलन के रूप में दिखाया जाता है । सांख्यिकीय विश्लेषण Bonferroni सुधार के साथ कई तुलना के लिए ANOVA का उपयोग किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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यहां प्रस्तुत मॉडल जमावट से संबंधित अध्ययन और चुनाव आयोग के साथ अपनी बातचीत के विभिन्न पहलुओं के विश्लेषण की अनुमति देने के अध्ययनों के लिए उपयुक्त है । 8 xenotransplantation अनुसंधान में, यह मानव रक्त 9के साथ मशीन के बाद अलग आनुवंशिक रूप से संशोधित सुअर ईसीएस के थक्कारोधी गुणों का परीक्षण करने के लिए एक उपयोगी प्रणाली है ।

प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम है कि प्रयोग शुरू करने से पहले microbeads की पूरी सेल कवरेज (प्रवाह) सुनिश्चित करने के उन है और सावधान संग्रह और गैर anticoagulated पूरे रक्त की हैंडलिंग से संबंधित उन समयपूर्व से बचने के लिए उच्च कतरनी तनाव के कारण प्लेटलेट सक्रियण, जो हो सकता है अगर vacutainers रक्त इकट्ठा करने के लिए उपयोग किया जाता है । 10 फिर भी, इस प्रणाली के एक पुनर्संचारी बंद प्रणाली और शारीरिक कतरनी तनाव है जो बेहतर vivo स्थितियों में प्रतिनिधित्व करेंगे के अभाव सहित कुछ सीमाएं हैं ।

इन सीमाओं के बावजूद, वर्णित मॉडल वर्तमान में मौजूदा मॉडलों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है । कारण microcarrier मोतियों के उपयोग के लिए, चुनाव आयोग की सतह रक्त की मात्रा के अनुपात में वृद्धि हुई है, की स्थापना की अनुमति विरोधी कौयगुलांट और विरोधी भड़काऊ वातावरण और गैर anticoagulated पूरे खून का उपयोग करें । वर्तमान फ्लैट में बिस्तर सेल संस्कृति मॉडल, यह संभव नहीं है और तंत्र जो रक्त चुनाव आयोग सक्रियण के कारण थक्के शामिल इसलिए अक्सर पशु प्रयोग के उपयोग की आवश्यकता है । भाग में, इस वर्णित microcarrier मनका मॉडल का उपयोग कर बचा जा सकता है ।

इसके अलावा, इस प्रणाली के आवेदनों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए अनुमति देता है । अपनी बहुमुखी प्रतिभा अलग दवाओं या यौगिकों जो न केवल करने के लिए (एक्सो-) प्रत्यारोपण लेकिन यह भी मानव रोगों के लिए संबंधित है परीक्षण की संभावना में रहता है । endothelium और जमावट प्रणाली पर दवाओं के प्रभाव इम्यूनोफ्लोरेसेंस, एलिसा और मल्टीप्लेक्स निलंबन सरणी विश्लेषण द्वारा आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है । यह पहले एक अध्ययन में मानव thrombomodulin के ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के प्रभाव पर एक xenotransplantation सेटिंग में किया गया था । 11

वर्णित विधि का एक संभव संशोधन गैर का संग्रह हो सकता है anticoagulated पूरे रक्त सीधे ट्यूबों जो पहले सेल लेपित मोतियों के साथ भर रहे है क्रम में पिपेट का उपयोग करके हवा से संपर्क करें और रक्त सक्रियण को कम करने के लिए । मानव महाधमनी endothelial कोशिकाओं (HAEC) का उपयोग एक दिलचस्प नियंत्रण हो सकता है और पहले से ही भविष्य की योजनाओं में शामिल किया गया है । ट्यूब के आर्गन टॉपिंग के थक्के झरना के सक्रियण संपर्क करने के लिए नेतृत्व करने के लिए जाना जाता है, जो हवा के साथ गैर anticoagulated रक्त के संपर्क को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि रक्त भी जल्दी से तैयार की है, उदाहरण के लिए रबर stopcocks के साथ निर्वात ट्यूब का उपयोग करके और एक ठीक जेट में ट्यूब में रक्त शुरू करने, तो प्लेटलेट्स सक्रिय हो जाते हैं और जमावट जल्दी ही हो जाएगा. प्लेटलेट सक्रियण से बचने के लिए, बड़े व्यास hypodermic सुई (21ɢ-16ɢ) का उपयोग करें ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (SNSF, ग्रांट नो 320030_156193) ने समर्थन दिया था । लेखकों ने डॉ॰ Benoît Werlen को Biosilon microcarrier मोतियों की माला प्रदान करने के लिए धन्यवाद दिया । हम भी microcarrier मनका मॉडल की स्थापना के साथ मदद के लिए प्रो हंस पीटर कोल और प्रो आंद्रे Haeberli धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAEC Isolated from pig aorta in our Lab
Microcarrier beads (Biosilon) Thermo Fisher Scientific 160-250
Collagen I, Bovine Gibco A10644-01
DMEM Gibco 21885-025
Medium 199 Sigma M7528
RPMI Gibco 32404-014
Neutral tubes Sarstedt 02.1726.001
Polypropylene tubes Simport T406-2A
Stirrer flasks Tecnomara
Biological stirrer Brouwer MCS-104S
Rat anti CD31 R&D Systems MAB33871 Dilution 1:100
Goat anti-rat IgG-Cy3 Jackson Immuno Research 112-166-003 Dilution 1:500
Goat anti VE-cadherin Santa Cruz sc-6458 Dilution 1:100
Rabbit anti vWF DAKO A0082 Dilution 1:100
Dk anti Gt IgG – Alexa 488 Molecular Probes A11055 Dilution 1:500
Goat anti Rabbit - FITC Southern Biotech 4050-02 Dilution 1:500
DAPI Sigma 32670-25MG-F Dilution 1 µg/mL
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
FBS Gibco 10270-106 Concentration: 10% in cell culture medium
Adapter Sarstedt 14.1205
Confocal microscope Carl Zeiss LSM 710
Image analysis software Image J Available for free at: https://imagej.net
Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix PromoCell C-39216 2 mL in 500 mL of DMEM
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Concentration: 1% in cell culture medium
L-Glutamine Gibco 25030-024 Concentration: 1% in cell culture medium
Heparinun natricum Drossa Pharm AG Stock concentration: 5000 U.I./ mL
Chamberslides Bioswisstec AG 30108
CaCl2 x 2H2O Merck 2382.0500
MgCl2 x6 H2O Merck 1.5833.1000
Tween 20 Axon Lab AG 9005-64-5
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7030
Glycergel mounting medium Dako C0563

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References

  1. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
  2. Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
  3. Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
  4. Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
  5. Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
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  7. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
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  9. Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
  10. Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
  11. Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).
3 डी सेल संस्कृति और गैर anticoagulated पूरे रक्त का उपयोग कर Endothelial कोशिकाओं के थक्कारोधी और विरोधी भड़काऊ गुणों का आकलन
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Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).More

Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).

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