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Medicine

3D 세포 배양 및 비 anticoagulated 전 혈을 사용 하 여 내 피 세포의 항 응 혈 약 그리고 항 염증 제 속성에 대 한 평가

doi: 10.3791/56227 Published: September 5, 2017

Summary

우리는 전체, 비 anticoagulated 혈액에서 응고의 분석과 연구를 허용 하는 체 외에서 모델 제시. 그리고 시스템에 anticoagulation 건강 한 내 피 세포의 자연 anticoagulation 효과에 따라 내 피 세포 활성화 응고 귀 착될 것 이다.

Abstract

Vivo에서, 내 피 세포는 혈액 순환의 자연 anticoagulation에 대 한 중요 한. 따라서, 내 피 세포 활성화 혈액 응고에 지도 한다. 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해에서 뿐만 아니라 장기 이식 xenotransplantation를 포함 하 여 미리 형성 된 안티 기증자 항 체의 존재 처럼 많은 임상 상황에서이 현상이 관찰 됩니다. 3R 표준 (감소, 교체 및 수정), 생체 외에서 모델 내 피 세포의 효과 연구에 따르면 동물 실험을 감소 시키기 위하여 활성화 혈액 응고에 매우 바람직한 것 이다. 그러나, 내 피 세포 배양의 일반적인 평판 시스템은 자연, 내 피-중재 anticoagulation에 대 한 충분 한 혈액의 mL 당 피 내 막의 1-5 c m2 의 표면-볼륨 비율을 제공 합니다. Microcarrier 구슬에 내 피 세포를 배양 하는 것은 표면 볼륨 비율 40-160 cm2/mL을 증가할 수 있습니다. 이 증가 비율은 전체 혈액의 "자연" anticoagulation 되도록 충분 한 응고의 사용을 피할 수 있도록 합니다. 여기는 생체 외에서 microcarrier 기반 시스템 전체를 비 anticoagulated 인간의 혈액의 응고에 돼지 내 피 세포의 유전자 조작의 효과 공부 설명 되어 있습니다. 기술된 분석 결과, 기본 돼지 대동맥 내 피 세포, 중 야생 종류 (WT)에서 또는 유전자 변형 인간 CD46 thrombomodulin, 했다 microcarrier 구슬에 성장 그리고 다음 갓 그려진된 비 anticoagulated 인간의 혈액에 노출. 이 모델은 측정 및 활성화로 사이토카인 방출의 정량화에 대 한 보완 및 혈액 플라스마에 응고의 마커 수 있습니다. 또한, 활성화 된 내 피 세포와 면역 글로불린의 증 착의 이미징, 보완 및 응고 단백질 endothelialized 구슬에 confocal 현미경 검사 법에 의해 수행 되었습니다. 이 분석 결과 또한 내 피 세포 활성화 하 고, 따라서, 응고를 방지 하는 약물 테스트를 사용할 수 있습니다. 그런 수사에 사용 되는 동물의 수를 줄이기 위해 그것의 잠재력, 위에 설명 된 분석 결과 수행 하기 쉽고 일관 되 게 재현할 수입니다.

Introduction

단층 선 루멘 혈관의 내 피 세포 (EC)의 혈관 내 피에 의하여 이루어져 있다. 생리 적인 상태에서 무부하 EC는 응고 제와 항 염증 제 환경의 유지 보수에 대 한 책임이 있습니다. 1 이 응고 제와 항 염증 단백질 EC 표면에 표현에 의해 중재 됩니다. 예를 들어 EC 활성화 국 소 빈 혈 또는 reperfusion로 인 한 부상 또는 혈관 거부 (이종-) 이식의 내 피는 응고 제와 항 염증 상태에서 프로 응집과 프로-염증 성 변화에 장기 결과 상태입니다. 1

매혹적이 고 복잡 한 상호작용으로 모방 하는 체 외에서 모델 endothelium 및 응고 요인 연구 가능한 vivo에서 상황 매우 바람직한 있습니다. 기존의 시험관에 응고 분석 실험을 짓는 일반적인 제한 anticoagulated 혈액 응고 중재 효과의 분석 힘든 게의 사용 이며 심지어 recalcification citrated 전체 혈액의 복제 수 없습니다. 신선한 비 anticoagulated 혈액으로 얻을 수 있는 결과. 2 사실, 전통적인 침대 형 세포 배양 시스템에서 그것은 혈액 볼륨 당 충분 한 내 피 세포 표면에 도달 하실 수 없습니다 endothelium의 항 응 혈 약 속성을 이용할 수 있습니다. 여기에 제시 된 모델 구형 microcarrier 구슬의 표면에 EC를 경작 하 여 이러한 한계를 극복 있도록 EC 표면 혈액 비율의 > 작은 arterioles 또는 정 맥, 상황에 비슷한 16 cm2/mL 도달 될 수 있다 고 EC 표면에 의해 혈액의 "자연" anticoagulation 수 있도록 충분 한 것 설명 했다. 3 , 4 전체 혈액이이 설정에서 추가 응고 없이 사용할 수 있습니다. 혈액 샘플을 실험 하 고 cytokines, 응고 요인 동안 수집 될 수 있습니다 고 수용 성 보수 활성화 마커를 감지 및 측정할 수 있습니다. 또한, EC 코팅 microcarrier 구슬 EC 활성화 마커의 식으로 보완 및 면역 증 착 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석 수 있습니다. 또 다른 흥미로운 응용 프로그램 내 피 세포 활성화 하 고, 따라서, 응고를 방지 하는 약물의 테스트 포함 되어 있습니다. 5 이 모델을 완전히 동물 실험 대체 수 없습니다, 비록 특정 기능 가설 비보 전 셀을 사용 하 여 테스트 하 고 따라서 국 소 빈 혈 또는 reperfusion에 기초 연구에 사용 된 동물의 수를 줄일 수 있는 방법을 제공합니다 부상 또는 (xeno) 이식.

설명된 모델 모방 xenotransplantation 돼지 대동맥 내 피 셀 (PAEC) microcarrier 구슬에 성장 하 고 전체, 비 anticoagulated 인간의 피와 알을 품는 사용 되었다. 보완 시스템 thrombomodulin 응고 시스템의 규정 (hTBM)의 규칙을 위한 CD46 등 여러 가지 인간 유전자를 운반 하는 다른 유전자 변형 PAEC 그들의 항 응 혈 약 속성에 대 한 분석 했다. 내 피 세포 활성화, 보수, 및 응고 시스템 긴밀 하 게 제어 하 고 상호 연결. 따라서 다른 유전자 변형 세포 접착 분자 식 및 cytokine 릴리스, 인간의 혈액에 노출 된 후 동작 하는 방법을 이해 하는 것이 중요 6 은 항 응 혈 약 단백질의 손실과 glycocalyx 흘리기. 7

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Protocol

독일 Landrace 돼지는 (야생 타입 지역 농가에서 사육 하 고 유전자 변형 동물 사육 분자 연구소와 생명 공학, 루드비히 막시밀리안 대학, 뮌헨, 독일에서 자란), 무게 40 k g, 30 킬로그램 사이 사용 되었다 이 연구는. 모든 동물이 물과 음식을 임의로 광고와 표준 조건 하에서 보관 되어 있었다. 모든 동물 실험은 스위스 동물 보호 법률 뿐만 아니라 치료와 실험 동물의 사용에 대 한 영국 동물 (과학적인 절차) 고 NIH 가이드에 따라 수행 했다. 모든 동물 연구 도착 지침 준수. Cantonal 수의학 서비스 (구획의 베른, 스위스)의 동물 실험 위원회 아니 모든 동물 절차를, 허가 승인 했다. BE70/14입니다. 실험 프로토콜 3R 원칙에 따라 세련 되었고 최신의 마 취와 통증 관리 동물의 수를 최소화 하 고 실험 하는 동안 스트레스와 통증을 동물의 노출을 줄일 하는 데 사용 했다.

피는 건강 한 개인에서 베른 대학 병원의 스위스 관할 및 윤리 지침에 따라 폐쇄 시스템 venipuncture에 의해 그려진 했다. 문구 " anticoagulated 비 혈액 " 어떤 응고 제와 혈액은 치료 되지 의미.

다음 단계는 무 균 조건 하에서 수행 됩니다. 기본 셀 문화 무 균 기법으로 친숙이 필요.

1. 절연의 PAEC

참고: 6 ~ 10 cm의 흉부 대동맥 세그먼트 3 ~ 6 개월의 나이 (다른 vivo에서 실험을 위해 사용)의 즉시 안락사 독일 Landrace 돼지에서 가져온 포함 하는 전송 매체 (DMEM + 1% 페니실린/스) 500 mL 유리병으로 옮겨.

  1. 미리 fibronectin 12.5 µ g/mL PBS 1와 6 잘 플레이트 코트 x 1 h. 위해 37 ° C에는 인큐베이터에 배치
  2. 미리 따뜻한 무 균 PBS 1 x와 셀 문화 매체 (DMEM).
  3. 전송 매체에서 돼지 대동맥 꺼내.
  4. 폴리스 티 렌 격판덮개에 대동맥 장소.
  5. 부드럽게 미리 따뜻한 PBS를 가진 플러시.
  6. 경도 대동맥을 잘라 고 바늘으로 수정.
  7. 내부 용기 표면에 따뜻한 세포 배양 매체 추가.
  8. Fibronectin 세포 배양 매체를 발음 하 고 신선한 세포 배양 매체 (DMEM 10 %FBS와 1% 페니실린/스 내 피 세포 성장 매체 보충 믹스의 0.4% 보충) 추가.
  9. 세포 배양 매체에서 한 면봉을 담근 다. 같은 방향으로 부드럽게 그리고 천천히 맨 내부 용기 표면에 목화 꽃 봉 오리를 면봉.
  10. 6 잘 플레이트의 한 잘에 셀 라운드 라운드 문.
  11. 우물의 나머지 부분에 대 한 동일한 작업을 수행.
  12. 현미경 세포를 확인 하 고 37 ° c, 5% CO 2 배양 기에서 6-잘 접시를 놓습니다.
  13. 둘째 날에는 매체를 변경 하 고 다시 2-3 일 마다 변경.
  14. 셀 confluent 될 거 야, trypsinize 셀 고 T75 플라스 크 (PAEC P1)으로 씨앗.

2. PAEC 특성화

  1. 미리 코트 fibronectin 12.5 µ g/mL PBS 1와 8 잘 chamberslide x 1 h. 위해 37 ° C에는 인큐베이터에 배치
  2. 5 x 10 4 셀/잘 씨와 37에 인큐베이터에서 밤새 품 어 ° c.
  3. PBS + + (PBS CaCl 2와 MgCl 2 보충), 두 번 셀 세척 300 μ/잘.
  4. 실내 온도에, 200 μ/잘 10 분 3.7 %paraformaldehyde 셀 수정.
  5. 셀 3 회 PBS + +, 300 μ/잘 씻어.
  6. PBS 1 x-3_% BSA (블로킹 버퍼)의 300 μ를 추가 하 고 실 온에서 30 분 두고.
  7. 1 차 항 체 (안티-VE-cadherin, 안티 CD31, 안티-vWF) PBS 1x-1%BSA-0.05% 세제, 160 μ/잘에에서 희석 적용 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.
  8. PBS + + (200 μ/잘)를 가진 3 번 세척.
  9. 이차 항 체와 DAPI에서 PBS 1x-1%BSA-0.05% 세제, 160 μ, 잘 희석 적용 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.
  10. PBS + + (200 μ/잘)를 가진 3 번 세척.
  11. 글리세롤 기반된 설치 매체와 함께 슬라이드를 탑재 하 고 내 피 세포 마커 식 형광 현미경 확인.
    참고: 90% 합류까지 T175 플라스 크 (DMEM 낮은 포도 당 매체 + 10 %FBS, 1% 페니실린/스와 내 피 세포 성장 매체 보충 믹스의 0.4%)에 문화 돼지 대동맥 내 피 세포에 도달. (시드 밀도 1 x 10 6 셀, 90% 합류 해당 약 5 x 10 6 셀).

3. Microcarrier 구슬의 코팅

  1. 콜라겐 솔루션 50 mL 튜브 (100 μ g/mL, 0.2% 초 산 용액에 희석)의 42 mL와 함께 microcarrier 구슬의 7 mL를 혼합 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.
  2. 구슬 두 번 PBS pH 7.4의 25 mL로 씻고 (25 mL PBS의 추가, 잘와 함께 혼합에 피펫으로 상쾌한 및 반복 구슬 다음 삭제 정착은 될 때까지 기다립니다) DMEM 매체의 25 mL와 함께 한 번.
  3. 커버 매체 199 10% 보충의 10 mL 50 mL 튜브에 구슬 FBS, 1% 페니실린/스, 1 %L-글루타민, 내 피 세포 성장 매체 보충 믹스의 0.4% 및 25 μ 헤 파 린 (5000 IU/mL)의 10 분에 대 한 평형 수 더 사용 하기 전에.

4. 세포를 수집

  1. PAEC 포함 된 T175 플라스 크에서 세포 배양 매체를 제거 하 고 PBS pH 7.4의 5 mL을 추가.
  2. T175 플라스 크에서 PBS 제거.
  3. Trypsin-0.05% EDTA의 5 mL을 추가 하 고 37에서 3-4 분 동안 품 어 ° c.
  4. 세포 배양 매체의 15 mL로 플라스 크를 rinsing 하 여 세포를 수집 하 고 전송 50 mL 튜브에 서 스 펜 션.
  5. 실 온에서 8 분 1200 x g에서 세포를 원심 초과 매체를 제거 하 고 세포 배양 매체의 5 ml에서는 펠 릿 resuspend.

5. 활동가 플라스 크로 셀 시드

  1. 세포 현 탁 액을 세포 배양 매체의 20 mL를 추가 하 고 resuspend.
  2. 자력 500 mL 플라스 크에 20 mL 세포 배양 (세포) 제외 추가.
  3. 단계 3.3에서에서 씻어 microcarrier 구슬에 셀을 추가 하 고 신중 하 게 25 mL 혈 청 학적인 피 펫 혼합.
  4. 자석 스피너 플라스 크에 구슬/셀 혼합 전송.
  5. 나머지 수집 하 세포 배양 매체의 10 mL 50 mL 튜브 린스.
  6. 스피너 플라스 크에 세포 배양 매체의 추가적인 85 mL를 추가 하 고 통에 37 ° C에서 하룻밤 인큐베이터에 배치 (100 x g, 혼합 간격: 3 분 마다 45 분).
  7. 세포 배양 매체의 50 mL를 추가 (전체 용량 200ml) 추가 24 h에 대 한 교 반 통에 37 ° C에서 계속 (100 x g, 혼합 간격: 3 분 마다 45 분).
  8. 추가 무색 RPMI 매체 (보충 10 %FBS, 1% 페니실린/스, 1 %L-글루타민, 내 피 세포 성장 매체 보충 믹스의 0.4% 및 헤 파 린의 25 μ) 320 mL 전체 볼륨에 도달할 때까지.
  9. 대체 매체 오래 된 매체의 모든 48 h: 제거 100 mL 및 100 mL 신선한 보충된 무색 RPMI의 추가.
  10. 5 ~ 7 일에 대 한 셀을 문화. 시간 셀 코팅 구슬의 합류 상태에 따라 달라 집니다.
< p 클래스 = "조ve_title "> 6. 합류 확인

  1. 는 피 펫을 사용 하 여 셀 코팅 구슬의 200 μ를 수집 하 고 폴 리 프로필 렌 튜브에 그들을 전송.
  2. 세척 3 회 PBS 1의 600 μ와 구슬 x (PBS, 추가 기울기는 튜브 셀의 분리를 피하기 위해, 구슬 대기를 부드럽게 혼합 정착, PBS 삭제 및 반복).
  3. Parapicric 산의 200 μ를 추가 하 여 10 분 동안 구슬 해결.
  4. X. PBS 1의 600 μ로 3 번 세척
  5. 추가 DAPI에서 PBS 1 희석 x 10 분에 대 한 품 어 및
  6. 구슬 유리 슬라이드에 전송과 coverslip 글리세롤 기반 설치 매체를 사용 하 여 적용.
  7. Confocal 현미경 구슬 시각화.

7. 실험 절차

  1. 10 mL 혈 청 학적인 피 펫으로 셀 코팅 구슬 (절차 없는 메 마른 조건 하에서 해야 할) 자력 플라스 크에서 제거 하 고 12 mL 라운드-하단 폴 리 프로필 렌 튜브에 그들을 전송.
  2. 구슬과 정착 (약 1-2 분) 초과 매체를 제거 하자.
  3. 구슬의 정확히 2 mL를 포함 하는 모든 튜브까지 관에 더 많은 구슬을 추가.
  4. 5 mL 분명 RPMI 각 튜브를 추가 하 고 신중 하 게 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 혼합.
  5. 구슬과 정착 초과 매체를 제거 하자.
  6. RPMI와 한 번 더 세척 절차를 반복 하 고 모든 초과 매체 제거.

8. 보육 비-anticoagulated 피

  1. 신중 하 고 천천히 (를 사용 하 여 jet도 vacutainers) 혈액 건강 한 지원자에서 그리고 9 mL 중립 폴 리 프로필 렌 튜브 (응고 제)에서 수집.
  2. 천천히 각 셀 코팅 구슬 (10 mL 전체 볼륨 것입니다)의 2 개 mL를 포함 하는 폴 리 프로필 렌 튜브에 8ml 혈액 10 mL 혈 청 학적인 피 펫과의 전송 합니다. 항상 혈액 또는 조기 EC 활성화를 피하기 위해 구슬의 거친 처리를 하지 마십시오. 절차 1-2 분 소요
  3. 신중 하 게 동등한 혼합 및 파라핀 필름 뚜껑을 밀봉 하 피/비드 혼합물을 기울기.
  4. 수평 틸팅 테이블 (부드러운 기울기 설정만) 37 ° C 배양 기 및 기록 시간을 응고 내부에 튜브를 놓습니다.
    1. 설정된 시간 간격 예: 10, 20, 30, 50, 70, 90 분, 후 혈 청 또는 플라스마 분석을 위한 혈액 비드 혼합물의 1.5-2 mL 이상 제거.
      참고: 6 시간 점 좋습니다 셀의 한 그룹 내에서 3 개 이상의 복제 데로 다른 튜브에 혈액 샘플링을 할 수.
    2. 혈 청의 컬렉션에 대 한 혈액 응고를 두고. 플라즈마를 수집 하려면 추가 EDTA 또는 구 연산 2 mL 튜브에 혈액 샘플을 추가 하기 전에.
    3. 얼음에 튜브를 저장, 4 ° C에서 10 분 동안 2500 x g에서 원심 및 사용까지 80 ° C에서 혈 청/플라즈마를 저장.
      참고: 자료에 자료의 테이블에에서 제공 됩니다

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Representative Results

스피너 플라스 크 (그림 1)에서 문화 7-10 일 후 셀 confluent microcarrier 구슬 (그림 2)의 전체 표면을 커버 했다. Confluency 상태 확인은 중요 한 단계는 microbeads에 EC의 비 합칠 단층 응고 시간 표시 감소로 이어질 것입니다 때문에, microcarrier는 주어진 구슬의 표면 강하게 직업 응고 (응고 시간: 4 ± 1 분) ( 그림 3).

주의 필요로 하는 또 다른 중요 한 포인트는 틸팅 격판덮개의 속도입니다. 고속 틸팅 혈액 응고 향상 됩니다. 응고 시간 연장 EC의 단층 있었다면 microcarrier 구슬의 표면에 현재 관찰 될 수 있었다. GalTKO/hCD46/hTBM 유전자 변형 PAEC 사용 WT PAEC (그림 3)에 비해 응고 시간에 상당한 증가 보였다. PAEC (GalTKO)에 여자-α-1, 3-여자 xenoantigen의 부재는 응고 시간 (25 ± PAEC WT에 대 일 분)와 68 ± PAEC GalTKO에 대 일 분에 증가 보여주었다. 응고 시간에 다른 강한 증가 PAEC GalTKO/hCD46/hTBM microcarrier 구슬에 있었으나 때 관찰 되었다 (205 ± 32 분), 보수 (hCD46) 및 응고 시스템 (hTBM)의 성공적인 변조를 건의 하. 실험의 끝 보이는 응고 형성 될 때 정의 됩니다. 같은 그룹의 샘플 내 다양성 둘 다 분석 결과 변화와 혈액 기증자 간 때문 이다. 모든 실험 했다 3 복제 그리고 다른 때마다 혈액 기증자 데이터의 신뢰성을 높이기 위해 사용 되었다. 각 기증자에 대 한 혈액 분석 (혈소판 수, WBC, RBC, HCT 및 다른 매개 변수)는 외부 의료 실험실에 의해 수행 되었다. 그림 3 에 표시 된 결과 다른 혈액 기증자를 사용 하 여 수행 하는 다른 실험에서 얻을 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: Microcarrier 기반 분석 결과의 도식 대표. (A) EC T175 플라스 크에 확장 되 고 (B) 회전자 플라스 크 콜라겐 코팅 microcarrier 구슬 함께 전송. (C)는 건강 한 자원 봉사자, (D) EC 코팅 microcarrier 구슬, 혼합 하 고 37 ° c.에 인 큐베이 팅에서 신선한 비 anticoagulated 혈액 수집 어구 "비 anticoagulated 혈액" 어떤 응고 제와 혈액은 처리 되지 의미 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 면역 형광 염색 EC 코팅 Microcarrier 구슬에. Microcarrier 구슬 검색 되었고 스테인드 CD31에 대 한 평가 confluency (PECAM-1). 핵은 파란색 (DAPI) 스테인드 그리고 CD31 빨간색 (Cy3) 스테인드 했다. 눈금 막대: 100 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 다른 적의 배 응고 응고 시간 시각적으로 결정 하 고 실험의 끝 보이는 응고 관찰 하는 때 정의 되었다. 비-EC-코팅 microcarrier 구슬 했다 전체 비 anticoagulated 인간의 혈액에 노출 되 면 강한 procoagulant 효과 관찰 되었다. PAEC (GalTKO)에 여자-α-1, 3-여자 xenoantigen의 부재는 응고 시간 (25 ± PAEC WT에 대 일 분)와 68 ± PAEC GalTKO에 대 일 분에 증가 보여주었다. 응고 시간에 더 증가 때 PAEC GalTKO/hCD46/hTBM 참석 했다 microcarrier 구슬에는 보수 (hCD46) 및 응고 시스템 (hTBM)의 성공적인 변조 제안 관찰 되었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. 통계 분석 수행 되었습니다 ANOVA를 사용 하 여 여러 비교 Bonferroni 보정에 대 한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

여기에 제시 된 모델은 응고에 대 한 적합 한 응고 및 적와의 상호 작용의 다양 한 측면의 분석을 허용 하는 연구 관련 8 xenotransplantation 연구에서는 인간의 피 9부 화 후 다른 유전자 변형된 돼지 ECs의 항 응 혈 약 속성을 테스트 하는 유용한 시스템입니다.

프로토콜의 가장 중요 한 단계는 실험을 시작 하기 전에 microbeads의 전체 셀 범위 (confluency)을 보장 및 주의 컬렉션에 관련 된 고을 피하기 위해 조 비 anticoagulated 전체 혈액의 처리 vacutainers 혈액을 수집 하는 데 사용 되는 경우 발생할 수 있는 높은 전단 응력으로 인해 혈소판 활성화. 10 그럼에도 불구 하 고,이 시스템 반복 닫힌된 시스템의 부재를 포함 하 여 몇 가지 제한 사항이 있으며 더 나은 것을 생리 적인 전단 응력의 부재 대표 비보에 조건.

이러한 제한에도 불구 하 고 현재 비해 설명된 모델 제공 상당한 이점을 기존 모델. Microcarrier 구슬의 사용, EC 표면 혈액 볼륨 비율 증가, 항 응고 제와 항 염증 성 환경 설립 및 비 anticoagulated 전체 혈액의 사용을 허용. 현재 평면 침대 셀 문화 모델, 이것은 불가능 하 고 종종 동물 실험 사용 해야 따라서 혈액 응고 때문에 EC 활성화를 포함 하는 메커니즘. 부분에서이 설명된 microcarrier 구슬 모델을 사용 하 여 피할 수 있습니다.

또한,이 시스템은 광범위 한 응용 프로그램에 대 한 수 있습니다. 다재 다능 한 테스트 다른 약 또는 화합물 인 (이종-) 관련된 이식 뿐만 아니라 또한에 인간의 질병의 가능성에 있는. 응고 시스템 및 endothelium에 약물의 효과 면역 형광 검사, ELISA와 다중 정지 배열 분석에 의해 쉽게 평가 될 수 있습니다. 이것은 이전 인간의 thrombomodulin xenotransplantation 속에서의 유전자 변형 식의 효과에 관한 연구에서 이루어졌다. 11

설명된 방법의 가능한 수정 가득 이전 셀 코팅 구슬에 피 펫을 사용 하 여 공기 접촉과 혈액 활성화를 줄이기 위해 튜브에 직접 비 anticoagulated 전체 혈액의 수집 될 수 있습니다. 인간의 대동맥 내 피 세포 (항구적)를 사용 하 여 재미 있는 제어 있을 수 있습니다 하 고 이미 미래의 계획에 통합 됩니다. 튜브의 아르곤 토 핑 비 anticoagulated 혈액 응고 폭포의 활성화 문의 이어질 알려져 있다 공기와 접촉을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다. 피를 너무 빨리 그려진 경우 예 고무 stopcocks와 청소기 튜브를 사용 하 여 좋은 제트에 튜브에 혈액을 도입 후 혈소판 활성화 되 고 응고가 빨리 발생 합니다. 혈소판 활성화를 방지 하려면 큰 직경 피하 주사 바늘 (21ɢ-16ɢ)를 사용 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 연구는 스위스 국립 과학 재단 (SNSF, 보조금 번호 320030_156193)에 의해 지원 되었다. 저자 박사 Benoît Werlen Biosilon microcarrier 비즈 제공 감사 합니다. 우리는 또한 감사 교수 한스 피터 Kohler와 교수 안 드레 Haeberli microcarrier 구슬 모델을 설정 하는 방법에 대 한.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAEC Isolated from pig aorta in our Lab
Microcarrier beads (Biosilon) Thermo Fisher Scientific 160-250
Collagen I, Bovine Gibco A10644-01
DMEM Gibco 21885-025
Medium 199 Sigma M7528
RPMI Gibco 32404-014
Neutral tubes Sarstedt 02.1726.001
Polypropylene tubes Simport T406-2A
Stirrer flasks Tecnomara
Biological stirrer Brouwer MCS-104S
Rat anti CD31 R&D Systems MAB33871 Dilution 1:100
Goat anti-rat IgG-Cy3 Jackson Immuno Research 112-166-003 Dilution 1:500
Goat anti VE-cadherin Santa Cruz sc-6458 Dilution 1:100
Rabbit anti vWF DAKO A0082 Dilution 1:100
Dk anti Gt IgG – Alexa 488 Molecular Probes A11055 Dilution 1:500
Goat anti Rabbit - FITC Southern Biotech 4050-02 Dilution 1:500
DAPI Sigma 32670-25MG-F Dilution 1 µg/mL
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
FBS Gibco 10270-106 Concentration: 10% in cell culture medium
Adapter Sarstedt 14.1205
Confocal microscope Carl Zeiss LSM 710
Image analysis software Image J Available for free at: https://imagej.net
Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix PromoCell C-39216 2 mL in 500 mL of DMEM
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Concentration: 1% in cell culture medium
L-Glutamine Gibco 25030-024 Concentration: 1% in cell culture medium
Heparinun natricum Drossa Pharm AG Stock concentration: 5000 U.I./ mL
Chamberslides Bioswisstec AG 30108
CaCl2 x 2H2O Merck 2382.0500
MgCl2 x6 H2O Merck 1.5833.1000
Tween 20 Axon Lab AG 9005-64-5
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7030
Glycergel mounting medium Dako C0563

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
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3D 세포 배양 및 비 anticoagulated 전 혈을 사용 하 여 내 피 세포의 항 응 혈 약 그리고 항 염증 제 속성에 대 한 평가
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Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).More

Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).

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