Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi

doi: 10.3791/56227 Published: September 5, 2017

Summary

Biz bütün, anticoagulated kan çalışma ve koagülasyon analizini sağlayan bir vitro modeli mevcut. Anticoagulation sistemi sağlıklı endotel hücreleri doğal anticoagulation etkisi bağlıdır ve endotel hücre aktivasyonu pıhtılaşma içinde sonuçlanır.

Abstract

Vivo, endotel hücreleri kan dolaşan doğal anticoagulation için büyük önem taşımaktadır. Sonuç olarak, endotel hücre aktivasyonu kan pıhtılaşması için yol açar. Bu olay xenotransplantation, dahil olmak üzere önceden biçimlendirilmiş Anti-donör antikorların varlığında organ nakli gibi birçok klinik durumlarda yanı sıra iskemi/reperfüzyon hasarı görülmektedir. Endotel hücre etkisini incelemeye 3R standartları (azaltma, değişim ve arıtma), vitro modellerine göre hayvan deney azaltmak için harekete geçirmek üstünde kan pıhtılaşması son derece cazip olurdu. Ancak, endotel hücre kültürünün ortak Kafesli döşeme sistemleri 1-5 cm2 . endotel mL doğal, endotel aracılı anticoagulation için yeterli değil kan başına bir yüzey hacim oranı sağlar. Microcarrier boncuk endotel hücre kültürü çalışmalarının 40-160 cm2/mL için yüzey hacim oranı artabilir. Böylece antikoagülan kullanımı önlenebilir artan bu oran tam kan, "doğal" anticoagulation emin olmak yeterlidir. Burada vitro microcarrier tabanlı bir sistemin tüm, Sigara anticoagulated insan kan pıhtılaşması domuz endotel hücrelerinin genetik değişikliği etkilerini incelemek için tanımlanır. Açıklanan tahlil, birincil domuz aort endotel hücreleri, vahşi türlerinden (WT) veya transgenik insan CD46 ve thrombomodulin, microcarrier boncuk üzerinde yetiştirilen ve taze çekilmiş sigara anticoagulated insan kanı için maruz. Bu modeli ölçüm ve miktar sitokin yayın hem de harekete geçirmek için tamamlayıcı ve kan plazma koagülasyon işaretleri verir. Buna ek olarak, düşsel aktive endotel hücre ve immünglobulin birikimi, tamamlayıcı ve pıhtılaşma proteinleri endothelialized boncuk üzerinde confocal mikroskobu tarafından gerçekleştirilmiştir. Bu tahlil de endotel hücre aktivasyonu ve böylece, koagulasyon önlemek için gereken ilaçlar test etmek için kullanılabilir. Bu tür araştırmalar için kullanılan hayvan sayısını azaltmak için potansiyel üzerine, açıklanan tahlil gerçekleştirmek kolay ve tutarlı bir şekilde tekrarlanabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vasküler endotel kan damarlarının Lümen satır endotel hücreleri (EC) monolayer oluşur. Fizyolojik bir durumda deneniyor EC bir antikoagülan ve anti-inflamatuar çevre bakımı için sorumludur. 1 bu ifade antikoagülan ve EC yüzeyinde anti-inflamatuar proteinler tarafından aracılık ettiği. Örneğin, EC harekete geçirmek iskemi/reperfüzyon tarafından kaynaklanan yaralanma veya vasküler reddedilmesi (xeno-) nakledilen bir değişiklik endotel yüzeyinden bir antikoagülan ve anti-inflamatuar devlet yanlısı koagulant ve pro-inflamatuar sonuçlarında organları Devlet. 1

Endotel ve koagülasyon faktörleri, olarak taklit vitro modelleri arasında büyüleyici ve karmaşık etkileşim çalışmaya mümkün olduğunca vivo içinde durum son derece cazip. Geleneksel vitro koagülasyon testleri karakterize yaygın bir sınırlama koagülasyon-aracılı etkileri analiz zorlu kılan anticoagulated kan kullanılır ve citrated tam kan bile recalcification yeniden olamaz sonuçları taze sigara anticoagulated kan ile elde edilebilecek. 2 Ayrıca, geleneksel Düz Yataklı hücre kültürü sistemlerinde bu yeterli bir endotel hücre yüzey kan birim başına ulaştı olarak endotel antikoagülan özelliklerini yararlanmak mümkün değildir. Burada sunulan model EC küresel microcarrier boncuk, yüzeyde kültür tarafından bu sınırlamalar üstesinden gelir böylece bir EC yüzey kan oranı > 16 cm2/mL ulaşılabilir, hangi küçük arteriyoller ya da damarlar, durumda benzer ve hangi kan "doğal" anticoagulation izin vermek yeterli olmak EC yüzey tarafından tanımlanmıştır. 3 , 4 tam kan olmadan eklenen antikoagülanlar bu ortamda kullanılabilir. Kan örnekleri toplanan deney ve sitokinler, koagülasyon faktörleri sırasında ve çözünür tamamlayıcı aktivasyon belirteçleri algılanır ve sayılabilir. Ayrıca, EC kaplı microcarrier boncuk ifade EC harekete geçirmek işaretleri yanı sıra tamamlayıcı ve immünglobulin ifade tarafından confocal mikroskobu analiz. Başka bir ilginç uygulama endotel hücre aktivasyonu ve böylece, koagulasyon önlemek gerekiyordu uyuşturucu testi içerir. 5 her ne kadar bu model tamamen hayvan deney yerini alamaz, belirli fonksiyonel hipotezler ex vivo hücre kullanarak test etmek ve böylece iskemi/reperfüzyon üzerinde temel araştırmalarda kullanılan hayvan sayısını azaltmak için bir yöntem sunar yaralanma ya da (xeno) nakli.

Açıklanan modeli domuz aort endotel hücreleri (PAEC) microcarrier boncuk büyüdü ve tüm, anticoagulated insan kanı ile inkübe ayarlama bir xenotransplantation taklit etmek için kullanıldı. Kompleman sistemi ve/veya thrombomodulin (hTBM) düzenleme koagülasyon sisteminin düzenlenmesi için CD46 gibi birçok insan genleri taşıyan farklı transgenik PAEC onların antikoagülan özelliklerini analiz. Endotel hücre harekete geçirmek, tamamlayıcı ve koagülasyon sistemleri sıkı kontrol ve birbirine bağlı. 6 bu nedenle nasıl adezyon molekül ifade ve sitokin yayın, insan kanı maruz kaldıktan sonra farklı transgenik hücreleri davrandığını anlamak önemlidir glycocalyx ve antikoagülan protein kaybı dökülme. 7

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

(yabani türü yetiştirilen yerel bir çiftlik ve transgenik yetiştirilmiş Enstitüsü moleküler hayvan ıslahı ve biyoteknoloji, Ludwig Maximilian Üniversitesi, Münih, Almanya) Alman Landrace domuzlar arasında 40 kg, 30 kg ağırlığında, içinde kullanılmıştır Bu çalışmada. Bütün hayvanlar su ve yiyecek ad lib ile standart koşullar altında muhafaza. Tüm hayvan deneyleri İsviçre hayvanları Koruma Kanunu gibi bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları için İngiltere'de hayvanları Yasası (bilimsel yordamlar) ve NIH Rehberi uygun olarak yapıldı. Tüm hayvan çalışmaları varış kurallarına uyulması. Kanton veteriner hizmet (Canton, Bern, İsviçre) hayvan deney Komitesi Hayır tüm hayvan yordamları, izin onayladı. BE70/14. Deneysel protokol 3R ilkelerine göre rafine ve state-of--art anestezi ve ağrı yönetimi hayvan sayısını en aza indirmek ve deneyler sırasında stres ve ağrı hayvanların maruz azaltmak için kullanıldı.

kan sağlıklı bireyler tarafından kapalı sistem iz Bern Üniversitesi Hastanesi İsviçre yargı ve etik kurallarına uygun olarak çizilmiş. Ifade " sigara anticoagulated kan " kan ile herhangi bir antikoagülan tedavi değil anlamına gelir.

steril koşullar altında aşağıdaki adımlar gerçekleştirilir. Temel hücre kültür steril tekniği ile aşinalık gereklidir.

1. PAEC yalıtım

Not: torasik aortada kesimleri 6-10 cm euthanized Almanca Landrace domuzlar 3-6 ay yaş (diğer in vivo deneyler için kullanılan) ve hemen elde ulaşım aracını (DMEM + %1 penisilin/streptomisin) içeren bir 500 mL cam şişe içine transfer.

  1. 6-şey plaka fibronektin 12,5 µg/mL PBS 1 ile önceden kat x ve 1 h için bir kuluçka-37 ° C'de yer
  2. Önceden sıcak steril PBS 1 x ve hücre kültür orta (DMEM).
  3. Domuz aort taşıma ortamdan çıkar.
  4. Aort polistren bir tabağa yerleştirin.
  5. Yavaşça önceden sıcak PBS ile flush.
  6. Aort boyuna kesme ve iğnelerle düzeltebilirim.
  7. Sıcak hücre kültür orta iç damar yüzeyinde ekleyin.
  8. Aspire fibronektin-hücre kültür orta ve taze hücre kültür orta (%10 FBS, % 1 penisilin/streptomisin ve endotel hücre büyüme orta ek Mix % 0,4 ile desteklenmiş DMEM) ekleyin.
  9. Hücre kültürü ortamında bir pamuklu çubukla soak. Pamuk yün bud en iç gemi yüzeyi Tarih nazikçe ve yavaşça aynı yönde çubukla.
  10. 6-şey plaka bir kuyu hücrelerde yuvarlak yuvarlak tarafından RUB'dir.
  11. Aynı şeyi kuyuları geri kalanı için.
  12. Kontrol hücreleri mikroskop altında ve kuluçka 37 ° c, % 5 CO 2 6-şey tabak yerleştirin.
  13. Orta ikinci gün değiştirin ve tekrar 2-3 günde değiştirin.
  14. Hücreleri Konfluent olacak, hücreleri trypsinize ve onları T75 şişesi (PAEC P1) tohum.

2. PAEC karakterizasyonu

  1. 8-şey chamberslide fibronektin 12,5 µg/mL PBS 1 ile önceden kat x ve 1 h için bir kuluçka-37 ° C'de yer
  2. 5 x 10 4 hücreleri/iyi tohum ve gecede 37 kuluçka kuluçkaya ° C.
  3. PBS ++ (PBS) CaCl 2 ve MgCl 2, iki kere hücrelerle yıkama 300 μL/iyi.
  4. Tamir hücreleri % 3.7 paraformaldehyde 200 μL/iyi oda sıcaklığında 10 dakika ile.
  5. Yıkama hücreleri 3 kez PBS ++, 300 μL/iyi.
  6. PBS 1 x-3_% BSA (engelleme arabellek) 300 μL eklenir ve oda sıcaklığında 30 dakika bırakılır.
  7. Birincil antikorlar (anti-VE-cadherin, anti-CD31, anti-vWF) PBS 1x-1%BSA-0.05% deterjan 160 μL/iyi seyreltilmiş uygulamak ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
  8. PBS ++ (200 μL/de) ile 3 kez yıkayın.
  9. İkincil antikorlar ve PBS 1x-1%BSA-0.05% deterjan 160 μL/iyi, seyreltilmiş DAPI uygulamak ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
  10. PBS ++ (200 μL/de) ile 3 kez yıkayın.
  11. Dağ gliserol tabanlı montaj orta ile slaytlar ve endotel hücre işaretleri ifade bir floresan mikroskop altında doğrulayın.
    Not: Kültür domuz kadar % 90 izdiham bir T175 şişesi (DMEM düşük glikoz orta + %10 FBS, % 1 penisilin/streptomisin ve endotel hücre büyüme orta ek Mix % 0,4) aort endotel hücrelerinde ulaşıldığında. (yoğunluğu 1 x 10 6 hücre tohum, % 90 izdiham karşılık yaklaşık 5 x 10 6 hücrelere).

3. Microcarrier boncuk kaplama

  1. microcarrier boncuk 7 mL 42 mL 50 mL tüp (100 μg / % 0,2 Asetik asit çözeltilerine seyreltilmiş mL,) kolajen çözeltisi ile karıştırıp oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
  2. Yıkama boncuk PBS pH 7.4 25 mL ile iki kez (PBS 25 mL ekleyin, karıştırın ile de damlalıklı ve boncuk sonra atma süpernatant ve tekrar düzenlenmiştir kadar bekleyin) ve bir kez DMEM Orta 25 mL.
  3. Kapak orta % 10 ile desteklenmiş 199 10mL ile 50 mL tüp boncuk FBS, % 1 penisilin/streptomisin, % 1'l-Glutamine, %0,4 endotel hücre büyüme orta ek mix ve heparin (5000 IU/mL) 25 μL ve denge 10 min için izin daha fazla kullanımdan önce.

4. Hücre toplama

  1. hücre kültür orta PAEC içeren T175 balonun kaldır ve PBS pH 7.4 5 mL ekleyin.
  2. T175 balonun üzerinden kaldırmak PBS.
  3. 5 mL Trypsin-0.05% EDTA de ekleyip 3-4 dk 37 için kuluçkaya ° C.
  4. Hücreleri hücre kültür orta 15 mL ile balonun durulama tarafından toplamak ve bir 50 mL tüp süspansiyon transfer.
  5. Santrifüj kapasitesi 1200 x g 8 dakika oda sıcaklığında hücreleri, fazla orta kaldırmak ve Pelet hücre kültür orta 5 mL resuspend.

5. Hücreleri karıştırıcı şişesi tohum

  1. hücre süspansiyon hücre kültür orta 20 mL ekleyin ve resuspend.
  2. 20 mL hücre kültür orta (w/o hücreleri) 500 mL manyetik karıştırıcı şişesi eklemek.
  3. Hücreleri yıkanmış microcarrier boncuk 3.3 adımından ekleyip karıştırın dikkatle 25 mL serolojik pipet ile.
  4. Boncuk/hücre karışımı manyetik spinner şişeye transfer.
  5. 50 mL tüp 10 mL kalan hücreleri toplamak için hücre kültür ortamının ile durulayın.
  6. Hücre kültür orta bir ek 85 mL spinner şişesi ekleyin ve kuluçka gecede 37 ° C'de üzerinde bir shaker içine yerleştirin (100 x g, karıştırma aralığı: 3 dk her 45 min).
  7. Hücre kültür orta 50 mL ekleyin (Toplam birim 200 mL) ve bir shaker olarak 37 ° C'de ek 24 h için karıştırmaya devam (100 x g, karıştırma aralığı: 3 dk her 45 min).
  8. Ekle renksiz RPMI orta (% 10 ile desteklenmiş FBS, % 1 penisilin/streptomisin, % 1'l-Glutamine, %0,4 endotel hücre büyüme orta ek mix ve Heparin 25 μL) toplam hacminin 320 mL ulaşılana kadar.
  9. Eski orta her 48 h: kaldırmak 100 mL orta yerine ve taze desteklenmiştir renksiz RPMI 100 mL ekleyin.
  10. Hücreleri 5-7 gün boyunca kültür. Zaman cep kaplı boncuk izdiham durumuna bağlıdır.
< p sınıf "jo =ve_title "> 6. İzdiham doğrulama

  1. bir pipet kullanarak cep kaplı boncuk 200 μL toplamak ve polipropilen tüp içine aktarmak.
  2. 3 kez ile PBS 1 600 μL boncuk yıkama x (PBS, eklemek tüp ve karışımı yavaşça dekolmanı hücrelerin önlemek, boncuk beklemek için sakin, PBS atıp tekrar için eğimli).
  3. Parapicric asit 200 μL ekleyerek 10 min için boncuk düzeltmek.
  4. Yıkama 3 kez ile PBS 1 600 μL
  5. PBS 1 seyreltilmiş DAPI eklemek x ve 10 dk. için kuluçkaya
  6. Boncuk cam slayt üzerinde transfer ve gliserol dayalı montaj orta kullanarak bir coverslip uygulamak.
  7. Boncuk confocal mikroskop altında görselleştirmek.

7. Deneysel bir işlem

  1. 10 mL serolojik pipet ile cep kaplı boncuk (yordamlar steril koşullarda yapılması zorunda değilsiniz) manyetik karıştırıcı balonun üzerinden Kaldır ve 12 mL yuvarlak alt polipropilen tüpler içine aktarmak.
  2. Boncuk (yaklaşık 1-2 dk) yerleşmek ve aşırı orta kaldırmak edelim.
  3. Tam olarak 2 mL boncuk her tüp içerir kadar tüpler için daha fazla boncuk ekleyin.
  4. 5 mL açık RPMI her tüp ve dikkatli bir 10 mL serolojik pipet kullanarak karıştırın.
  5. Boncuk yerleşmek ve aşırı orta kaldırmak edelim.
  6. RPMI ile bir kez daha çamaşır yordamı yineleyin ve tüm aşırı orta kaldırın.

8. Kuluçka sigara-anticoagulated kan

  1. dikkatli ve yavaş bir sağlıklı gönüllü kan ve 9 mL tarafsız polipropilen borular içinde (pıhtı önleyici) toplamak (ne jet ne de vacutainers kullanma).
  2. 10 mL serolojik pipet ile kan 8 mL her hücre kaplı boncuk (Toplam birim-ecek var olmak 10 mL) 2 mL içeren polipropilen borular içine yavaş yavaş aktarın. Her zaman kan veya boncuk erken EC etkinleştirme önlemek için kaba işleme kaçının. 1-2 dk. yordamı alır
  3. Dikkatli bir şekilde kan/boncuk karışımı eşit karıştırma sağlamak ve parafin film kapaklı mühür eğimli.
  4. (Sadece nazik devirme ayarları ile) yatay devirme tablo iç 37 ° C kuluçka ve kayıt kez pıhtılaşma tüpler yerleştirin.
    1. Saati ayarla aralıklarla, örneğin 10, 20, 30, 50, 70, 90 dk, sonra en az 1.5-2 mL serum veya plazma analiz için kan-boncuk karışımı kaldırmak.
      Not: aynı derecede kan örnekleme farklı tüplerde bitmiş 6 saat puan için 3'ten fazla çoğaltır hücreleri, bir grup içinde sahip öneririz.
    2. Koagüle kan serumu koleksiyonu için bırakın. Plazma toplamak için EDTA veya sitrat 2 mL tüpler için kan örnekleri eklemeden önce ekleyin.
    3. Tüpler buza depolamak, santrifüj kapasitesi 2500 x g 4 ° C'de 10 dakika ve serum/plazma 80 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
      Not: Tablo malzemeler malzemeler hakkında ayrıntılı bilgi sağlanır

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kültür spinner şişeye (şekil 1) 7-10 gün sonra hücreleri microcarrier boncuk (Resim 2) tüm yüzeyini örten Konfluent. Doğrulama confluency devletin önemli bir adım çünkü EC lastikteki üzerinde bir sigara birleşmesi monolayer Pıhtılaşma zamanı kadar belirgin bir azalma götürecek, microcarrier boncuk yüzey şiddetle yanlısı koagulant (pıhtılaşma Zamanı: 4 ± 1 dk) ( Şekil 3).

Dikkat gerektiren bir diğer önemli husus devirme plaka hızıdır. Yüksek devirme hızlı kan pıhtılaşma artıracaktır. Pıhtılaşma zamanı uzaması-var gözlenen EC monolayer olsaydı microcarrier boncuk yüzeyinde mevcut. GalTKO/hCD46/hTBM transgenik PAEC kullanımı pıhtılaşma zamanında WT PAEC (şekil 3) göre önemli bir artış gösterdi. PAEC (GalTKO) üzerinde Gal-α-1,3-Gal xenoantigen yokluğu (25 ± 8 min PAEC WT için) ve 68 ± PAEC GalTKO için 30 dk zaman pıhtılaşma artış gösterdi. PAEC GalTKO/hCD46/hTBM microcarrier boncuk üzerinde mevcut olduğu zaman zaman pıhtılaşma başka bir güçlü artış gözlenmiştir (205 ± 32 dk), hangi tamamlayıcı (hCD46) ve koagülasyon sistemleri (hTBM) başarılı bir modülasyon öneriyor. Deney sonunda görünür pıhtı oluşturulduğunda tanımlanır. Örnekleri aynı grup içinde değişkenlik hem vade tahlil-değişkenliği ve kan donör Inter olduğunu. Her deney 3 çoğaltır vardı ve her zaman farklı bir kan donör veri güvenilirliğini artırmak için kullanılmıştır. Her donör için kan analizi (trombosit sayısı, WBC, RBC, HCT ve diğer parametreleri) dış sağlık Laboratuvarları tarafından gerçekleştirildi. Şekil 3 ' te gösterilen sonuçları farklı kan bağış ile gerçekleştirilen farklı deneyler elde edilir.

Figure 1
Şekil 1: Microcarrier tabanlı testin şematik gösterim. (A) EC T175 şişeler içinde genişletilmiş ve (B) ile birlikte kolajen kaplı microcarrier boncuk spinner şişeler içine aktarılır. (C) sağlıklı bir gönüllü, EC kaplı microcarrier boncuk ile karışık ve 37 ° C'de inkübe (D) üzerinden taze sigara anticoagulated kan toplanır İfade "anticoagulated kan" kan ile herhangi bir antikoagülan tedavi değil demektir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: ayirt Microcarrier EC kaplı boncuk üzerinde boyama. Microcarrier boncuk alındı ve CD31 için lekeli confluency değerlendirmek için (PECAM-1). Çekirdeklerin mavi (DAPI) lekeli ve CD31 kırmızı (Cy3) lekeli. Ölçek çubuğu: 100 mikron. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: farklı EC zamanlarında pıhtılaşma Pıhtılaşma kez görsel olarak belirlenmiştir ve görünür bir kan pıhtısı gözlenen deneme sonuna tanımlanmıştır. EC kaplı microcarrier boncuk bütün sigara anticoagulated insan kanı için maruz güçlü procoagulant etkisi gözlendi. PAEC (GalTKO) üzerinde Gal-α-1,3-Gal xenoantigen yokluğu (25 ± 8 min PAEC WT için) ve 68 ± PAEC GalTKO için 30 dk zaman pıhtılaşma artış gösterdi. Ne zaman PAEC GalTKO/hCD46/hTBM microcarrier boncuk üzerinde mevcut da başarılı bir modülasyon tamamlayıcı (hCD46) ve koagülasyon sistemleri (hTBM) gösterir zaman Pıhtılaşma fazla bir artış gözlenmiştir. Veri ortalama ± standart sapma gösterilir. İstatistiksel analiz yapılan ANOVA Bonferroni düzeltmesi olan birden fazla karşılaştırmalar için kullanma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada sunulan model koagülasyon için uygundur ile ilgili çalışmalar koagülasyon ve EC ile etkileşimi farklı yönlerini analiz izin 8 xenotransplantation araştırma, insan kanı 9kuluçka sonra farklı genetik olarak değiştirilmiş domuz ECs antikoagülan özelliklerini sınamak için kullanışlı bir sistem olduğunu.

Bu deney başlamadan önce tam hücre kapsama (confluency) lastikteki sağlanması ve bu dikkatli koleksiyonuna ait ve sigara anticoagulated tam kan erken önlemek için taşıma Protokolü'nün en önemli adımlar vardır trombosit aktivasyon yüksek kesme vacutainers kan toplamak için kullanılıyorsa oluşabilir stres, nedeniyle. 10 yine de, bu sistem bir dolaşım kapalı sistem yokluğu da dahil olmak üzere bazı sınırlamalar vardır ve iyi olur fizyolojik kesme stres yokluğu vivo içinde koşulları temsil eder.

Bu sınırlamaları rağmen modelleri üzerinde şu anda açıklanan model Teklifler önemli avantajları mevcut. Microcarrier boncuk kullanımı nedeniyle anti-koagulant ve anti-çevre kurulması ve sigara anticoagulated tam kan kullanımı sağlayan kan hacim oranı EC yüzeye artırılır. Geçerli Düz Yataklı hücre kültür modelleri, bu mümkün değildir ve EC etkinleştirmesi nedeniyle kan pıhtılaşma dahil mekanizmaları bu nedenle sık sık hayvan deney kullanılmasını gerektirir. Kısmen, bu tarif microcarrier boncuk modelini kullanarak önlenebilir.

Ayrıca, bu sistem uygulamaları geniş bir yelpazede için sağlar. Çok yönlülüğünü farklı uyuşturucu ya da sadece ilgilidir (xeno-) ekimi ama da için insan hastalıkları olan bileşikler test imkanı bulunur. Endotel ve pıhtılaşma sistemi ilaçların etkileri kolayca ayirt, ELISA ve multiplex süspansiyon dizi analizi ile tespit edilebilir. Bu daha önce bir xenotransplantation ortamda insan thrombomodulin transgenik ifade etkisi üzerine bir çalışma yapıldı. 11

Açıklanan yöntemin olası bir değişiklik olmayan anticoagulated tam kan koleksiyonuna doğrudan cep kaplı boncuk ile hava-iletişim ve kan harekete geçirmek yanında istimal pipet azaltmak için daha önce dolu tüpler olabilir. İnsan aort endotel hücreleri (HAEC) kullanımı ilginç bir denetim olabilir ve zaten gelecek planları dahil edilmiştir. Argon tepesi tüplerinin anticoagulated sigara kan pıhtılaşma cascade aktivasyonu başvurun için bilinen hava ile temasını azaltmak için kullanılabilir. Kan çok hızlı bir şekilde çizilir, örneğin vakumlu tüpler ile kauçuk kesme muslukları kullanarak ve iyi bir jet tüp içine kan tanıtımı, sonra trombosit aktive olmak ve koagülasyon daha erken ortaya çıkar. Trombosit aktivasyon önlemek için geniş çaplı Hipodermik iğneler (21ɢ - 16ɢ) kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu çalışmada İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından (SNSF, Grant No. 320030_156193) destek verdi. Yazarlar Dr Benoît Werlen Biosilon microcarrier boncuk verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz Ayrıca Prof. Hans Peter Kohler ve Prof. André Haeberli microcarrier boncuk modelini oluşturan ayarlama konusunda yardım için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAEC Isolated from pig aorta in our Lab
Microcarrier beads (Biosilon) Thermo Fisher Scientific 160-250
Collagen I, Bovine Gibco A10644-01
DMEM Gibco 21885-025
Medium 199 Sigma M7528
RPMI Gibco 32404-014
Neutral tubes Sarstedt 02.1726.001
Polypropylene tubes Simport T406-2A
Stirrer flasks Tecnomara
Biological stirrer Brouwer MCS-104S
Rat anti CD31 R&D Systems MAB33871 Dilution 1:100
Goat anti-rat IgG-Cy3 Jackson Immuno Research 112-166-003 Dilution 1:500
Goat anti VE-cadherin Santa Cruz sc-6458 Dilution 1:100
Rabbit anti vWF DAKO A0082 Dilution 1:100
Dk anti Gt IgG – Alexa 488 Molecular Probes A11055 Dilution 1:500
Goat anti Rabbit - FITC Southern Biotech 4050-02 Dilution 1:500
DAPI Sigma 32670-25MG-F Dilution 1 µg/mL
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
FBS Gibco 10270-106 Concentration: 10% in cell culture medium
Adapter Sarstedt 14.1205
Confocal microscope Carl Zeiss LSM 710
Image analysis software Image J Available for free at: https://imagej.net
Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix PromoCell C-39216 2 mL in 500 mL of DMEM
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Concentration: 1% in cell culture medium
L-Glutamine Gibco 25030-024 Concentration: 1% in cell culture medium
Heparinun natricum Drossa Pharm AG Stock concentration: 5000 U.I./ mL
Chamberslides Bioswisstec AG 30108
CaCl2 x 2H2O Merck 2382.0500
MgCl2 x6 H2O Merck 1.5833.1000
Tween 20 Axon Lab AG 9005-64-5
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7030
Glycergel mounting medium Dako C0563

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
  2. Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
  3. Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
  4. Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
  5. Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
  6. Cowan, P. J., d'Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
  7. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
  8. Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
  9. Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
  10. Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
  11. Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).
Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).More

Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter