Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הצמד הצ'יפ בשביל כריך מרובבת Cross-reactivity חופשי ונטול שהמשגיח Immunoassays

Published: November 13, 2017 doi: 10.3791/56230
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,3, 1,2
1McGill University and Génome Québec Innovation Centre, 2Biomedical Engineering Department, McGill University, 3Parallex BioAssays Inc.

Summary

נדגים טכנולוגיה שבב snap לביצוע כריך מרובבת cross-reactivity ללא immunoassays על ידי הצמדת פשוט שתי שקופיות. מנגנון הצמדה משמש באופן אמין מבנק ריאגנטים microarray-כדי-microarray. השבב הצמד יכול לשמש עבור כל התגובות הביוכימי הדורש colocalization של ריאגנטים שונים ללא זיהום צולב.

Abstract

אנליזת חלבונים מרובבת הראו סופריור אבחון רגישות ודיוק לעומת חלבונים יחיד. מיקרו-מערכים נוגדן לאפשר לאלפי immunoassays מיקרו-סולם מבוצעים בו-זמנית על שבב יחיד. כריך assay תבנית משפר assay ירידה לפרטים על ידי גילוי לכל מטרה עם שני נוגדנים, אבל סובל אשיג בין ריאגנטים ובכך יגביל את יכולות multiplexing שלהם. נוגדן colocalization microarray (ACM) פותחה לגילוי חלבון מרובבת cross-reactivity חינם, אך דורש של צופה יקר באתר עבור ייצור microarray במהלך מבחני. בעבודה זאת, נדגים טכנולוגיה שבב snap מעבירה ריאגנט מ microarray-כדי-microarray מאת פשוט ההצמדה יחד, שולכן אין שהמשגיח יש צורך בתקופת הדגירה מדגם, יישום עוקבות של זיהוי נוגדנים (דבס) על שני צ'יפס אחסון של שקופיות קדם הבחינו, בריא הכנת שקופית מהוצאה להורג וזמינותו. שתי שיטות ההעברה ליחיד מוצגים כדי להשיג יישור מדויק בין מיקרו-מערכים שני ומתוארות הזיוף שקופיות עבור שתי שיטות. התוצאות מראות כי < 40 μm יישור הושגה עם העברה כפולה, להגיע עם צפיפות מערך של כתמים/cm 6252. ראגנטים 50-plexed נערכה כדי להדגים את השימושיות של השבב snap בניתוח מרובבת חלבון. הגבולות של זיהוי של חלבונים 35 נמצאות בטווח של pg/mL.

Introduction

פאנל של סמנים ביולוגיים הכוללת חלבונים מרובים עשויים לספק רגישות וספציפיות גבוהה יותר מאשר סמן בודד באבחון של מחלות מורכבות כגון סרטן1,2. וזמינותו מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה) כבר הטכנולוגיה תקן זהב בשימוש במעבדות קליניות בהשגת גבול של זיהוי-pg/mL נמוכה בפלסמה, אבל לתחום יעד אחד לכל assay3,4,5. מיקרו-מערכים נוגדן פותחו עבור אדיב אלפי מבחני ולמחקר שנערך במקביל7,86,שקופיות מיקרוסקופ יחיד. עם זאת, היכולת multiplexing של שיטה זו הוא מוגבל על ידי מונחה ריאגנט אשיג, הנובע היישום של תערובת של דבס, הוא הופך להיות יותר בעייתי עם מספר גדל והולך של מטרות9,10 , 11. פלה ואח. הצהירו כי פגיעות וכתוצאה מכך assay כריך מולטיפלקס מושפעת 4N(N-1) כאשר N הוא מספר מטרות12.

כדי להמתיק אשיג ב נוגדן מיקרו-מערכים, נוגדן colocalization microarray (ACM) פותחה במעבדה שלנו כריך מולטיפלקס assay12. לכידת נוגדנים (מוניות) הם הבחינו על מצע עם תצפיתן microarray. לאחר חסימת דגימות מוחלים על פני השטח, ואז ודבס בודדים הם הבחינו על המקומות זהה עם קומפלקס אנטיגן המונית. אפשרות לפתור כל התרחישים אשיג בין נוגדנים אנטיגנים עם ACM, מגבלות של זיהוי-pg/mL הושגו. עם זאת, פרוטוקול assay דורש הכנה של הבחינה של דבס במהלך הניסויים באמצעות שהמשגיח microarray באתר עם דיוק גבוהה לצורך היישור, וזה זמן רב ויקר, הגבלת יישום נרחב של טכנולוגיה זו ב- מעבדות אחרות. ACM כף-יד, בשם צ'יפ snap פותחה עבור cross-reactivity חינם, ללא שהמשגיח מגה-פלקס כריך immunoassays13,14,15. מוניות, דבס נצפה מראש על גבי של assay ושקופית העברה בהתאמה בתבנית microarray, מאוחסנים. במהלך וזמינותו, השקופיות מאוחזרות, microarray של דבס מועברים באופן קולקטיבי על גבי השקופית assay מאת פשוט מצלם את האסימונים שני ביחד. מנגנון הצמדה משמש להעברת ריאגנט אמין. ניטרוצלולוזה מצופה שקופיות עם קיבולת איגוד נוגדן גדולה יחסית שימשו כמו assay השקופיות כדי לספוג את טיפות נוזל, ובכך להקל על העברת ריאגנט, עם זאת, השקופיות יקרים יותר שקופיות זכוכית רגילה, microarray סורקים תואם עם מגלשות שאינם שקופים נדרשים עבור רכישת אות.

בעבודה זאת, נדגים את הפרוטוקול של ביצוע של ראגנטים מולטיפלקס כריך עם שבב snap. מנגנון הצמדה הרומן פותחה עבור העברת ריאגנט יותר נוח ואמין microarray-כדי-microarray. חשוב לציין, כאן הקמנו שיטת ההעברה מגיב על גבי זכוכית רגילה שקופיות עם השבב snap. 1024 כתמים בהצלחה להעביר, מיושרים על זכוכית, הרחבה משמעותית את השימוש בטכנולוגיה זו במעבדות רוב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור ואחסון של הצמד שבבי

בשיטת העברה יחיד
  1. ( איור 1 א')
    1. ספוט פתרונות cAb המכיל נוגדנים µg/mL 400 ו- 20% גליצרול בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) על גבי ניטרוצלולוזה (או כוס functionalized) assay שקופית עם הזרקת דיו microarray שהמשגיח 13 ב לחות יחסית של 60% (1.2 nL בכל מקום) עם 800 ריווח מרכז למרכז מיקרומטר. ודא השקופית קבוע על סיפון צפייה על פי בפינה אחת (כאן, בפינה השמאלית התחתונה שימשה).
    2. דגירה השקופית assay הבחין בטמפרטורת החדר במשך 1 h עם לחות יחסית של 60%.
    3. תהדק את אטם מודול שקופיות עם 16 תאים בשקופית assay לחלק זה 16 בארות. לשטוף את השקופית שלוש פעמים על-ידי הוספת µL 80 ל- PBS המכיל 0.1% Tween-20 (PBST) לתוך כל טוב, ומטלטל ב rpm 450 על מטרף, 5 דקות בכל פעם.
    4. 80 להוסיף µL של חסימת פתרונות אחד טוב וללחוץ על 1 h 450 סל ד.
    5. להסיר את האטם ויבשה השקופית assay עם זרם של חנקן.
    6. לתקן את שקופית העברה על סיפון שהמשגיח ודחף הפינה השמאלית התחתונה של השקופית נגד בפינה השמאלית התחתונה של סיפון צפייה. הזרקת דיו ספוט מערך של סימני יישור (פתרון של מיקרו-חרוזי פוליסטירן) באותה פריסה עד כדי כך על המוניות.
    7. לתת את סימני יישור יבש. הפוך את השקופית העברה ותחזיר אותו בחזרה לתוך הסיפון שהמשגיח, תיקון נגד בפינה השמאלית התחתונה.
    8. להכין את dAb איתור פתרונות המכיל נוגדנים µg/mL 20, 20% גליצרול ו 1% BSA.
    9. באמצעות את המאתר ' מצלמה s, תצלם תמונה סימן יישור. ליישם את התמונה לתוך התוכנית spotting כמו fiducial, את מערכת זיהוי תמונה של המאתר הזרקת דיו כדי לזהות את הסימן השמאלי העליון ביותר. להשתמש את הקואורדינטות הנקודה הראשונה של המערך dAb. מקום 8 nL לכל droplet עם מרווח מרכז למרכז של מיקרומטר 800-
  2. בשיטת העברה כפול ( איור 1b)
    1. מקום העברה שקופית 1 על סיפון שהמשגיח הזרקת דיו נגד בפינה השמאלית התחתונה. לזהות פתרונות מוניות המכיל 400 נוגדנים µg/mL גליצרול 20%, 1% BSA ב- PBS אותן לשקופית עם וחברתה microarray הזרקת דיו הלחות היחסית של 60% (0.4 nL בכל מקום ו ~ 200 מיקרומטר בקוטר). המרווח מרכז למרכז הוא 400 מיקרומטר.
    2. הצמד העברת שקופיות ניטרוצלולוזה מצופה (או כוס functionalized) assay השקופית באמצעות מנגנון הצמדה ( איור 2) להעביר את טיפות המונית על גבי השקופית וזמינותו.
      1. להפוך כל שישה כפתורים בצד של מנגנון הצמדה ב- 90 מעלות כדי למשוך. ותנעלי את כל בוכנות במצב פתוח. הכנס את השקופית העברה מחזיק שקופיות בהקיבול עם הפינה החתוכים מול ה-pin פוגו קבוע. להפוך את הסט הראשון של שלושה לחצנים כדי לשחרר את בוכנות עם הפין פוגו הזהב ולוודא השקופיות יידחפו נגד הפינים יישור.
      2. להוסיף שקופית בציפוי ניטרוצלולוזה snap המנגנון יושבת הפוך על הפינים פוגו 4. להפוך את הסט השני של שלושה לחצנים לשחרר בוכנות עם הפין כסף. ולוודא השקופיות יידחפו נגד הפינים יישור.
      3. לסגור את המנגנון snap על-ידי הצבת את הקליפה העליונה את המחזיק שקופיות באמצעות יישור עמודי חורים לצורך מיקום מדויק.
      4. להכניס את המנגנון snap סגור בכלוב, לדחוף את הכרטיסיה הסגר לגמרי למטה להביא את פנים אל פנים תוך יישום הלחץ המתאים מיקרו-מערכים. לשמור סגור עבור מינימלית 1
    3. להפריד את השקופיות. דגירה השקופית assay בטמפרטורת החדר במשך 1 h עם לחות יחסית של 60%. רוחצים, לחסום, ומייבשים את השקופית assay כמתואר בצעדים 1.1.3 - 1.1.5.
    4. במקום אחר העברת שקופיות על הזרקת דיו שהמשגיח ותתרחק לדחוף בפינה השמאלית התחתונה. פתרונות dAb ספוט המכיל µg 50 או 100/mL של נוגדנים (ראה טבלה 1), 20% גליצרול BSA 1% ב- PBS. להבטיח כי כל נקודה היא 0.8 nL מרכז למרכז המרווח בין נקודות הוא 400 מיקרומטר.
    5. לאחסן וזמינותו של השקופית העברה. חותם השקופיות assay וגם העברת תיק אטום המכיל סופג לחות ושם במקפיא-20 ° C.

2. מרובב immunoassays עם צ'יפס הצמד

  1. אחזר השקופית assay מהמקפיא. תשאיר את התיק סגור במשך 30 דקות עד השקופית מגיע לטמפרטורת החדר.
  2. להכין 7 נקודות סדרתי מדולל פתרונות לדוגמה על ידי spiking חלבונים ב- PBS המכילה 0.05% Tween-20-
    הערה: כאן, גורם לדילול 5-fold משמש. הריכוזים ההתחלה עבור כל חלבון המפורטים בטבלה 1-
  3. הכן פתרונות לדוגמה לפי הצורך. לדוגמה, לדלל בנסיוב אדם 4 פעמים במאגר PBST.
  4. תהדק את אטם 16-תא בשקופית assay.
  5. למלא טור אחד של בארות 8 עם הפתרונות דילול 7 חלבונים ופתרון ללא חלבון מאגר PBST על ידי pipetting. Pipette הפתרונות מדגם בבארות 8 אחרות בשקופית אותו.
    הערה: פתרונות µL 80 יכול להתאים בכל טוב. עוד שקופיות יכול לשמש כדי למדוד דוגמאות נוספות בעת הצורך.
  6. דגירה בדגימות על מטרף-סל ד 450 לשעה בטמפרטורת החדר או נלון בשטיפת מעלות צלזיוס 4 השקופית שלוש פעמים עם PBST על ניעור ב 450 סל ד, 5 דקות בכל פעם. הסר את האטם ויבשה השקופית תחת זרם של גז חנקן.
  7. לאחזר את השקופית העברה עם ודבס מהמקפיא. לשמור על התיק סגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגירה השקופית בתוך תא סגור (למשל תיבת טיפים ריק) המכיל 60% לחות מייצב חרוזים במשך 20 דקות על התייבשות.
  8. להצמיד את השקופית ההעברה הכוללת השקופית assay באמצעות מנגנון הצמדה ( איור 2) להעביר את טיפות dAb. עיין בסעיף 1.2.2 עבור הפעולה של המנגנון snap-
  9. נפרדים בשקופיות. דגירה השקופית assay בתוך תא סגור המכיל 60% לחות מייצב חרוזי ח' 1 קלאמפ השקופית assay עם אטם 16-תא ולשטוף את השקופית 4 פעמים באמצעות PBST על מטרף-450 סל ד, 5 דקות בכל פעם.
  10. פיפטה 80 µL של פתרונות המכילה 2.5 µg/mL streptavidin fluorophore ב- PBS כל טוב. תקופת דגירה של 20 דקות על מטרף-450 סל ד.
  11. יש לשטוף את השקופית 3 פעמים עם PBST ופעם אחת עם מים מזוקקים על ניעור ב 450 סל ד. הסר את האטם, לייבש את השקופית באמצעות גז חנקן.

3. שקופית סריקה וניתוח נתונים

  1. סרוק השקופית assay עם סורק microarray פלורסצנטיות באמצעות הלייזר 635 nm.
  2. לחלץ את עוצמת נטו בכל מקום באמצעות תוכנה (למשל מנתח מערך-pro) ניתוח 16.
  3. לחשב את הגבול של זיהוי (לוד) של כל חלבון באמצעות תוכנת סטטיסטיקה ולקבוע את ריכוז חלבון הדגימות.
    הערה: לוד מוגדר החיתוך-Y של תקן cuשיחרר גז שמונה לפי שלוש פעמים סטיית תקן של שלושה מבחני עצמאי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההליך assay עבור יחיד והן בשיטות העברת כפול מוצג באיור1. העברה יחיד, המוניות הם הבחינו ישירות על השקופית assay, דבס מועברים על גבי השקופית assay על השימוש בתבנית מראה בנהגי המוניות (איור 1 א'). נדרש הליך העברה אחת בלבד, אך שיטה זו סובלת אי-התאמות בין שני מיקרו-מערכים, נגרמת בעיקר אי-התאמות זוויתי בין השקופית gantry הזרקת דיו (איור 2). גישה אחת כדי להתמודד עם האתגר הזה הוא להעביר למוניות והן ודבס ברצף על גבי השקופית assay לאחר הבחינה, ולתקן את השקופיות במנגנון snap כראוי (איור 1b). באמצעות שיטה זו, הן מיקרו-מערכים מועברים באותה התנוחה. אין תמונת זיהוי מערכת או יישור סמן נדרש עבור שיטת ההעברה כפול. אי-התאמות 98% של המקומות היה בתוך מיקרומטר 41, 6-fold שיפור לעומת שיטת העברה יחידה14.

מנגנון הצמדה תוכנן להיות קלה לשימוש ללא כל הדרכה ולצמצם את הסיכון של מערך אי-התאמות. השקופיות הם הביאו יחד עם מיקום מדויק הודות יישור סיכות המשותף assay וגם העברת שקופיות. השקופית העברה הוא קצת יותר קטן כדי להתאים מתחת לשקופית assay כאשר הושעה על ידי סיכות פוגו, עד לסגירת מנגנון הצמדה. כרווח כלולה בשקופית העברה שמירה על פער בגודל מיקרומטר, המאפשר העברת droplet אמין אל השקופית זכוכית. לבסוף, הכלוב ו- tab הסגר שלה נועדו להפעיל לחץ לצורך העברה יעילה על כל snap להעברת איכותי לשחזור. תמונה של מנגנון הצמדה מוצג באיור3.

להחליפן בתמונות הממחישות את התוצאות של ריאגנט העברה אל ניטרוצלולוזה ושקופית זכוכית מוצגים באיור4. 532 אלקסה הנקרא IgGs שימשו הכימית הראשונה, אלקסה 647 הנקרא IgGs שימשו הכימית השני. לאחר העברה, שנסרק השקופית עם 532 ננומטר, 635 ננומטר לייזר. התוצאה מראה כי 3136 (עבור השקופית ניטרוצלולוזה) או 1024 (עבור השקופית זכוכית) microspots הועברו עם אפס כשל על השקופיות assay, אין זיהום צולב נצפתה על העברת הכימית השני. בעת שימוש שקופיות זכוכית, זה אפשרי ליצור יותר הידרופובי השטח על-ידי functionalization, ובכך להקטין את הגודל של כל מקום, הקטנת המרחק ספוט-כדי-spot להעברת מספר גדול יותר של נקודות. עבודה זו מתרחב היישום של טכנולוגיית שבב snap כדי זכוכית נפוץ סובסטרטים.

עקומות סטנדרטי של ראגנטים 50-פלקס מיקוד סרטן השד קשורים חלבונים מומחשים איור 5, התואם microarray נוגדן כריך מולטיפלקס הגדול ביותר עד כה ללא אשיג. שיטת העברה כפולה היה בשימוש זה וזמינותו, השקופית שנסרק, עוצמת קרינה פלואורסצנטית הייתה לכמת להפקת העקומות סטנדרטי. 35 מתוך 50 חלבונים הגיע LODs-pg/mL (ראה טבלה 1), שיפור נוסף על-ידי מיטוב התנאים וזמינותו. Colocalization של ריאגנטים מקלה את השימוש מרובים הנוגדן זוגות בשקופית אחת ללא אשיג ומאפשר אופטימיזציה של כל זוג באופן עצמאי עם הפרעות על זוגות אחרים12. תוצאות אלה מצביעים על שהשבב הצמד הוא טכנולוגיה מדרגיים יכול לשמש עבור כימות מרובבת חלבון.

Figure 1
איור 1. סכמטי של הליך assay משווה (א) יחיד ושיטות העברה כפול (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. סכמטי מציג הבדלים בין יחיד, כפול-העברת. (א) שיקוף של ריאגנטים העברת מגביר את היישור הלקוי זוויתי בין השקופית השלב XY הזרקת דיו. (ב) כפול-העברת השיטה מתגבר על אי-התאמות זוויתי. חיבור מקורי אסמכתא 14 בעלי הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. צילום של המנגנון snap- (א) נפתח המכשיר. (b) המכשיר סגור. (ג) תצוגת פרספקטיבה של המכשיר. בקצרה, (i) העברת שקופיות הם מוצבים לתוך מחזיק שקופיות ודחף נגד סיכות יישור באמצעות את pogopin רכוב על בוכנות. (ii) השקופיות assay הממוקמת מעל pogopins, דחף את הסיכות יישור באמצעות קבוצה שנייה של בוכנות. (iii) המעטפת העליונה הממוקמים על המחזיק שקופיות, מוכנס לתוך הכלוב. לחץ מיושמת באמצעות הכרטיסיה הסגר לדחוס את pogopin ולהביא את השקופיות ביחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. העברה קולקטיבית של כתמים באמצעות שבב snap- קרינה פלואורסצנטית סריקה באמצעות 532 ננומטר, לייזרים nm 633 להפגין העברה של נוגדנים על גבי ניטרוצלולוזה (א) שקופית (חיבור מקורי אסמכתא 14 עם הרשאה) ו (ב) זכוכית שקופית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5. קרינה פלואורסצנטית דימוי שקופיות assay ועיקולים סטנדרטי של חלבונים 50 נמדדו במקביל תוך שימוש בשיטת העברה כפולה. (א) זריחה דימוי שקופיות assay ליצירת עיקול רגיל. (ב) תקריב של מערך. סרגל קנה מידה = 2 מ מ. עקומות (ג) תקן 50 חלבונים. קווי שגיאה חושבו ככל סטיות תקן מן 3 ניסויים עצמאית. חיבור מקורי אסמכתא 14 בעלי הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

חלבון שם הריכוז ההתחלתי (ng/ml) לוד (pg/ml) חלבון שם הריכוז ההתחלתי (ng/ml) לוד (pg/ml)
ANG2 500 1.3 × 104 IL-6b 1 2.1 × 102
BDNF 500 × 10 1.02 IL-5 50 77 CA 15-3 * 1 4.9 × 103 IL-4 1000 1.5 × 104 CEA 1000 5.4 × 103 IL-2 50 76 CXCL10/IP-10 50 1.7 × 102 LEP 200 4.0 × 102 ה-CRP 200 44 מיג 500 11 × 102 ENG 1000 6.2 × 102 CCL3/MIP-1Α 50 3.3 EGF 50 1.8 × 102 CCL4/MIP-1Β 50 12 EGFR 200 1.9 × 102 MMP-3 500 × 10 1.02 FAS-L 500 4.5 × 102 M-CSF 500 8.2 × 103 FGF 500 × 10 1.03 MMP-9 200 3.1 × 102 G-CSF 500 39 CCL2/MCP-1 50 55 GM-CSF 50 3.8 NCAM-1 500 1.7 × 103 GRO-Α 50 3.0 × 102 Β-גורם הגדילה העצבי 200 1.4 × 103 HER2 500 3.5 × 103 NT-3 200 5.8 × 102 PDGF-BB 200 73 OPN 500 1.9 × 103 IL-1Β 500 7.9 × 102 RBP4 200 1.2 × 102 IL-1ra 200 1.1 × 103 SPARC 1000 4.6 × 104 IL-15 50 8.2 × 102 TNF-Α 50 4.4 IL-12 1 30 TNF-RI 50 1.3 × 102 IL-11 500 1.2 × 103 TNF-RII 50 12 IL-10 500 6.1 × 102 FAS/TNFRSF6 200 2.8 × 102 IL-8 50 6.6 uPA 200 24 IL-7 2.5 26 uPAR(CD87) 200 76 IL-6 1000 84 VEGF 200 6.7 × 102

טבלה 1- ריכוז חלבון, LODs מאגר של 50-פלקס וזמינותו. לוד עבור CA 15-3 הוא U/ml (*). חיבור מקורי אסמכתא 14 בעלי הרשאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעבודה זאת, הובאו טכנולוגיה שבב הצמד שעושה את immunoassays cross-reactivity ללא מולטיפלקס הנפוצה של החוקרים עם הגדרת הניסוי הבסיסי. שונה קיים נוגדן מיקרו-מערכים, שהמשגיח microarray אין צורך עבור משתמשי קצה. יחיד והן בשיטות העברת כפול מודגמות, ומאפשרת העברה כפולה דיוק מעולה יישור למטה כדי ~ μm 40 נקודות 98%, עם אי-התאמות הגדול של מיקרומטר 6314. מנגנון הצמדה הרומן פותחה לצלם בנוחות שתי שקופיות עם לחץ עקבי, לנגישים לחוקרים טכנולוגיה זו. העברת ריאגנט אמין ממומש בשקופיות בציפוי ניטרוצלולוזה אלא גם בשקופיות זכוכית רגילה, הרחבה משמעותית של היישום של טכנולוגיה זו ללא הצורך של הכשרה נרחבת. כדי להדגים את השימושיות של השבב snap, מתכלה 50-ה-plex נערך באמצעות שקופיות קדם הבחינו ומאוחסן, 70% של החלבונים בתאריך LODs טווח של pg/mL14. בהשוואה immunoassays מולטיפלקס הקיימים החלים ודבס תערובת, יתרון חשוב של ACM ואת הטכנולוגיה שבב snap הוא כי מבחני על שבב אינם תלויים אחד לשני, ובכך מאפשר הוספה או הסרה של כל הנוגדן זוגות ללא מפריעה כל זוגות אחרים. עשרות עד מאות חלבונים ניתן למדוד בו זמנית עם שבב snap, ובכך קיצור זמן assay לעומת שיטות אחרות כגון טורי המדידה אוטומטית על ידי דגירה רציפים אשר דורש יישום טורי של כל נוגדן 17. רק sub-nanoliter של כל נוגדן נדרש עבור ייצור השבב snap, שהופך אותו כלכלית יותר מאשר immunoassays קונבנציונלי.

ריכוז נוגדן בשימוש והשלבים הדגירה אנטיגן הם קריטיים כדי להשיג רגישות גבוהה וזמינותו. בייצור של snap chips, ריכוז נוגדן ניתן למטב בהתאם זיקתו של זוגות נוגדן ואת סוג של השקופיות assay (ניטרוצלולוזה או שאינם ניטרוצלולוזה). הכרכים של כל נקודה נוגדן ניתן להתאים בהתאם קיבולת שהמשגיח והדיוק יישור, מרכז למרכז המרווח בין המקומות יכול להשתנות בהתאם. לאחר העברת תאי אל השקופית assay, אנחנו מודגרות השקופית assay בטמפרטורת החדר הדגירה לילה ח' 1-4 ° C יכול לתת יותר קיבולת איגוד נוגדן. BSA חינם מייצב פתרונות (ראה את הטבלה של חומרים) שימשו כאן כדי לחסום את השקופית assay לאחר המקננת מוניות. ריאגנטים חסימה אחרים כגון סרום בעל חיים או חלב יפעלו גם עבור יישום זה.

Immunoassays מרובבת, פרוטוקולים עבור שקופיות שאינן ניטרוצלולוזה בכימיה משטח שונים יכול להיות שפותחה, אופטימיזציה. גורם לדילול שונות ניתן לבצע עיקולים סטנדרטית בהתאם החלבונים היעד. Fluorophores שונים יכול לשמש כדי לתייג דבס, השקופית ניתן לסרוק באמצעות לייזר-אורך גל שונה לאוסף אות.

כיום, צפיפות של כתמים/cm 6252 הושגה עם שיטת העברה כפולה14. כדי לשפר את היכולת multiplexing של השבב snap, מספר אסטרטגיות הינם זמינים. ראשית, אמצעי אחסון קטן יותר יכול לשמש כדי להקטין את הגודל של המקומות, ובכך מאפשר למרחק ממרכז למרכז קצר בין כתמים לצפיפות של מערך מוגברת. שנית, ניתן לבחור שקופית העברה עם משטח יותר הידרופובי כדי להקטין את גודל המקום. שלישית, יישור טוב יותר בין מיקרו-מערכים שני אולי להיות מושגת על ידי ביצוע התאמת משובח של המאתר הזרקת דיו, נוספים מיטוב הפרמטרים spotting כמו המרחק בין חרירי על פני שקופיות.

לגבי כל נוגדן מבוססי immunoassays, הביצועים של ראגנטים שבב הצמד כפוף זמינות ואיכות נוגדנים. השבב snap פועלת באמצעות תבנית assay כריך, שהיא תבנית assay הנפוצה ביותר ב- ELISA בשל רגישות גבוהה וספציפיות המוענקת על ידי האיגוד כפול, רציפים של זוג נוגדנים מיקוד epitopes שונים, אבל זה תלוי הזמינות של זוג תואם נוגדנים הדרושים עבור לכידת וזיהוי של החלבון היעד.

הערך של טכנולוגיית השבבים הצמד הוא הקים immunoassays, וזה צפוי כי זה עשוי לשמש עבור כל התגובות כימי וביוכימי הדורשות יישום ריאגנטים שונים ללא קרוס-contaminations18,19 , 20 , 21 , 22. למעשה, השבב snap מספקת פתרון כללי אספקת שונים ריאגנטים קדם הבחינו מפני microarray-כדי-microarray, ובכך ביטול השיוך הזיוף שבב עם ההליך assay, ואין לכן מסייע מיעון " מאקרו-כדי-micro"מגשרים אתגר23. לדוגמה, השבב snap שימש במשך assay עיכוב אנזים הומוגנית 4-פלקס לנתח בתנאים 128 עם תזמון מדויק, תוצאות דומות נפח גדול ניסויים14. זה גם הוחל על רקמות מרובבת מכתים. בנוסף, זה יכול לתרום סמים הקרנת יישומים כדי לבדוק את אלפי חומרים כימיים על חיידקים שונים או תאים, תא בודד ניתוח21,24, או כדי לבדוק תנאים שונים ביחיד או צעד מרובת כימי תגובות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אוניברסיטת מקגיל הגישה בקשה לרישום פטנט על היבטים מסוימים של עבודה זו עם Huiyan Li, Juncker דוד כמו ממציאים.

Acknowledgments

אנו מודים ד ר רוב Sladek עבור השימוש המאתר הזרקת דיו. אנו להכיר הסופי התמיכה של קנדי מכוני הבריאות מחקר (CIHR), את מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC), מכון המחקר הקנדי של החברה סרטן, קרן קנדה עבור חדשנות (CFI). די. ג'יי תודה תמיכה של כיסא מחקר קנדה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline tablet Fisher Scientific 5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5 Rockland s000-06
Tween-20 Sigma-Aldrich p1379
Bovine serum albumin Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 001-000-162
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer SurModics, Inc SG02
Nitrocellulose coated slides Grace Bio-Laboratories, Inc 305116
Aminosilane coated slides Schott North America 1064875
Snap Device Parallex BioAssays Inc. PBA-SD01
Inkjet microarray spotter GeSiM Nanoplotter 2.0
Slide module gasket Grace Bio-Laboratories, Inc 204862
Humidity Stabilization Beads Parallex BioAssays Inc. PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software Media Cybernetics Version 4.5
Fluorescence microarray scanner Agilent SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software GraphPad Software GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody R&D Systems MAB10972
Endoglin protein R&D Systems 1097-EN
Endoglin detection antibody R&D Systems BAF1097
IL-6a (see Table 1) R&D Systems
IL-6b (see Table 1) Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
  2. Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
  3. Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
  4. Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
  5. Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).
  6. Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
  7. Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
  8. Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
  9. Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
  10. Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
  11. Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
  12. Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
  13. Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
  14. Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
  15. Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
  16. Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
  17. Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
  18. Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
  19. Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
  20. Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
  21. Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
  22. Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
  23. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
  24. Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).

Tags

Bioengineering גיליון 129 כריך immunoassays נוגדנים מרובב cross-reactivity חינם המאתר-חינם הצמד צ'יפ
הצמד הצ'יפ בשביל כריך מרובבת Cross-reactivity חופשי ונטול שהמשגיח Immunoassays
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, H., Bergeron, S., Larkin, H.,… More

Li, H., Bergeron, S., Larkin, H., Juncker, D. Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays. J. Vis. Exp. (129), e56230, doi:10.3791/56230 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter