Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Snap Chip voor cross-country-reactivity-gratis en Spotter-gratis Multiplexed Sandwich-immunoassay

Published: November 13, 2017 doi: 10.3791/56230
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,3, 1,2
1McGill University and Génome Québec Innovation Centre, 2Biomedical Engineering Department, McGill University, 3Parallex BioAssays Inc.

Summary

We tonen een module chiptechnologie voor het uitvoeren van cross-country-reactivity-vrije multiplexed sandwich-immunoassay door simpelweg twee dia's uitlijnen. Een apparaat module wordt gebruikt voor het op betrouwbare wijze overbrengen van reagentia van microarray-naar-microarray. De module-chip kan worden gebruikt voor alle biochemische reacties vereisen colocalization van verschillende reagentia zonder kruisbesmetting.

Abstract

Multiplexed eiwit analyse blijkt superieur diagnostische gevoeligheid en nauwkeurigheid in vergelijking met enkele eiwitten. Het antilichaam microarrays is voorzien van duizenden micro-schaal immunoassay gelijktijdig uitgevoerd op een enkele chip. Sandwich assay formaat assay specificiteit verbetert door het detecteren van elke doelstelling met twee antilichamen, maar lijdt aan Kruisallergie tussen reagentia dus beperken hun multiplexing vermogens. Colocalization microarray (ACM) van de antilichaam is ontwikkeld voor cross-country-reactivity-vrije multiplexed eiwit detectie, maar vereist een dure spotter on-site voor microarray fabrikatie tijdens testen. In dit werk tonen we een module-chiptechnologie die reagens van microarray overbrengt-naar-microarray door eenvoudig uitlijnen twee chips samen, dat dus geen spotter is nodig tijdens de incubatie van de steekproef en de verdere toepassing van detectie van antistoffen (wat schar betreft) op opslag van vooraf gevlekte dia's, het prepareren van objectglaasjes uit assay uitvoering distantiëren. Beide een- en tweepersoonskamers overdracht methoden worden voorgesteld om nauwkeurige uitlijning tussen de twee microarrays en de fabricage van de dia voor beide methoden worden beschreven. Resultaten tonen aan dat < 40 μm uitlijning is bereikt met dubbele overdracht, een dichtheid van de matrix van 625 vlekken/cm2te bereiken. Een 50-plexed-immunoassay verricht om aan te tonen van de bruikbaarheid van de chip module in multiplexed eiwit analyse. Detectiegrenzen van 35 eiwitten zijn in het bereik van pg/mL.

Introduction

Een panel van biomarkers bestaande uit meerdere eiwitten kan bieden hogere gevoeligheid en specificiteit dan een enkele biomarker in de diagnose van complexe ziekten zoals kanker1,2. De enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA) is de technologie van de gouden standaard in klinische laboratoria bereiken van een limiet van detectie bij lage pg/mL in plasma, maar grenzen aan één doel per assay3,4,5gebruikt. Antilichaam microarrays zijn ontwikkeld voor de opvang van duizenden verkleinde testen uitgevoerd gelijktijdig op een enkele Microscoop dia6,7,8. Echter het multiplexing vermogen van deze methode wordt beperkt door reagens gestuurde Kruisallergie, die voortvloeien uit de toepassing van een mengsel van wat schar betreft, en wordt het moeilijker met een toenemend aantal doelstellingen9,10 , 11. Pla et al. hebben verklaard dat de daaruit voortvloeiende kwetsbaarheid van een multiplex sandwich assay schalen als 4N(N-1) waarbij N het nummer van de streefcijfers12is.

Om af te zwakken Kruisallergie in antilichaam microarrays, microarray antilichaam-colocalization is (ACM) ontwikkeld in ons laboratorium voor multiplex sandwich assay12. Capture antilichamen (cabines) zijn bevlekt op een substraat met een microarray spotter. Nadat blokkerende monsters worden toegepast op het oppervlak, en vervolgens afzonderlijke wat schar betreft zijn gespot op de dezelfde plekken met de cAb-antigeen-complex. Alle Kruisallergie-scenario's tussen antilichamen en antigenen kunnen worden verlicht met ACM en detectiegrenzen op pg/mL zijn bereikt. Het test-protocol vereist echter voorbereiden en de wat schar betreft spotten tijdens de experimenten met behulp van een on-site microarray spotter met hoge precisie voor uitlijning doel, namelijk duur en tijdrovend, beperking van de ruime toepassing van deze technologie in andere laboratoria. Een handheld ACM, genaamd module chip is ontwikkeld voor cross-country-reactivity-vrije en spotter-vrije multiplex sandwich immunoassay13,14,15. Cabines en wat schar betreft worden vooraf bevlekt op een dia assay en een overdracht dia respectievelijk in microarray opmaken en opgeslagen. Tijdens de test, de dia's worden opgehaald en een microarray van wat schar betreft collectief zijn overgezet naar de assay dia door gewoon het uitlijnen van de twee chips samen. Een module-apparaat wordt gebruikt voor betrouwbare reagens overdracht. Nitrocellulose bedekt dia's met een relatief grote antilichaam bindingscapaciteit zijn gebruikt als de assay dia's op te vangen van de vloeibare druppeltjes en aldus een reagens overdracht vergemakkelijken, echter de dia's zijn duurder dan reguliere glas dia's en microarray scanners compatibel met niet-transparante dia's zijn nodig voor signaal overname.

In dit werk tonen wij het protocol van het uitvoeren van een multiplex sandwich-immunoassay met een module-chip. Een apparaat van de nieuwe module is ontwikkeld voor meer handige en betrouwbare reagens overdracht van microarray-naar-microarray. Nog belangrijker is, hebben hier we de overzetmethode reagens op regelmatige glas dia's met de module-chip opgericht. 1024 plekken werden met succes overgebracht en uitgelijnd op een glasplaatje, aanzienlijk uitbreiden van het gebruik van deze technologie in de meeste laboratoria.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fabricage en opslag van snap chips

  1. interne overdrachtmethode ( Figuur 1a)
    1. Spot cAb oplossingen met 400 µg/mL antilichamen en 20% glycerol in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op een nitrocellulose (of een functionalized glas) assay dia met een inkjet microarray spotter 13 bij een relatieve vochtigheid van 60% (1.2 nL voor elke vlek) met 800 µm center-naar-midden afstand. Zorg ervoor dat de dia is vastgesteld op de spotter dek volgens een hoek (hier, de bodem verlaten hoek werd gebruikt).
    2. De gevlekte assay dia bij kamertemperatuur voor 1 h met een relatieve vochtigheid van 60% Incubeer.
    3. Klem een dia module pakking met 16 vakken op de assay dia te verdelen in 16 wells. Spoel de dia drie keer door het toevoegen van 80 µL van PBS met 0,1% Tween-20 (PBST) in elk goed en schudden op 450 rpm op een shaker, 5 min telkens.
    4. Toevoegen 80 µL van het blokkeren van oplossingen voor elk goed en laat gedurende 1 h op 450 rpm.
    5. Verwijderen van de pakking en droog de assay dia met een stikstofstroom.
    6. Een overdracht dia op het dek van de spotter fix en druk op de linkerbenedenhoek van de dia tegen de bodem verlaten hoek van het dek spotter. Inkjet spot een array van uitlijning merken (een oplossing van polystyreen micro-parels) met dezelfde indeling als die bij de cabines.
    7. Laat de uitlijning marks droog. Flip de overdracht dia en zet het terug op het dek van de spotter, vaststelling tegen de linker onderhoek.
    8. Bereiden de dAb spotten oplossingen met 20 µg Mo/mL antilichamen, 20% glycerol en 1% BSA.
    9. Met behulp van de spotter ' s camera, neem een foto van een uitlijning is ingeschakeld. Uitvoering van deze foto in het spotten programma als een fiducial en krijgen van het systeem van de erkenning van het beeld van de inkjet-spotter te identificeren van het meest bovenste linker merk. Gebruik de coördinaat als de eerste plek van de dAb-matrix. Plek 8 nL per druppel met een center-naar-midden afstand van 800 µm.
  2. Dubbele overzetmethode ( Figuur 1b)
    1. een overdracht van dia 1 plaats op het dek van de spotter inkjet tegen de bodem verlaten hoek. Ter plaatse cabines oplossingen met 400 µg/mL antilichamen, 20% glycerol en 1% BSA in PBS op de dia met een inkjet microarray spotter bij een relatieve vochtigheid van 60% (0,4 nL voor elke vlek en ~ 200 µm in diameter). De centrum-naar-midden afstand is 400 µm.
    2. Snap de overdracht dia met een nitrocellulose bekleed (of een functionalized glas) assay-dia met behulp van een apparaat module ( Figuur 2) overdracht van de cabine druppels op de dia die bepaling.
      1. Beurt alle zes knoppen aan de zijkant van het apparaat van de module door 90 graden te trekken en vergrendelen van alle plunjers in geopende toestand. De overdracht dia invoegen door de houder van de dia in het recipiënt met de afgekapte hoek tegenover de vaste pogo-Pins. De eerste set van drie knoppen voor het vrijgeven van de plunjers met de gouden pogo-Pins en zorg ervoor dat de dia's worden geduwd tegen de uitlijning pinnen.
        2. Een nitrocellulose-gecoate dia invoegen
      2. in de module apparaat ondersteboven zittend op de 4 pogo-pins. De tweede set van drie knoppen loslaat plunjers met de zilveren speld en ervoor te zorgen dat de dia's worden geduwd tegen de uitlijning pinnen.
      3. Sluit het apparaat module door het plaatsen van de bovenste schelp op de houder van de dia met behulp van de pijlers van de uitlijning en de gaten voor een nauwkeurige positionering.
      4. Het apparaat gesloten module invoegen in zijn kooi en duw de sluiting tab helemaal naar beneden om de microarrays face-to-face tijdens het toepassen van de juiste druk. Gesloten voor 1 min. houden
    3. Scheiden van de dia's. Incubeer de assay dia bij kamertemperatuur voor 1 h met een relatieve vochtigheid van 60%. Wassen, blokkeren en drogen van de assay dia, zoals beschreven in stappen 1.1.3 - 1.1.5.
    4. Plaats een andere overdracht dia op de inkjet spotter dek en duw tegen de bodem verlaten hoek. Ter plaatse schar oplossingen met 50 of 100 µg/mL van antilichamen (zie tabel 1), 20% glycerol, en 1% BSA in PBS. Ervoor zorgen dat elke vlek 0.8 nL en de centrum-naar-midden afstand tussen plekken is 400 µm.
    5. De bepaling en de overdracht dia opslaan. Zegel van zowel de test en de overdracht dia's in een luchtdichte zak met droogmiddel en zet in een vriezer van-20 ° C.

2. Multiplexed immunoassay met module chips

  1. ophalen de assay dia uit de diepvries. Laat de zak verzegeld gedurende 30 minuten totdat de dia tot kamertemperatuur komt.
  2. Voorbereiden 7-punts seriële verdund monsteroplossingen door stekelige eiwitten in PBS met 0,05% Tween-20.
    Opmerking: Hier, een 5-fold verdunningsfactor wordt gebruikt. De startende concentraties voor elke proteïne zijn vermeld in tabel 1.
  3. Voorbereiden monsteroplossingen zo nodig. Bijvoorbeeld, Verdun menselijk serum 4 keer in PBST buffer.
  4. Klem van een 16-vaks pakking op de dia assay.
  5. Vul één kolom met 8 putjes met de 7 eiwit verdunning oplossingen en een bufferoplossing PBST eiwit-gratis door pipetteren. Pipetteer van de monsteroplossingen in de andere 8 putten op dezelfde dia..
    Opmerking: 80 µL oplossingen worden past in elk goed. Meer dia's kunnen worden gebruikt om aanvullende monsters indien nodig meten.
  6. De monsters op een shaker op 450 rpm 1 uur bij kamertemperatuur of voor overnachting bij 4 ° C. wassen de dia drie keer met PBST in het roteerapparaat bij 450 rpm, 5 min telkens uit te broeden. Verwijder de pakking en drogen van de dia onder een stroom van stikstofgas.
  7. Halen de overdracht dia met wat schar betreft uit de vriezer. Houd de zak verzegeld gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens, Incubeer de dia in een gesloten kamer (b.v. leeg tips doos) bevattende 60% vochtigheid stabilisatie bolletjes voor 20 min voor rehydratie.
  8. Snap de overdracht dia met de assay-dia met behulp van een apparaat van de module ( Figuur 2) overdracht van de dAb-druppels. Zie punt 1.2.2 voor de werking van het apparaat module.
  9. Scheiden de dia's. Incubeer de assay dia in een gesloten kamer bevattende 60% vochtigheid stabilisatie bolletjes voor 1 h. klem de assay dia met een 16-vaks pakking en spoel de dia 4 keer met PBST op een shaker op 450 rpm, 5 min telkens.
  10. Pipetteer 80 µL van oplossingen met 2,5 µg Mo/mL streptavidine fluorophore in PBS in elk putje. Incubeer gedurende 20 min in een roteerapparaat bij 450 rpm.
  11. Spoel de dia 3 keer met PBST en eenmaal met gedestilleerd water in het roteerapparaat bij 450 rpm. Verwijder de pakking en drogen van de dia met behulp van stikstofgas.

3. Dia scannen en data analyse

  1. de assay dia scannen met een fluorescentie microarray scanner met behulp van de 635-nm-laser.
  2. Extract van de netto intensiteit van elke vlek met behulp van een analyse software (bijvoorbeeld matrix-pro analyzer) 16.
  3. Berekenen de limiet aantoonbaarheidsgrens (LOD) voor elke proteïne met behulp van een software van de statistieken en de eiwit-concentratie in de monsters.
    Opmerking: De LOD wordt gedefinieerd als het Y-snijpunt van de standaard cuRvE verhoogd met drie maal de standaardafwijking van drie onafhankelijke tests.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De test procedure voor zowel enkele als dubbele overdracht methoden is afgebeeld in Figuur 1. De cabines zijn bevlekt rechtstreeks op de dia assay in één overdracht, en de wat schar betreft zijn overgezet naar de dia assay van gebruik in een spiegel patroon van de cab-bestanden (Figuur 1a). Slechts één overdrachtprocedure is vereist, maar deze methode lijdt aan afwijking tussen de twee microarrays, voornamelijk veroorzaakt door de hoekige afwijking tussen de dia en de inkjet gantry (Figuur 2). Een aanpak van deze uitdaging is voor de overdracht van zowel cabines en wat schar betreft opeenvolgend op de dia die assay na spotten, en tot vaststelling van de dia's in de module apparatuur goed (Figuur 1b). Met behulp van deze methode, worden beide microarrays overgebracht naar de exact dezelfde positie. Geen beeld erkenning systeem of uitlijning marker is vereist voor de dubbele overdrachtmethode. De afwijking voor 98% van de vlekken was binnen 41 µm, 6-fold verbetering ten opzichte van de interne overdracht methode14.

De module-apparatuur is ontworpen om gemakkelijk te gebruiken zonder enige training en minimaliseren van het risico van matrix afwijking. De dia's zijn samengebracht met nauwkeurige positionering dankzij uitlijning pinnen gemeenschappelijk aan zowel de test en de overdracht dia's. De overdracht dia is een beetje kleiner te passen onder de assay dia. Wanneer geschorst door de pogo-pins, totdat het apparaat module wordt gesloten. Een spacer is opgenomen op de overdracht dia handhaven een micrometer en middelgrote kloof waarmee betrouwbare druppel overdracht aan het glasplaatje. Ten slotte, de kooi en de sluiting tab zijn ontworpen om de druk die nodig is voor effectieve overdracht bij elke breuk voor reproduceerbaar, hoge kwaliteit overdracht van toepassing. Een foto van het module-apparaat is afgebeeld in Figuur 3.

Representatieve beelden ter illustratie van de resultaten van de overdracht van het reagens op een dia nitrocellulose en een glasplaatje worden weergegeven in Figuur 4. Alexa 532 label IgGs werden gebruikt als het eerste reagens en Alexa 647 label IgGs werden gebruikt als het tweede reagens. Na de overdracht, de dia is gescand met 532 nm en 635 nm lasers. Het resultaat toont aan dat 3136 (voor de nitrocellulose dia) of 1024 (voor het glasplaatje) microspots werden overgedragen met nul fout in de assay dia's en geen kruisbesmetting werd waargenomen op het overbrengen van het tweede reagens. Bij het gebruik van glas dia's, is het mogelijk meer hydrofobe om oppervlak te maken door de functionalization, dus vermindering van de grootte van elke vlek en verkleinen van de afstand van de plek-naar-spot voor het overbrengen van een groter aantal plekken. Dit werk wordt de toepassing van de technologie van de chip module vergroot tot veelgebruikte glazen substraten.

Standaard curven van een 50-plex immunoassay targeting borstkanker gerelateerde eiwitten worden geïllustreerd in Figuur 5, overeenkomt met de grootste multiplex sandwich antilichaam microarray tot nu toe zonder Kruisallergie. Dubbel-overdracht methode werd gebruikt in deze test, de dia is gescand en de intensiteit van de fluorescentie werd gekwantificeerd voor het genereren van de standaard curven. 35 van de 50 eiwitten bereikt LODs bij pg/mL (zie tabel 1) en verder kan worden verbeterd door het optimaliseren van de test omstandigheden. Colocalization van reagentia vergemakkelijkt het gebruik van meerdere paren van het antilichaam voor een enkele dia zonder Kruisallergie en laat de optimalisatie van elk paar zelfstandig met geen interferentie van andere paren12. Deze resultaten wijzen erop dat module-chip is een schaalbare technologie die kan worden gebruikt voor multiplexed eiwit kwantificering.

Figure 1
Figuur 1. Schematische van assay procedure vergelijken a single en (b) dubbele overdracht methoden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Schematische waarin verschillen tussen single - en double-transfer. (a) mirroring van de overdracht reagentia versterkt de hoekige afwijking tussen de dia en het stadium van de XY inkjet. (b) dubbele-overzetmethode overwint de hoekige afwijking. Aangepast van referentie 14 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. De foto's voor het apparaat module. (a) geopend apparaat. (b) gesloten apparaat. (c) perspectief-uitzicht op het apparaat. Kort, (i) de overdracht van dia's worden geplaatst in de dia houder en duwde tegen uitlijning pinnen met behulp van de pogopin gemonteerd op plunjers. (ii) de assay dia's zijn geplaatst op de top van de pogopins en duwde tegen de uitlijning pinnen met behulp van een tweede reeks plunjers. (iii) de hoogste shell worden geplaatst op de top van de dia houder en ingevoegd in de kooi. Een druk wordt toegepast met behulp van het tabblad sluiting voor het comprimeren van de pogopin en de dia's samenbrengen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. Collectieve overdracht van vlekken met behulp van een chip module. Fluorescentie scan met 532 nm en 633 nm lasers om aan te tonen van de overdracht van antistoffen op (a) een nitrocellulose dia (aangepast van referentie 14 met toestemming) en (b) glazen schuif. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5. Fluorescentie afbeelding van een dia assay en standaard curven van 50 eiwitten gemeten in parallel met dubbele overzetmethode. (a) fluorescentie afbeelding van een dia assay voor het genereren van een standaard curve. (b) close-up van een matrix. Schaal bar = 2 mm. (c) standaard curven voor 50 eiwitten. Foutbalken werden berekend als standaardafwijking uit drie onafhankelijke experimenten. Aangepast van referentie 14 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Eiwit naam Beginconcentratie (ng/ml) LOD (pg/ml) Eiwit naam Beginconcentratie (ng/ml) LOD (pg/ml)
ANG2 500 1.3 × 104 IL-6b 1 2.1 × 102
BDNF 500 1.0 × 102 IL-5 50 77 CA 15-3 * 1 4.9 × 103 IL-4 1000 1,5 × 104 CEA 1000 5.4 × 103 IL-2 50 76 CXCL10/IP-10 50 1.7 × 102 LEP 200 4.0 × 102 CRP 200 44 MIG 500 11 × 102 ENG 1000 6.2 × 102 CCL3/MIP-1Α 50 3.3 EFG 50 1.8 × 102 CCL4/MIP-1Β 50 12 EGFR 200 1.9 × 102 MMP-3 500 1.0 × 102 FAS-L 500 4,5 × 102 M-CSF 500 8.2 × 103 FGF 500 1.0 × 103 MMP-9 200 3.1 × 102 G-CSF 500 39 CCL2/MCP-1 50 55 GM-CSF 50 3.8 NCAM-1 500 1.7 × 103 GRO-Α 50 3.0 × 102 Β-NGF 200 1.4 × 103 HER2 500 3.5 × 103 NT-3 200 5,8 × 102 PDGF-BB 200 73 OPN 500 1.9 × 103 IL-1Β 500 7.9 × 102 EIWITRBP4 200 1.2 × 102 IL-1ra 200 1.1 × 103 SPARC 1000 4.6 × 104 IL-15 50 8.2 × 102 TNF-Α 50 4.4 IL-12 1 30 TNF-RI 50 1.3 × 102 IL-11 500 1.2 × 103 TNF-RII 50 12 IL-10 500 6.1 × 102 FAS/TNFRSF6 200 2,8 × 102 IL-8 50 6.6 uPA 200 24 IL-7 2.5 26 uPAR(CD87) 200 76 IL-6een 1000 84 VEGF 200 6.7 × 102

Tabel 1. Eiwit concentratie en LODs in de buffer van de 50-plex assay. De LOD voor CA 15-3 is in U/ml (*). Aangepast van referentie 14 met toestemming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit werk, dat wij hebben ingediend een module-chiptechnologie waarmee de cross-country-reactivity-vrije multiplex immunoassay wijd-beschikbaar voor de onderzoekers met elementaire experimentele opzet. Anders dan de bestaande antilichaam microarrays, geen microarray spotter is nodig voor eindgebruikers. Zowel enkele als dubbele overdracht methoden worden gedemonstreerd, en dubbele overdracht biedt superieure uitlijning nauwkeurigheid neer aan ~ 40 μm voor 98% spots, met de grootste afwijking van 63 µm14. Een nieuwe module apparaat werd ontwikkeld om een gunstige snap de twee dia's met consistente druk, deze technologie toegankelijk maken voor onderzoekers. Betrouwbare reagens overdracht wordt gerealiseerd op nitrocellulose beklede dia's, maar ook op regelmatige glas dia's, aanzienlijk uitbreiden van de toepassing van deze technologie zonder de behoefte aan uitgebreide training. Om aan te tonen van de bruikbaarheid van de module-chip, een 50-plex-immunoassay werd uitgevoerd met behulp van vooraf gevlekte en opgeslagen dia's, en 70% van de eiwitten in het bereik van pg/mL14LODs bereikt. Vergeleken met bestaande multiplex immunoassay die wat schar betreft als een mengsel van toepassing zijn, is een belangrijk voordeel van de ACM en de module-chiptechnologie dat de tests op een chip onafhankelijke aan elkaar zijn, waardoor voor het toevoegen of verwijderen van een antilichaam paren zonder bemoeien met eventuele andere paren. Tientallen tot honderden van eiwitten kunnen gelijktijdig worden gemeten met een module-chip, dus verkorting assay tijd in vergelijking met andere methoden zoals de geautomatiseerde seriële meting door sequentiële incubatie waarvoor seriële toepassing van elke antilichaam- 17. Alleen sub-nanoliter van elke antilichaam nodig is voor de module chip fabrikatie, waardoor het economischer dan conventionele immunoassay.

De gebruikte concentraties van antilichaam en de antigeen-incubatie stappen zijn essentieel voor het bereiken van hoge assay gevoeligheid. In de fabricage van de module chips, kan antilichaam concentratie worden geoptimaliseerd afhankelijk van de affiniteit van het antilichaam-pairs en de soorten de assay dia's (nitrocellulose of niet-nitrocellulose). De volumes van elke vlek antilichaam kunnen worden aangepast op basis van de spotter capaciteit en Nauwkeurigheid alignering en de centrum-naar-midden afstand tussen de spots kan dienovereenkomstig worden gewijzigd. Na het overbrengen van cabines aan de dia assay, geïncubeerd we de assay dia bij kamertemperatuur voor 1 h. Overnight incubatie bij 4 ° C betere antilichaam bindingscapaciteit geven kan. BSA gratis stabilisator oplossingen werden (Zie de tabel van materialen) hier gebruikt om het blokkeren van de assay dia na cabines aan het broeden. Andere blokkerende reagentia zoals dierlijke serum of melk kunnen ook werken voor deze toepassing.

In de multiplexed immunoassay, kunnen protocollen voor niet-nitrocellulose dia's met verschillende Oppervlaktechemie worden ontwikkeld en geoptimaliseerd. Een verschillende verdunningsfactor kan worden gebruikt om standaard curven afhankelijk van het doel-eiwitten. Verschillende fluorophores kan worden gebruikt om het label wat schar betreft, en de dia kan worden gescand met behulp van een laser op een verschillende golflengte voor signaal collectie.

Op dit moment is een bevolkingsdichtheid van 625 vlekken/cm2 geboekt met dubbele overdracht methode14. Om de multiplexing vermogen van de chip module verder te verbeteren, zijn verschillende strategieën beschikbaar. In de eerste plaats kunnen de kleinere volumes worden gebruikt om de grootte van de plekken, waardoor kortere center-naar-midden afstand tussen plekken en verhoogde matrix dichtheid. Anderzijds kan men een overdracht dia met een meer hydrofobe oppervlak om de plek grootte kiezen. Ten derde, betere uitlijning tussen de twee microarrays kan worden bereikt door uitvoeren van fijnafstelling van de inkjet-spotter, en verder het optimaliseren van de spotten parameters zoals de afstand tussen de sproeiers en het oppervlak van de dia.

Voor alle antilichamen gebaseerde immunoassay is de prestaties van de module chip immunoassay onder voorbehoud van de beschikbaarheid en kwaliteit van antilichamen. De chip module maakt gebruik van een sandwich assay formaat, dat de meest gebruikte assay-formaat in ELISA vanwege de hoge gevoeligheid en specificiteit die worden geboden door de dubbele, sequentiële binding van een paar van antilichamen die verschillende epitopen targeting is, maar het is afhankelijk van de beschikbaarheid van een paar compatibel antilichamen nodig voor opname en opsporing van de doelgroep proteïne.

De waarde van de technologie van de chip module voor immunoassay wordt vastgesteld, en de verwachting is dat het kan worden gebruikt voor eventuele chemische en biochemische reacties, waarvoor de toepassing van verschillende reagentia zonder kruis-besmettingen18,19 , 20 , 21 , 22. eigenlijk de chip module biedt een algemene oplossing aan het leveren van verschillende vooraf gevlekte reagentia van microarray-naar-microarray, aldus distantieer de fabricage van de chip met de test procedure, en daarom helpt aanpakken van de " macro-naar-micro"interfacing challenge23. Als voorbeeld, is de module-chip gebruikt voor een 4-plex homogene enzym inhibitie assay voor het analyseren van 128 voorwaarden met precieze timing en vergelijkbare resultaten tot en met groot volume experimenten14. Het is ook toegepast voor multiplexed weefsel kleuring. Bovendien, kan het bijdragen aan de drug screening van toepassingen voor het testen van duizenden chemische stoffen op verschillende bacteriën of cellen, voor eencellige analyse21,24, of verschillende omstandigheden in één of meerdere stappen chemische testen reacties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

McGill University heeft ingediend een octrooiaanvraag over sommige aspecten van dit werk met Huiyan Li en David Juncker als uitvinders.

Acknowledgments

Wij danken Dr. Rob Sladek voor het gebruik van de inkjet-spotter. Wij erkennen de uiteindelijke steun van de Canadese instituten voor gezondheid onderzoek (CIHR), de natuurwetenschappen en Engineering onderzoek Raad van Canada (NSERC), de Canadese samenleving onderzoeksinstituut van kanker en de Stichting van Canada voor innovatie (CFI). D.J. dankzij steun van Canada Research Chair.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline tablet Fisher Scientific 5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5 Rockland s000-06
Tween-20 Sigma-Aldrich p1379
Bovine serum albumin Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 001-000-162
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer SurModics, Inc SG02
Nitrocellulose coated slides Grace Bio-Laboratories, Inc 305116
Aminosilane coated slides Schott North America 1064875
Snap Device Parallex BioAssays Inc. PBA-SD01
Inkjet microarray spotter GeSiM Nanoplotter 2.0
Slide module gasket Grace Bio-Laboratories, Inc 204862
Humidity Stabilization Beads Parallex BioAssays Inc. PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software Media Cybernetics Version 4.5
Fluorescence microarray scanner Agilent SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software GraphPad Software GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody R&D Systems MAB10972
Endoglin protein R&D Systems 1097-EN
Endoglin detection antibody R&D Systems BAF1097
IL-6a (see Table 1) R&D Systems
IL-6b (see Table 1) Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
  2. Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
  3. Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
  4. Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
  5. Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).
  6. Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
  7. Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
  8. Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
  9. Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
  10. Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
  11. Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
  12. Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
  13. Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
  14. Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
  15. Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
  16. Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
  17. Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
  18. Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
  19. Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
  20. Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
  21. Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
  22. Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
  23. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
  24. Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).

Tags

Bioengineering kwestie 129 Sandwich-immunoassay antilichamen multiplex snap Cross-Country-reactivity-gratis spotter-gratis chip
Snap Chip voor cross-country-reactivity-gratis en Spotter-gratis Multiplexed Sandwich-immunoassay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, H., Bergeron, S., Larkin, H.,… More

Li, H., Bergeron, S., Larkin, H., Juncker, D. Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays. J. Vis. Exp. (129), e56230, doi:10.3791/56230 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter