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Bioengineering

자동화 된 Microbioreactor 기술을 사용 하 여 분리 단백질 생산의 최적화를 위한 일반 프로토콜

doi: 10.3791/56234 Published: December 15, 2017
* These authors contributed equally

Summary

이 원고는 미생물 배양 미디어의 맞춤형 디자인에 대 한 일반적인 접근 방식을 설명합니다. Kriging 기반 실험 설계 및 microbioreactor 기술을 결합 충분 한 재배 처리량, 안정성 및 액체 미디어 처리 속도 높이기 위해 연구소 로봇에 의해 지원 되는 워크플로 반복 하 여 사용이 준비입니다.

Abstract

산업 바이오 생산 미생물 세포 공장을 사용 하 여 핵심 사업 스트레인 엔지니어링의 반복적인 프로세스 이며 bioprocess 조건의 최적화. 1 개의 중요 한 양상은 관심 제품의 미생물 형성을 위한 최적의 환경을 제공 하기 위해 재배 매체의 개선 이다. 그것은 잘 미디어 구성 전체 bioprocess 성능을 좌우할 극적으로 허용 합니다. 영양 중간 최적화 재조합 단백질을 향상 알려져 있다 미생물 시스템 및 따라서이 생산 bioprocess 개발에서 보람 있는 단계입니다. 그러나, 수시로 표준 미디어 조리법에서에서 가져온 문학, 재배 매체의 맞춤형 디자인 microbioreactor 기술 지원 뿐만 아니라 충분 한 재배 처리량, 빠른 제품 분석을 요구 하는 지루한 작업 이므로 액체에 신뢰성 있게 로봇 공학 실험실에 의하여 처리 하는 단계. 또한, 고급 수학 메서드는 합리적으로 측정 데이터를 분석 하 고 효율적으로 최적의 정보 콘텐츠를 달성 하기와 같은 병렬 실험을 설계 하는 데 필요한.

제시 프로토콜의 일반 자연 다른 실험실 장비, 다른 식 호스트 및 관심, 뿐만 아니라 추가 bioprocess 매개 변수 대상 단백질에 쉽게 적응 할 수 있습니다. 또한, 다른 최적화 목표 단백질 생산 속도, 특정 수익률, 또는 제품 품질 같은 다른 최적화 연구의 범위에 맞게 선택할 수 있습니다. 적용된 Kriging 도구 상자 (KriKit) 일반 도구에 대 한 디자인의 실험 (DOE) 향상 된 전체적인 bioprocess 최적화에 기여 하는. 그것은 또한 업스트림 및 다운스트림 프로세스 최적화에 중요 한 될 수 있는 다 객관적인 최적화를 지원 합니다.

Introduction

현대 재조합 유전자 기술 제약 산업, 동물 먹이, 유기 화학 및 식품 가공1,2,3에서 다양 한 응용 프로그램에 대 한 기술 효소의 광범위 한 사용을 수 있습니다. 대량 수량에서 기술 효소의 생산은 산업 공학에 대 한 최적화 된 재조합 단백질 생산을 위한 주요 주제 둘 다 변형 및 bioprocess 엔지니어링이 필요 하다. 효율적으로 설계 생산 종자의 생성에 대 한 서로 다른 유전자 라이브러리를 사용할 수 있습니다 예를 들어, 균형된 진 식4 또는 증가 된 분 비 효율5.

Corynebacterium glutamicum 산업 규모6,7 에서 아미노산의 중요 한 생산자가 고 재조합 단백질8의 분 비 생산에 대 한 매력적인 비 전통적인 식 호스트 나타냅니다. ,9. 일반적인 분 비 (Sec)와 트윈-아르기닌 전 (문신) 통로 C. glutamicum 에 존재 하 고 재조합 단백질 분 비10성공적으로 적용 했다. Bioprocess 공학 산업 규모 뿐만 아니라 단백질 g/L 양의11 및 대규모 발견 bioprocess 이질성에 관한 좋은 견고성을 분 비 하는 능력에서 아미노산 생산에 관한 광범위 한 경험 지켜온12,13, 산업 규모에 유망한 플랫폼 유기 체 분리 단백질의 분 비 생산에 대 한 C. glutamicum 확인 합니다.

재조합 형 단백질 생산 미생물 시스템14,15,,1617 따라서, 매체의 조정 개선 영양 중간 최적화 알려져 있다 구성은 bioprocess에서 보람 있는 단계 최적의 생산성18,19,,2021기준 개발. 미생물 배양22,,2324 결정 판 (MTPs)의 응용 프로그램에 대 한 강렬한 연구 개발 및 미생물 배양25 MTPs의 디자인에 대 한 방법을 포장 26 및 MTP 기반 microbioreactor (MBR) 시스템 온라인 모니터링 및 환경 개발 제어27,28. 마샬링 사용 실험 재배 처리량에 크게 증가 합니다. 게다가, 원자로, 생물 반응 기, 예를 들면, 거품 열 또는 흔들된 탱크의 형태소를 분석 하는 MBR 시스템 미생물 bioprocess 최적화29,,3031, 사용할 수 있습니다. 32.

일반적으로 최적화 연구 DOE 방법론 등 설계 변수 간의 상호 작용을 평가 하거나 높은 차원 검색 공간을 줄이기 위해 함께에서 더욱 강력한 되 증가 실험 처리량에서 혜택을. 따라서, MBR 시스템, 실험실 자동화, DOE의 사용 생물 공학8,16,33,,3435에서 강력한 방법으로 입증 했다.

미디어 최적화에 대 한 프로토콜 결합-의 상태--예술 실험실 자동화, MBR 기술 온라인 프로세스 모니터링 및 Kriging 기반 데이터 분석/실험 설계와 함께 제공 됩니다. Kriging 방법론 MATLAB 도구 상자 (이 하 "KriKit") 다운로드 하 고 사용할 수 있는 구현 됩니다 무료 충전36입니다. 응용 프로그램 예를 들어, C. glutamicum 와 녹색 fluorescent 분 비 단백질 (GFP) 생산의 극대화는 CgXII 최소 매체의 구성을 최적화 하 여 표시 됩니다. GFP titer 쉽게 측정할 수 있다 그리고 그것은 넓게 MBR 시스템37,,3839에 대 한 연구에 대 한 모델 단백질으로 적용 최적화 목적으로 선택 되었다.

제시 프레임 워크는 그림 1에 나와 있는 4 단계로 나누어져 있습니다. 단계 상자 프레임으로 표시 하 고 프로토콜의 섹션에 해당. (그림 1A)의 첫 번째 단계는 프로젝트 목표를 정의 하 고 필요한 방법을 결정입니다. 미상 방법론, MBR 기술 및 실험실 자동화의 조합은 강력한 데이터 처리를 요구 하는 증가 실험 처리량을 허용 한다. 두 번째 단계 (그림 1B) 중요 한 설계 변수 최적화 목표에 높은 영향 (, 중간 구성 요소)를 감지 하는 것을 목표로. 이것은 관심의 설계 변수는. 세 번째 단계 (그림 1C) 나머지 설계 변수 및 관심의 목표 사이의 기능적 관계의 더 상세한 조사를 위해 반복 최적화 구성 되어 있습니다. 연속적으로 확장 된 데이터 집합을 사용 하 여, Kriging 접근은 헤아릴 수 없는 위치에서 실험 결과 예측에 대 한 적용 됩니다. 반복 주기 Kriging 모델의 최적 또는 고원 충분 한 정확도로 예측 대로 중지 합니다. 결과 4 단계 (그림 1D), 확인 된 최적 주위 더 감도 분석 시작에서 확인 됩니다. 처음, 구분 구성 되지 중요 한 또한 최적의 지역에서 발견 되 면이 세 번째 단계에서 반복 최적화 절차 동안 진정한 보유 가정 하는 합리적입니다. 이후에, 최적화 결과 확인 하기 위해 직교 방법, 활동 분석 결과 또는 SDS 페이지 같은 응용 프로그램에 의해 조언 된다.

제시 프로토콜의 일반적인 특성 다른 실험실 장비, 다른 식 호스트 및 선택, 뿐만 아니라 더 bioprocess 대상 단백질을 쉽게 적응에 대 한 pH 값 또는 재배 온도 같은 변수를 수 있습니다.또한, 다른 최적화 목표 단백질 생산 속도, 특정 수익률, 또는 제품 품질 같은 다른 최적화 연구의 범위에 맞게 선택할 수 있습니다.

Figure 1
그림 1 : 최적화 검토의 워크플로. 4 개의 프레임 상자 프로토콜, "마음속에 연구와 정의의 방법" (제 1), "민감도 분석" (제 2), "반복 최적화" (제 3), 및 "유효성 검사" (제 4)의 섹션에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Protocol

1. 임신 연구 및 방법의 정의 (그림 1: A 파트)

참고: 최적화 목표의 정의: 필요한 제품 형성의 시간 과정 또는 단지 제한 된 시간 간격 또는 심지어 고정된 시간 포인트 관련? 또한, 안정성, 분석 정량화, 또는 재배 시간 노력 같은 잠재적인 문제를 고려 하십시오. 최종 단백질 titer 하는 대신, 다른 목표는 바이오 매스 또는 재배 시간 간주 될 수 있습니다. 바이오 매스 재배 시간 공간 시간 항복 하 여 반영 하는 동안 바이오 매스 특정 제품 수율에 의해 반영 된다. (최소) 제품의 품질 또한 목표 수 있습니다. 언급 했 듯이 다른 곳40다 객관적인 최적화, 특정 상황에 필요할 수 있습니다. 이 연구에서 재배의 17 h 후 GFP titer 최적화 목적으로 선택 되었다. GFP 형광 온라인 모델 단백질의 농도 결정 단순화이 연구에 사용할 수 있는 장비를 사용 하 여 다음 수 있습니다.
참고: 정의의 매개 변수 최적화를: CgXII 매체 16 개별 구성 요소41 이루어져 있고 216 ≈ 65000 실험 결과 완전 요인 설계에서이 모든 조사. 따라서, 검색 공간 합리적이 고 경험 기반으로 감소 될 필요가 있다. 미디어 구성 요소 최적화에 대 한 고려의 선택 가능한 전문 지식 또는 문학 데이터 지원할 수 있습니다.

  1. 결정 하는 중간 구성 요소 농도 변화 하지 해야. CgXII 매체의 최적화에 대 한 다음 구성 요소는 고정 선정 되었습니다.
    1. 포도 당 10 g/l.에 고정 이 최적화는 더 많은 포도 당 생성 더 GFP 바이오 매스를 은닉 하기 때문에 사소한입니다. 목표 비 직관적인 중간 효과 공개 했다.
    2. 3-(N-morpholino) propanesulfonic 산 (MOPS) 42 g/l.에 고정 이 일괄 처리 재배 하는 동안 충분 한 완충 용량을 제공 하 고 대사 하지.
      참고:이 최종 농도에서 MOPS 추가 하면 추가, 다른 재고 솔루션의 다른 볼륨으로도 pH 7의 시작 값 pH 7에 되지 않은. 그러나, 시작 하는 pH 값에 대 한 편차를 제외 하려면 pH 중간 컴포지션의 모든 재고 솔루션 그들의 최대 및 최소 볼륨에 추가 됩니다 확인 되어야 한다.
    3. KH24 와 K2HPO4 1 g/L 각에 고정 됩니다. 이들은 또한 완충 용량을 제공 하 고 인산 염의 근원으로 봉사.
    4. 요소는 5 g/l. 고정 이 기저 질소 소스 및 pH 안정화 에이전트, N-제한 방지 하기 위해 충분 한 제공 합니다.
    5. Biotin 0.2 mg에서 고정/L. C. glutamicum ATCC13032 biotin에 대 한 auxotrophic.
    6. Protocatechuic 산 (PCA)는 30mg/l. 고정 그것은 한 철 킬레이트 화 에이전트 역할을 합니다.
    7. 이 소 프로필-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 100 µ M에 고정 됩니다. 그것은 gfp 유전자의 표정을 유도 한다.
  2. 높고 낮은 농도 초기 감도 검 진에 대 한 미디어 구성 요소를 선택 합니다. 여기에, 3 개의 일반적인 그룹 미디어 구성 요소에서에서 구성 요소 선택 되었다. 각 구성 요소에 대 한 조사 낮고 높은 농도:
    1. 표준 질소 소스: (NH4)24 (8-32 g/L); 질소 소스의 변형 바이오 매스 관련 GFP 신호8의 최적화를 위한 유망한 것으로 알려졌다.
    2. 추적 요소: FeSO4 ∙ 7 H2O (4-16 mg/L), MnSO4 ∙ H2O (4-16 mg/L), ZnSO4 ∙ 7 H2O (0.4-1.6 mg/L), CuSO4 ∙ 5 H2O (125-501 µ g/L), NiCl2 ∙ 6 H2O ( 8-32 µ g/L) CoCl2 ∙ 6 H2O (52-208 µ g/L). 성분의 구성 CgXII 중간41의 첫번째 간행물에서 상속 됩니다. 또한, 총2MoO4 ∙ H2O (26-104 µ g/L)와 H33 (20-80 µ g/L) CgXII 중간42의 게시 된 변형에 사용 하는 추적 요소로 포함 됐다.
    3. 매크로 요소: MgSO4 ∙ 7 H2O (0.2-0.4 g/L), CaCl2 ∙ 2 H2O (5.3-21.2 mg/L). 이러한 C. glutamicum 스트레인 R 다른 중간 배경과 CgR0949 문신 신호 펩 티 드와 함께 사용 된 다른 연구14, 분 비 GFP 생산을 향상 시키기 위해 다른 divalent 양이온 중 발견 됐다.
  3. 준비 재료와 정의 절차
    참고: 그것은 정의 하 고 실험 방법을 상세한 수준에서 수정 좋습니다. 이 규격화는 다른 결과 추적 될 수 있다 다시 본질적인 생물학적 다양성 또는 다른 중간 작곡을 보장 합니다.
    참고: 미디어 솔루션 주식: 개별 재고 솔루션을 준비 하는 모든 미디어 구성 요소를 조사. 모든 구성 요소에 대 한 각기 다른 볼륨의 희석 수 있도록 농축된 주식을 준비 합니다. 즉, 디자인 계획에 따라 그들의 높은 볼륨에서 모든 재고 솔루션을 결합, 후이 최종 재배 볼륨, cf. 단락 "중간 재고 솔루션 pipetting 목록의 세대" 단계 1.3.3 초과할 수 없습니다. 경우 매우 집중된 솔루션의 추가 매우 낮은 추가 볼륨, 예: < 최종 재배 볼륨의 1/100번째 따라 재고 솔루션을 희석. 예를 들어,이 연구에서 10 µ L의 pipetting 볼륨 실현 되도록 정의 되었다. 일반적으로, 추적 요소 솔루션은 높은 집중으로 1,000fold 매체에 최종 표준 농도 관하여. 그것은 농도 참조 제조 법에 대해 배수 (X 배)로 미디어 구성 요소를 집중을. 이렇게 함으로써, 소수 자릿수 실행 불가능 pipetting 볼륨은 피 한다. CgXII 중간의 모든 재고 솔루션에 대 한 자세한 요리법 보충 문서에 제공 됩니다.
    1. 작업 세포 은행 (WCB)
      참고: 각 성장 실험에 대 한 WCB aliquot 사용 됩니다. 더 많은 aliquots가 필요한 경우 사용 100 mL 뇌 심장 주입 (BHI) 매체 당황 하 게 1000 mL 플라스 크를 흔들어 또는 글리세롤 솔루션의 추가 하기 전에 풀링된 여러 동요 플라스 크를 예방.
      1. 재조합 식 스트레인 C. glutamicum pCGPhoDBsGFP43 한 천 배지 (37 g/L BHI 파우더 20 g/L 천, 25 mg/L 대)에 한 식민지를 준비 합니다. 도금 재료 올 수 있습니다 하거나 신선한 변환 또는 cryopreserved 약 수에서.
단일 식민지;의 외관까지 30 ° C에서 품 어 이것은 일반적으로 1 ~ 2 일 걸립니다.
  • 식민지 소재와 통 플라스 크 문화 (50 mL BHI 매체 25 mg/L 대, 500 mL 당황 하 고 플라스 크, 250rpm, 떨고 직경 25 mm, 30 ° C)를 접종 하 고 품 어 하룻밤 (약 16 h).
  • 결과 셀 서 스 펜 션의 한 볼륨 500 g/L 글리세롤 살 균 솔루션의 한 볼륨으로 결합 하 고 살 균 cryopreservation 튜브에 2 mL aliquots에서 배포. -80 ° c.에 게
  • MBR 재배 프로토콜
    참고:이 고용된 BioLector MBR 시스템에 대 한 연구, 빛 흩어져 (바이오 매스) 및 GFP 형광은 강도 측정, 할당 된 특정 한 이득 값을 필요로 하는. 높은 이득, 높은 광 신호 증폭은; 이것은 또한 왜 흩어져 빛과 형광 (거리) 임의의 단위로 측정 됩니다. 바이오 매스 및 적당 한 주파수를 흔들어 및 저장 프로세스 단계 동안 높은 바이오 매스 농도 산소 한계를 피하기 위해 볼륨을 채우는 예비 실험에서 GFP 검출을 위한 적당 한 이득 값을 결정 합니다. 고용된 재배 조건 ("Flowerplates", , 꽃 모양의 48-잘 MTPs, 1200 rpm의 주파수를 흔들어 1000 µ L, 주요 탄소 소스로 포도 당 10 g/L의 볼륨 작성) 보장 산소 무제한 경작. 볼륨을 작성 하 고 48-잘 MTPs 꽃 모양에 주파수를 떨고 다른 조합에서 결과 최대 산소 전송 속도, 데이터 시트에서에서 사용할 수 있습니다. 또한, 개별 문화의 성장 결함 보조 기판 (예:질소, 미 량 원소)의 낮은 금액으로 인해 발생할 수 있습니다. 따라서, 경작의 끝에서 바이오 매스 농도 확인 합니다. 본이 연구에서는 이러한 성장 효과가 관찰 되었다.
    1. 다음과 같이 MBR 시스템 ("BioLector")에 대 한 재배 프로토콜 정의.
    2. Filterset 1: 바이오 매스, 14를 얻을. Filterset 2: pH, 이득 사전 설정입니다. Filterset 3: pO2, 이득 사전 설정입니다. 4: GFP, 80를 얻을.
    3. 진동 주파수: 1200 rpm.
    4. 온도: 30 ° c.
    5. 주기 시간: 15 분.
    6. 실험 시간: 수동 (재배 하지 중지 됩니다 자동으로).
  • 중간 재고 솔루션 pipetting 목록 생성
    참고: 거의 모든 액체 처리 로봇 시스템은 pipetting 작업 외부 파일에서 읽을 수 있습니다. 기본적으로, 필요한 최소한의 정보 전송 볼륨 및 시 약 소스의 위치 뿐만 아니라 로봇 갑판에는 기구 내의 특정 구멍 기구 위치 나타내는 각각의 대상 이다. 그러나, 다른 액체 처리 시스템에 대 한 다른 구문 고려 되어야 한다. 그림 2 는 본이 연구에서는 고용된 pipetting 시스템에 대 한 예제 파일 구조를 보여준다.
    1. 네 가지 유형의 재고 솔루션은 각 재배에 잘 pipetted:
      1. 미디어 구성 요소 솔루션을 재고 ("변형 주식") 다양 한.
      2. 물 위의 주식의 다른 누적 볼륨에 대 한 보상.
      3. 해결 된 모든 구성 요소가 포함 된 재고 솔루션 ("나머지 주식") 이 재고 솔루션을 포함 하는 다른 주식에서 구성 될 수 있습니다 구성 요소, 예를 들어, 서로 다른 온도에서 저장 또는 다른 방법으로 소독.
      4. Inoculum 마지막 구성 요소로 추가 하 고 셀의 정착 피하기 위해 또한 전에 그냥 테이블에 넣어 합니다.
    2. 재배 당 잘, 모든 미디어 구성 요소에 따라 전송 볼륨 계산:
      Equation 1
      추가할 특정 변형 주식 아마 0, ,이 특정 구성 요소를 생략 하는 경우 볼륨.
    3. 모든 계산된 볼륨 V 적당 한 숫자에 대 한 수정. 볼륨 단계에 pipetting 볼륨 증가 너무 작은 해서는 안됩니다. 필요한 경우 변형 주식의 농도 조정 합니다. 예를 들어, 여기에 최소한의 pipetting 볼륨 10 µ L로 정의 했다 그리고 최소한의 증가 5 µ L로 정의 했다. 일반적으로, 이러한 볼륨 실험적으로 결정된 정밀도 처리 역15,44사용된 액체에 따라 정의 되어야 한다.
    4. 나머지 재고 모든 우물에 대 한 고정 된 구성 요소를 포함 하는 것은 다음과 같이 볼륨을 계산:
      Equation 2
      어디 변형 주식의 최대 누적 볼륨 Equation 3 사용 됩니다. 따라서, 다음과 같이 고정된 된 나머지 부품의 필요한 농도 계산.
      Equation 4
      그에 따라 나머지 주식 을 준비 합니다.
    5. 재배 당, 다음과 같이 추가할 수 물의 볼륨 계산:
      Equation 5
    6. 잘 재배 당 추가의 다음 순서로 추가 될 모든 볼륨 나열: VH2O, VRestStock, Vi, VInok. 그림 2에서 예제와 같이 역을 처리 하는 액체의 사양에 따라 pipetting 목록 서식을 지정 합니다.
  • 씨 문화, 자동화 된 미디어 준비 및 주요 문화의 시작
    1. 액체 처리 로봇에 대 한 프로토콜을 만듭니다. 해당 "WinPREP" 소프트웨어에 구현 된 "야누스" 시스템에 대 한 예제 프로토콜에 대 한 그림 3그림 4 를 참조. 프로토콜은 다음과 같은 측면을 고려해 야:
      1. 미디어 준비 전에 살 균 주택의 충분 한 런타임을 포함 합니다.
      2. 초기 과도 한 청소 및 모든 pipetting 팁의 세척 및 튜브 포함.
      3. 재고 솔루션에 대 한 적절 한 기구 컨테이너를 선택 합니다. 모든 8 개의 pipetting 팁 잘 열에 병렬 배열에서 찍어 수로 여기, 12 열 깊은 잘 격판덮개 변화 주식, 저장을 위해 적당 하다. 이 크게 미디어 준비 속도. 15 mL 또는 50 mL 시 튜브 공기 통으로 사용 하는 경우 한 번에 하나만 pipetting 팁 그것에 찍어 수 있습니다.
  • 이러한 재고 솔루션 요구에 더 높은 볼륨 물과 나머지 사진같은 다른 주식에 대 한 100 mL 골짜기 사용 됩니다.
  • 각 재고 솔루션 폐기물 볼륨, 높이 pipetting 오프셋에 대 한 보상에 대 한 충분 한 총 볼륨 제공
  • 이 단계 씨 문화 절차 직전 실시는 보장 접종 단계 전에 사용자 프롬프트를 삽입 합니다.
  • 적절 한 컨테이너, 예를 들면, 살 균 15 mL 및 50 mL 시험관에서 사용까지 살 균 방식으로 저장소에 모든 재고 솔루션을 준비 합니다.
  • 70% 에탄올 및 후속 층 류 두건에 건조을 닦아 하 여 재고 솔루션 저장소 작업 테이블, 예를 들어에 대 한 깊은 잘 격판덮개를 소독.
  • 접종 50 mL BHI 매체 WCB에서 한 약 수와 25 mg/L 대를 포함 하 여 씨 문화를 시작 합니다. MBR 재배 전에 충분 한 양의 씨 문화를 기 하 급수적으로 성장에서 신선 하 고, 중요 한 inoculum을 준비 합니다.
  • 로봇 작업 테이블에 모든 필요한 기구를 배치 하 고 해당 기구에 재고 솔루션을 붓는 다.
  • 마지막 단계 (접종), 씨앗 문화의 시작 시간에 도달 되도록 미디어 준비를 위한 로봇 워크플로 시작 합니다. 총 로봇 워크플로 런타임 이전에 평가 될 필요가 있다. 여기, 총 런타임 1.5 h 약 했다.
  • 약 2 시간 후 각 시간 성장을 광학 밀도 (OD600)에 의해 모니터링 하 씨 문화를 샘플 합니다. 후 약 5 h 문화 3-4 세600 를 도달 하 고 주요 문화를 예방 하는 데 사용 됩니다.
  • 씨 문화를 액체 처리기 작업 대에 놓고 미디어 준비 프로토콜을 계속 합니다. 접종 후 재배 MTP 인감.
  • BioLector 장치에서 봉인된 재배 MTP를 놓고 미리 정의 된 재배 프로토콜을 시작 합니다.
  • Biosafety 규정 필요 하다 면, 나머지 재고 솔루션을 처분 하 고 로봇 작업 테이블에서 문화 씨앗. 재사용 가능한 기구를 청소 하 고 액체 처리기 오염 프로토콜을 시작 합니다.
  • 제품 정량화 그리고 분석에 대 한 원시 데이터의 전처리
    1. 17 h 런타임 후 주요 문화를 중지 합니다.
    2. 제조업체의 설명서에 따라 BioLection 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 연결 된 컴퓨터에 BioLector MBR 장치에서 측정 데이터를 전송.
    3. 사용에서 "데이터 관리 → 데이터 변환" 쉽게 액세스 스프레드시트 형식으로 원시 데이터 파일을 변환할 MBR 시스템을 함께 제공 하는 "BioLection" 소프트웨어 패키지의 기능. 17 헤 식별 기준 재배 우물과 평균에서 신호는 GFP에 가장 가까운 타임 스탬프 열에서 모든 재배 우물 GFP 신호 데이터를 복사 합니다. 평균 기준 신호에 의해 모든 나머지 GFP 신호를 정상화.
    4. (필요한 경우)에 추가 메서드를 사용 하 여 GFP titer를 계량
      1. Prelabeled 반응 튜브에 모든 재배 우물에서 셀 정지를 전송 하 고 최대 속도 벤치탑 원심 분리기를 사용 하 여 10 분 동안 원심 분리 후 셀 무료 상쾌한.
      2. 투명 한 바닥, 블랙 96 잘 MTP에 각 셀 무료 상쾌한의 200 µ L를 전송 하 고 488/520에서 GFP 특정 형광 읽기 nm 적절 한 microplate 리더를 사용 하 여. 모든 우물에서 GFP 신호 단계 1.5.3 에서처럼 참조 경작에서 평균 신호를 정상화.
        참고: 절대 GFP 형광 신호 다른 측정 장치에 대 한 비교 될 수 없습니다. 따라서, 모든 주요 경작에서 5 참조 종자 내부 표준으로 제공합니다. GFP titer의 개선 내부 표준에 관하여 표현할 수 있습니다. 이로써 다양 한 실험과 다른 GFP 정량화 방법 (다음 두 단계를 참조)에서 결과의 비교.
      3. 표준 프로토콜, 예를 들면, 브래드 퍼 드 또는 BCA 분석 결과 셀 무료 supernatants의 단백질 함량을 결정 합니다. 단계 2에서에서 결과 함께, 특정 단백질 GFP titer의 결정이 가능 하다.
        참고: 형광 측정 후이 미 판에서 직접 샘플을 사용 합니다. 멀티 채널 펫의 사용은 크게 필요한 액체 단계를 처리를 지원 합니다.
      4. SDS 페이지 시각화를 수행 셀 무료 supernatants의 증가 단백질 함량의 대부분을 확인 하는 표준 프로토콜입니다 증가 GFP 분 비 때문.
        참고: SDS 페이지는 특히 높은 샘플 부하와 함께 이전에 언급 한 방법 보다 더 힘 드는입니다. 확인을 위해, 그것은 종종 참조 중간 및 최종에서 셀 무료 supernatants의 SDS-페이지 최적화 중간 지켜온15실행 충분 합니다.
  • 2. 민감도 분석 (그림 1: 부품 B)

    참고:이 부분의 목표 목표에 중요 한 영향을 미칠 중요 한 요소를 식별 하는.

    1. 미디어 구성 요소의 초기 농도 범위를 선택 합니다. 참조 중간 구성 선택한 농도 범위 안에 속여야 한다.
    2. 적절 한 DOE를 선택 합니다. 이러한 디자인은 문학, 예를 들면, 통계적 방법 (www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm에서 사용 가능)의 NIST/SEMATECH 전자 수첩에서 찾을 수 있습니다. 선택한 디자인 관심의 미디어 구성 요소 수에 따라 달라 집니다 (여기, 11)와 수행된 실험 (여기, 32). 주어진된 예제에서 디자인 "2411-6" 32 실험 결과 관심의 목표에 11 구성 요소 중의 농도 증가의 효과의 추정 수 있도록 선택 되었다. 좀 더 구체적인 수, 주요 효과 쌍 단위 요소 상호 작용으로 하지 혼동 됩니다. 그러나 그들은 더 높은 순서 대로 상호와 혼동 될 수 있다는,, 가장 가능성이 안 중요 한.
    3. 나머지 우물을 사용 하 여 (여기, 16) 공정의 재현성을 평가 하기 위해 참조 매체와 여러 복제를 수행 하기 위한. 복제 위치 효과를 접시에 동등 하 게 걸쳐 한다. 참고 실험에서 측정 된 출력의 의미 값 정규화에 사용 됩니다. 즉, 각 측정된 출력 민감도 분석의 기준 출력의 평균 값으로 나누어져 있습니다.
    4. 주요 계산 가능한 경우 조합 효과 적절 한 통계 소프트웨어를 사용 하 고. 실험의 고전적인 디자인 다항식 근사45를 기반으로 합니다. 예를 들어, MATLAB 함수 mvregress 다항식 계수 추정에 대 한 사용할 수 있습니다.
    Mvregress 함수는 통계 및 기계 학습 도구 상자의 일부입니다.
  • T검정을 사용 하 여 목표에 다양 한 미디어 구성 요소 관련 효과 식별 합니다. 예제에서는 NH4+ 상당한 부정적인 효과 있으며 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 강한 긍정적인 효과 (그림 5)를 보여 줍니다. 그것의 중심 값에서 특정 구성의 집중 증가 계수 GFP 신호에 평균 상대 변화를 나타냅니다 GFP 신호 표준화 했다, Equation 7 , 최대 값.
  • 관련 효과 없이 고정된 구성 요소는 최적화 하는 동안 자신의 참조 값에 있습니다.
  • 3. 반복 최적화 (그림 1: 부분 C)

    참고: MATLAB 도구 KriKit 해석 및 통계 데이터 분석36위해 사용 되었다. KriKit 사용자를 데이터 구동 Kriging 모델을 만들 수 있습니다. 이 Kriging 모델 미디어 구성 요소와 목표 간의 기능 관계를 예측합니다. 또한 예측 불확실성에 대 한 정보를 제공합니다. 높은 불확실성 시끄러운 데이터 및/또는 부족 한 데이터 밀도 나타냅니다.

    1. 미상
      참고: 새로운 실험은 반복적으로 설계, 이전 실행의 결과에 따라.
      1. 첫 번째 반복에서 새로운 디자인 실험 확인 된 미디어의 상세한 조사에 대 한 관심의 구성 요소. 부품 관련 효과의 농도 지금 각 참조 값을 고정으로 반복 최적화 (제 3), 제 2에서 실험 결과 전송할 수 없습니다. 따라서, 민감도 분석 및 반복적인 최적화 실험 비교 되지 않습니다.
      2. 그렇지 않으면, 그림 1, 프레임 "반복 최적화"에서 설명 하는 스키마를 따릅니다. 최적의 잠재력 정의 된 농도 범위 안의 경우, 새로운 실험 설계 되었습니다 예상된 향상 률40,46을 사용 하 여. 예상된 향상 률에 따라 실험 설계 KriKit 도구에 통합 된다. 최적 경계에 속 인 다, 농도 범위를 확장 합니다.
    2. 섹션 2에 정의 된 실험 방법에 따라 디자인 된 샘플 포인트에서 실험을 수행 합니다.
    3. 통계 분석
      1. Kriging 모델 현재를 포함 하 여 모든 반복에서 결합 된 데이터를 사용 하 여 구성 합니다.
      2. 시각화 KriKit (2/3D 보간, 영화 분석, 상영 작, )의 포괄적인 도구를 사용 하 여 모델 출력을 조사 합니다.
    4. 최적의 지역 충분 한 정확도로 추정 되었다, 최적화 중지. 그렇지 않으면, 단계 3.1 계속.
      참고: 그림 6 에서는 시험 연구에 대 한 반복 최적화를 보여 줍니다. 농도 범위는 고원 (반복 1-6) 발견 될 때까지 연속적으로 확장 되었다. 7 반복 자세히 경계를 탐구에 대 한 사용 되었다.

    4. 결과의 확인 (그림 1: 파트 D)

    참고: 마친 후 반복 최적화, 초기 가정 유효성 검사를 해야 합니다.

    1. 최적의 매체 구성에 대 한 민감도 분석 (제 2)를 다시 실행 합니다. 즉, 그림 1 (C 파트)에 조사 하는 구성 요소의 농도 최적의 값으로 고정 됩니다. 다른 부품의 농도 적절 한 DOE에 따라 다양 합니다.
      참고: 두 검 진에서 유사한 결과 조사 구성 요소 농도 다른 부품의 영향을 변경 하지 나타냅니다. 심사 파트 B에서에서 결과에 큰 차이가 표시, 변경 효과가 구성 요소 조사 구성의 풀에 추가 해야 하 고 부품 C를 반복 해야 합니다.
    2. 간접 측정 (예를 들어, 제품 농도 대 한 지표로 형광), 경우에 직각 측정 방법 (예를 들어활동 분석 결과, 브래드 퍼 드 또는 BCA 단백질 정량화, SDS 페이지) 변경을 확인 하 적용 참조 매체 및 최적화 된 중간15결과를 비교 하 여 관심의 목적.

    Representative Results

    은닉 GFP의 titer를 극대화 하기 위한 도입된 프로토콜 적용 되었습니다. 특히,는 GFP titer 후 재배의 17 h 최적화 목적으로 선정 되었다. GFP의 온라인 형광 탐지 간단한 제품 정량화를 허용. 그러나, GFP 신호 참조 재배에서 데이터의 정규화 재현성 및 결과의 comparability 불가결 하지 않습니다. 미디어 구성 요소의 사전 선택 섹션 1에서 설명한 대로 합리적으로 수행 되었다. 실험 제 1의 지침에 따라 수행 했다: 젖은 실험실 절차의 매개 변수가 일관성과 결과의 재현성을 보장 하는 모든 연구에 대 한 정의 했다.

    제 2에 설명 된 대로 추가, 더 자세한 연구를 위한 최적화 목표에 중요 한 영향을 보여주는 관련 구성 요소를 식별 하는 데 초기 심사 수행 되었다. MTP 기반 MBR 시스템 48 실험을을 동시에 수행할 수 있습니다. 11-6 소수 적절 한 선택을 디자인 한 MTP (48)에 병렬 실험의 최대 가능한 번호 및 미디어 구성 요소 (11)은 24의 총 수 있습니다. 이 실험 설계 32 실험 구성 하 각 조사 미디어 구성 요소에 대 한 주요 효과의 추정 하며 나머지 재배 웰 스 (16) 여러 복제 참조 매체와 실험의 재현성 및 위치 효과 평가 하기 위해 사용 되었다. 즉, 각 실험 한 번 실시 (복제), 참조 실험 (5 복제)를 제외 하 고.

    표 1 의 심사 분석 결과 요약합니다. 고려 농도 범위에서 대부분의 미디어 컴포넌트를 다양 한 목적에 눈에 띄는 효과 표시 하지 않았습니다. 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 강한 긍정적인 추세를 표시 하는 동안 구성 요소 NH4+ 강한 부정적인 효과 보여줍니다. Mg2 + 의 효과 현재 농도 범위에 대 한 중요 하지 않습니다 하지만 더 넓은 농도 범위에 대 한 수 있습니다. 따라서, NH4+ 매체에서 생략 하 고 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 추가 실험의 효과 조사 하기 위하여 결정 되었다.

    제 3 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +의 농도 변화 하는 동안 GFP 형광 신호를 극대화 하는 데 사용 되는 반복 최적화 절차를 설명 합니다. 반복 1, NH4+ 생략 될 수 있다 가설 테스트를 했다. 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 의 농도 범위는 심사 분석에서 채택 되었다. NH4+ 의 최소 농도 0으로 설정 하 고 최대 농도 검사 실험에서 채택 되었다. 다음 실험에서 구성 요소 농도 27 실험의 결과로 정의 된 농도 범위 내 3 그리드 x 3 x 3는 배 부 되었다. 모든 경작 하는 동안 참조 매체의 5 복제 포함 했다 아무 위치 효과 MTP 통해 발생 하 고 내부 표준으로 봉사. 나머지 16 우물의 NH4+, 캘리포니아2 +, Mg2 + 농도 무작위로 주어진된 범위 안에 배포 했다.

    그림 5 A 첫 번째 반복의 결과 시각화. 축 레이블을 원래 참조 매체에 사용 되는 구성 요소 농도를 참조 Ref x로 표시 된. 푸른 표면 KriKit 소프트웨어를 사용 하 여 계산 된 Kriging 보간을 나타냅니다. 각 표면 NH4+ 에 대 한 상대적인 농도와 연결 됩니다 (진한 파란색: 0 Ref, 체크 무늬 x: 1 Ref, 밝은 파란색 x: 2 Ref x). 이 시각적 유리한 NH4+를 생략 하는 것을 보여준다. 보간 표면 농도 증가 함께 모든 비행기 상승으로 또한 마그네슘2 + 그리고 캘리포니아2 +의 긍정적인 효과 보여줍니다.

    반복 1의 결과 바탕으로, 그것은 결정 되었다 두 배로 최대 농도 농도 범위의 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 를 확장 하 고 실험 설계 창 우측 상단에 이동의 그림 5 참조 B.이 범위 내의 농도 6 × 6 격자에 배 부 되었다. 이 전체 농도 범위, 최적의 Kriging 보간 결과 동등한 배급을 보장 합니다. 그림 5 B 쇼 Kriging 보간 음모 결합 된 데이터에 따라 두 반복 (붉은 점 들과 노란색 사각형) 측정. 모두, 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +, 그들의 농도 증가의 긍정적인 효과 계속 됩니다. 따라서, 절차는 최대 농도 두 배로 반복 했다 하 고 따라서, 실험적인 디자인 창 오른쪽 상단 모서리의 경계를 탐구에 이동 되었다.

    그림 6 A 나머지 최적화 절차의 개요를 제공. 반복 3까지 수집 된 데이터 세트의 분석 Mg2 +, , 한 최적 농도 범위의 Mg2 + 의 긍정적인 효과의 한계 발견 했다 밝혔다. 따라서에 캘리포니아2 + (반복 4) 농도 범위 확대 결정 되었다. 이 절차를 두 번 반복 (반복 5, 6) GFP 신호의 채도 찾을 때까지. 이 채도 셀에 사용할 수 없습니다의 캘리포니아2 +, 적용된 농도 대 한 Ca-소금의 강 수에 의해 설명 된다.

    실험 결과 항상 소음에 의해 교란 된다, 결과 Kriging 보간 나타납니다 불규칙 한 고 검사 틀린 결론으로 이어질 수도 있습니다. 그러나, 최적 농도 범위의 포화 GFP 신호에 대 한 미디어 구성 요소 통계 z-검정, 또한 KriKit에서 구현 되는 안정적으로 식별할 수 있습니다. Z-검정 Kriging 메서드, , 예측 값 및 제공 예측 불확실성 본질적인 통계 정보 직접 사용 합니다. 그림 6 B 확인 된 고원, KriKit 도구 상자를 사용 하 여 결정 하 고 시각화 된 보여줍니다.KriKit 도구 상자 자유롭게 사용할 수36 와 그것의 기능을 사용 하는 방법을 설명 하는 자세한 자습서와 함께 제공 됩니다.

    두 개 이상의 관련 구성 요소가 발견 되 면, 3D 시각화의 한계에 도달 합니다. KriKit 영화 또는 "상영 작" 등 다른 여러 가지 가능한 시각적 방법을 제공합니다. 최적의 잠재력 정의 된 농도 범위 안의 경우, 새로운 실험 예상된 향상 률40,46을 사용 하 여 자동으로 설계 됩니다. 예상된 향상 률에 따라 실험 설계 KriKit 도구에 통합 된다. 더 자세한 정보는 소프트웨어 설명서에서 찾을 수 있습니다.

    반복 절차 후 결과 확인 실시, 부분 d.에 설명 된 대로 초기가 정의 타당성 최적의 매체 구성을 사용 하 여 추가 민감도 분석을 수행 하 여 확인 했다. 즉, 관심의 모든 초기 미디어 구성 요소 변화 했다, 그러나 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 그들의 최적 농도 수준으로 설정 했다. 이 연구에서 최적의 농도 Equation 8 = 32 Ref x와 Equation 9 = 6.8 x Ref 선정 됐다. 표 2 는 유효성 검사의 결과 보여 줍니다. NH (cf. 표 1), 심사 초기 감도 비슷한4+ 아직도 상당한 부정적인 영향 있으며 나머지 효과 여전히 무시할 수 있습니다.

    때문에 쉬운 접근, 재배 정지에서 GFP 형광 신호 모든 실험 동안 extracellular GFP titer를 계량 하 사용 되었다. 확인을 위해 GFP 형광은 다른 측정에 대 한 유효성이 검사 됩니다. GFP는 문신-통로 통해 분 비, 때문에 형광 신호 사이 내-extracellular GFP 차별 수 없습니다. 따라서, 경작 기준 매체와 최적화 된 매체를 사용 하 여 재현 했다. 셀 무료 재배 supernatants에서 형광 측정 외 단백질 콘텐츠 Bradford 분석 실험과 (반) 정량은-SDS 페이지15시각 질적 GFP 개선. 모든 결과 측정 신호 했다 약 두 배가 경작에 대 한 검증 기준 매체에 비해 최적화 된 매체는 분 비 성능 최적화 된 매체의 약 100% 향상. 따라서, 재배 서 스 펜 션의 GFP 특정 형광 여겨질 수 있다 최적화 목적, , extracellular GFP titer에 대 한 적합 한 통계.

    Figure 2
    그림 2 : 민감도 분석에 대 한 볼륨 pipetting 목록에서 스크린샷. 첫 번째 열에 있는 항목 행;의 모든 볼륨에 고유한 식별자 할당 이 식별자는 MTP 잘 그림 4C cf. 액체 처리기 작업 테이블에 대상 재배 MTP의 번호입니다. 나머지 열 pipetted 수를 다른 솔루션 ("Sln-01" "Sln-15")에 대 한 볼륨을 인코딩합니다. 한 행의 누적 볼륨 잘 해당 최종 재배 볼륨에 해당 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 3
    그림 3 : 제어 소프트웨어 "WinPREP"를 처리 하는 액체에서 스크린샷. 왼쪽: 행 정렬 명령을, pipetted 수를 재고 각 솔루션에 대 한 전송 명령을 포함 합니다. Inoculum 추가 대 한 마지막 명령 하기 전에 사용자 프롬프트 씨 문화 시간에 테이블에 배치 됩니다 보장 하기 위해 삽입 됩니다. 나머지 재고, 물 및 미디어 준비 대상 재배 MTP inoculum, 변형 주식 (12 열 같은 웰 스와 2 개의 깊은 잘 격판덮개), 시 약 물에 대 한 소스 기구를 포함 하 여 작업 테이블의 오른쪽: 회로도 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 4
    그림 4 : 재고 솔루션의 pipetting의 설치에 대 한 상세한 스크린샷 편집. (A) 철 재고 pipetting 명령을 풀어. 소스 기구 및 소스 잘 내는 작업 테이블에 의해 표시 읽기 프레임 및 해당 깊은 잘 격판덮개의 붉은 열. 대상 기구와 내 대상 우물 주위 블루 프레임 대상 재배 MTP의 블루 웰 스에 의해 표시 됩니다. 이 단계 (철 재고 솔루션) pipetting 볼륨의 할당에 (B) 상세한 예제 보기. 취항지 수는 48 행 pipetting 목록에서 읽습니다. Fe 재고 솔루션에 대 한 모든 대상 웰 스에 대 한 디스 펜스 볼륨 열 4 pipetting 목록에서에서 발견 된다. Note pipetting 목록에서 첫 번째 열 식별자 및 전송, 그림 2참조 하지 볼륨 포함. (C) 세부 사항 잘 번호 대상에. 해당 pipetting 목록의 행 # 1에에서 작성 된 볼륨 잘 # 1으로 표시로 pipetted 될 것입니다. 웰 스 #01, #08, # 41와 #48 또한 재배 MTP 자체에 인쇄 된 웰 스 A01, A08, F01 및 F08 알파-숫자 코딩에 대 한에 해당 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 5
    그림 5 : 첫 번째 반복에서 결과 상세한. (A) 반복 1의 실험 데이터를 기반으로 하는 Kriging 보간. 빨간 점 데이터 집합을 나타냅니다. 비교를 위해, 모든 3 보간 서피스는 하나의 음모에 오버레이 (진한 파란색: 0 Ref, 체크 무늬 x: 1 Ref, 밝은 파란색 x: 2 Ref x). 결과 대 한 대체 표현은 다른15를찾을 수 있습니다. (B) 실험에 따라 Kriging 보간 반복 1 (빨간 점) 및 반복 2 (노란색 사각형)에 수행.이 그림에 표시 하는 데이터의 부분15이전에 게시 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 6
    그림 6 : 반복적으로 수집된 최적화 결과의 묘사. (A) 최종 Kriging 예측 모델. Z통계 기반으로 하는 최적의 지역 (빨간색)의 (B) 통계 확인-테스트는 KriKit에 의해 제공 됩니다. 상자는 반복적인 디자인의 연속 단계와 실험의 실행을 나타냅니다. 이 그림에 표시 하는 데이터의 부분15이전에 게시 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    구성 요소 정규화 계수 값을 의미
    Fe2 + -0.08
    미네소타2 + -0.05
    Zn2 + -0.21
    Cu2 + -0.21
    NH4+ -2.04
    Ni2 + -0.11
    Co2 + -0.10
    42- 0.03
    33- 0.06
    캘리포니아2 + 1.00
    Mg2 + 0.45

    표 1: 민감도 분석의 결과. 계수 값의 최대 값을 그것의 중심 값에서 해당 미디어 구성 요소 농도 증가 하는 때 평균 효과 나타내는. 최적의 실험 설계로 표준 문학에 발견 하 고 여기에 사용, 표준 편차 대표 직접 참조 실험의 복제로 인해 실험 변형. 계수 값은 maxium 값 (구성 Ca2 +0.0422)으로 정규화 됩니다. 정규화 된 절대 계수 표준 편차 각각 0.54와 0.0226, 이다.

    구성 요소 정규화 계수 값을 의미
    Fe2 + -1.00
    미네소타2 + 1.00
    Zn2 + -3.48
    Cu2 + -0.52
    NH4+ -15.95
    Ni2 + 0.69
    Co2 + -0.51
    42- -0.45
    33- -1.11

    표 2: 최종 민감도 분석의 결과. 계수 값의 최대 값을 그것의 중심 값에서 해당 미디어 구성 요소 농도 증가 하는 때 평균 효과 나타내는. 최적의 실험 설계를 사용로 표준 편차만 최적화 된 중간 구성을 사용 하 여 실험 변형에 따라 다릅니다. 실험적인 변형 참조 매체를 사용 하 여 변형에 비해 약간 증가 했다. 계수 값은 maxium 값 (구성 요소 미네소타2 +0.0106)으로 정규화 되었다. 정규화 된 절대 계수 표준 편차 각각 3.63와 0.0385, 이다.

    Discussion

    제시 프로토콜의 일반적인 자연 수 예를 들어, 다른 미생물 식 호스트9,47,,4849,50, 공부에 대 한 다양 한 적응, 51, 또는 glycosylation 패턴 또는 이황화 채권 같은 대상 단백질의 다른 속성을 최적화. 프로토콜 사용 가능한 실험실 장비에 적응도 해야 합니다. MBR 시스템의 통합 시간에 큰 비용 절감을 가능 하 게 실험 처리량을 늘릴 수 있습니다. 그러나, 완벽 하 게 계측 및 제어 bioreactors MBR 시스템 교체, 결과의 확장성8,37,,5253고려 한다. 미상 방법론 및 수학적 모델링을 사용 하 여 효율적인 실험 계획 및 모델 기반 데이터 해석15공부 객관적인54 에 따라 측정 데이터의 정보 내용을 극대화에 도움이 됩니다.

    방법에 대 한 수정
    다목적 및 확장 로봇 액체 처리 시스템이이 연구에 사용 된 것과 같은, 옆 언급 해야이 작업을 수행할 수 있고 안에 배치 될 수 있습니다 상용 시스템을 처리 하는 여러 작은 액체는 층 류 흐름 작업의 자의 자동된 pipetting 시스템을 사용할 수 있는 다른 미디어 작곡 미상 계획에 따라 단일 또는 다중 채널 펫을 사용 하 여 수동 pipetting으로 실현 또한 수 있다. 수동 준비는 더 오류가 있기 때문에 꽤 오랜 시간에 대 한 높은 집중된 작업을 요구할 것 이다, 다른 미디어 작곡의 낮은 수를 준비 하는 것이 좋습니다.

    고용된 MBR 시스템의 기능에 따라 해당 재배 프로토콜은 달라 집니다. 예를 들어, 바이오 매스 형성의 아무 온라인 측정을 사용할 수 있는 경우 성장 실험의 완료 후 바이오 매스 농도 측정 하는 충분 한 수 있습니다. 온라인 모니터링 함께에서 여러 MBR 시스템에서 구현 되는 용 존된 산소와 pH의 성장 채도 안전 하 게 결정 될 수 있다. 원칙적으로, 성장 실험 MTPs 혼자 incubators, MBR 시스템의 사용 없이 동요 내부 배치에서 수행할 수 있습니다. 이 경우에, 적절 한 재배 조건을 보장 해야: (1) 산소 제한 지켜온 적절 한 주파수를 흔들어 및 직경, 예를 들어, 광장 96 또는 24 깊은 동요와 함께 적당 한 형상의 MTPs를 사용 하 여 피할 수 있습니다 잘 판 3mm 던져 또는 25 mm 던져에서 250 rpm에서 1000 rpm에서 각각 운영 한다. 중요 한 것은, 낮은 달성 최대한 산소 전송 속도, 낮은 주요 탄소 소스 해야 집중. 이 연구를 위해, 위에서 언급 한 대로 10 g/L 포도 당 사용이 했다 고용된 재배 조건;에 대 한 제한 산소를 방지 하기 위해 적당 한 (2) 바이오 매스 및 제품 정량화에 대 한 MTP 문화의 샘플링 최소한으로 감소 되어야 한다. MTP 떨고 인큐베이터에서 제거 됩니다 때마다 산소 전송 됩니다 즉시 고장 형편이 나쁜 경작 조건;에서 발생할 수 있습니다. (3) 저자의 의견에에서 MTP 독자 재배 장치를 사용 하 여가이 목적을 위해이 소자 들은 개발 되지 않은으로 바람직하지 않습니다. 예를 들어 떨고 역학 만들어진 시 약 추가 후 microplates의 가끔 혼합 하 고 따라서, 일에 대 한 지속적인 떨고 지속의 긴 실행에 대 한 견고성 부족. 또한, 미생물 경작에 필요한 충분 한 전원 입력이이 독자에서 실현 될 수 없습니다. 광학 밀도 판독의 통합 짧은 시간 간격 반복된 기간 산소 제한의 결과로 떨고 운동의 중지를 해야 합니다. 또한, 긴 재배 기간 동안 이러한 시스템에서 증발 결과 왜곡할 것 이다. 에 대 한 자세한 내용은 MTPs 미생물 경작에 대 한 사용 하 여 놀라울 정도로 복잡 한 주제, 독자는 인용된 문학22,23,,2425,26 참조 거기에 참조.

    추가 고려 사항
    죽인다 반복 최적화 단계를 신중 하 게 제품 정량화에 대 한 분석 방법을 선택 하는 것이 좋습니다. 빠르고 간단한 방법 실험 부정확성을 허용 하는 반복 실험 설계 전략으로 정밀도 정확도, 비용 선호 해야 합니다. 그러나, 더 복잡 있을 수 있습니다 충분 하 게 정확 하 고 정확한 제품 정량화 방법에 대 한 최종 결과 확인 해야 합니다. 일반적으로, 주의 깊은 평가 및 연구 절차에 대 한 의사 결정 연구의 시작 부분에서 노력을 필요로 하지만 일상적인 방법 설정 된 후 긴 안목으로 보면, 치를.

    최적화 하는 동안 모든 실험 비교 참조 실험을 정의 높은 것이 좋습니다. 즉, 측정 된 출력 뿐 아니라 적용된 중간 구성 요소 농도 기준 값으로 나누는 통해 정규화 됩니다. 이러한 방법으로, 각각 적용 되 고 측정 된 값 참조 값의 x 배로 해석 될 수 있다. 격판덮개 사이 계정 변화를 하기 5 참조 실험 각 접시에 수행 됩니다. 측정된 결과의 의미 값 정규화에 대 한 사용 됩니다.

    그것은 수 있다 일반적으로 하지 보장 개발된 매체는 또한 다른 변종에 대 한 최적의. 그러나, 향상 된 매체 대부분 수도 mutagenesis 연구 (에서 얻은 하나의 아미노산 대체와 효소 이체를 생산 하는 때 작은 유전 다름, 예를 들어, 식 종자 재배에 적합 비록도 단일 지점 돌연변이 설명 효과 세포질 물질 대사 및 분리 식 성능55,56). 이 경우에, 제시 프로토콜 프로토콜 높은 처리 식 검 진57다음 첫 번째 단계를 수 있습니다. 복제는 눈금에서 캠페인 심사 확인 다른 가기 최적화 된 매체 해당 bioprocess 조건에 대 한 확인 한다 중간 개발 이후 규모-최대 먹이 배치 경작을 위한 프로토콜을 사용 하는 경우 다른 먹이 전략 및 재배 미디어52,58공연. 또한, 도입된 KriKit36 일반적으로 향상 된 전체적인 bioprocess 최적화에 기여할 수 있다.최근, 도구 능력 또한 모두 업스트림 및 다운스트림 프로세스59,60를 최적화에 대 한 중요 한 될 수 있는 다 객관적인 최적화40를 지원 하도록 확장 했다.

    Disclosures

    저자는 공개 없다.

    Acknowledgments

    Bioeconomy 과학 센터의 과학 활동 NRW Strategieprojekt BioSC (313/323-400-002 13)의 프레임 워크 내에서 사역의 혁신, 과학, 그리고 연구에 의해 재정적으로 지원 했다. 저자는 혁신의 내각, 과학, 및 연구의 노르트라인-베스트팔렌, 하인리히 하이 네 대학 뒤셀도르프 라스 주 클러스터 산업 생명 공학 CLIB 대학원 내에 장학금에 대 한 감사합니다. 추가 자금 활성화 공간 프로그램 "미생물 Bioprocess 연구소-A 헬름홀츠 혁신 연구소"를 지원 하기 위해 독일 헬름홀츠 협회의 "헬름홀츠 혁신 연구소"에서 받았습니다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BioLector m2p-labs G-BL-100
    Flowerplate m2p-labs MTP-48-BOH For cultivation in the BioLector device
    Sealing foil m2p-labs F-GP-10 Sterile sealing for Flowerplate
    MATLAB Mathworks 2016b
    KriKit Forschungszentrum Jülich n/a Freely available, MATLAB installation required
    Janus pipetting robot Perkin Elmer n/a Includes "WinPrep" software installation
    12-column deep well microplate E&K Scientific EK-2034 Container for medium stock solutions
    96 well microplates, transparent, F-bottom Greiner 655101 For Bradford protein assay
    µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom Greiner 655087 For flourescence measurement in cell-free supernatants
    Pipette Research plus multi-channel pipettes Eppendorf n/a Facilitates manual liquid handling with microplates
    TruPAG Precast Gels Sigma PCG2002 For SDS-Page analysis of cell-free supernantants
    Bradford Reagent Sigma B6916
    C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP n/a n/a Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (130), e56234, doi:10.3791/56234 (2017).More

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