Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generisk protokoll for optimalisering av Heterologous Protein produksjonen ved hjelp av automatisert Microbioreactor teknologi

Published: December 15, 2017 doi: 10.3791/56234
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2,4
1IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Jülich, 2Research Center Jülich, Bioeconomy Science Center (BioSC), 3Computational Systems Biotechnology (AVT.CSB), RWTH Aachen University, 4Institute for Biotechnology, RWTH Aachen University
* These authors contributed equally

Summary

Dette manuskriptet beskriver en generisk tilnærming for skreddersydd design av mikrobielle dyrking media. Dette er aktivert av en iterativ arbeidsflyt kombinerer Kriging-baserte eksperimentell design og microbioreactor teknologi for tilstrekkelig dyrking gjennomstrømning, som støttes av lab robotikk å øke pålitelighet og hastighet i væske håndtering media forberedelse.

Abstract

En kjernevirksomhet i industrielle bioteknologi bruker mikrobiell produksjon celle fabrikker er gjentakelsene av prosessen av belastning engineering og optimalisering av bioprocess. Et viktig aspekt er forbedring av dyrking medium for å gi et optimalt miljø for mikrobiell dannelsen av produktet av interesse. Det er godt akseptert at media sammensetningen kan dramatisk påvirke ytelsen til bioprocess. Ernæring middels optimalisering er kjent for å forbedre rekombinante proteiner med mikrobiell systemer og dermed, dette er en givende trinn i bioprocess utvikling. Imidlertid er ofte målestokk media oppskrifter Hentet fra litteratur, siden skreddersydd design av dyrking medium er en langtekkelig oppgave som krever microbioreactor-teknologi for tilstrekkelig dyrking gjennomstrømning, rask produktet analytics, samt støtte håndtering trinnene av lab robotikk aktivere pålitelighet i væske. Videre er avanserte matematiske metoder nødvendig for rasjonelt analyse av måledata og effektivt designe parallelle eksperimenter som for å oppnå optimal informasjon innhold.

Den generiske typen presentert protokollen tillater enkel tilpasning til ulike laboratorieutstyr, andre uttrykk verter og målet proteiner av interesse, samt ytterligere bioprocess parametere. Videre kan andre optimalisering mål som protein produksjon rate, bestemt avkastning eller produktkvalitet være valgt for å passe omfanget av andre optimalisering studier. Anvendt Kriging verktøykassen (KriKit) er et generelt verktøy for Design av eksperimenter (DOE) som bidrar til bedre helhetlig bioprocess optimalisering. Den støtter også flere objektive optimalisering som kan være viktig å optimalisere både oppstrøms og nedstrøms prosesser.

Introduction

Moderne rekombinant genteknologi kan den vide bruken av tekniske enzymer for ulike applikasjoner i farmasøytisk industri, dyrefôr, organisk kjemi, og matfag1,2,3. Produksjon av tekniske enzymer i bulkmengder er et viktig tema for industriell bioteknologi og optimalisert rekombinante proteiner produksjon, og begge belastning og bioprocess engineering er nødvendig. Generasjonen av effektivt utviklet produksjon stammer, forskjellige genetisk biblioteker er tilgjengelig, f.eksbalansert gene expression4 eller økt sekresjon effektivitet5.

Corynebacterium glutamicum er en stor produsent av aminosyrer i industriell skala6,7 og representerer en attraktiv ikke-konvensjonelle uttrykket vert for sekretoriske produksjon av rekombinante proteiner8 ,9. Både generelle sekretoriske (Sec) og twin-arginine translokasjon (Tat) veien finnes i C. glutamicum og ble tatt i bruk for rekombinant protein sekresjon10. Erfaring i bioprocess engineering om aminosyre produksjon på industriell skala, samt muligheten til å skille ut proteiner til finans beløp11 og stor robusthet om bioprocess inhomogeneities funnet i stor skala i nærområdet12,13, gjør C. glutamicum en lovende plattform organisme for sekretoriske produksjon av heterologous proteiner i industriell skala.

Ernæring middels optimalisering er kjent for å forbedre rekombinante proteiner produksjon med mikrobiell systemer14,15,16,17 og følgelig justering av medium komposisjon er en givende skritt i bioprocess utvikling med hensyn til optimal produktivitet18,19,20,21. Intens forskning på anvendelse av microtiter plater (MTPs) for mikrobiell dyrking22,23,24 banet vei for utvikling og design av MTPs for mikrobiell dyrking25 ,26 og utvikling av MTP-basert microbioreactor (MBR) systemer med avlytting og miljømessige kontrollere27,28. MBRs aktiverer en betydelig økning i eksperimentell dyrking gjennomstrømming. Dessuten er MBR systemer stammer fra andre typer bioreaktorer, f.eks, boble kolonner eller rørt tank reaktorer, tilgjengelig for mikrobiell bioprocess optimalisering29,30,31, 32.

Generelt, nytte optimalisering studier økt eksperimentelle gjennomstrømning, som blir enda kraftigere i kombinasjon med DOE metoder, som vurdere interaksjoner mellom design variabler eller redusere høy-dimensjonale søk på spaces. Følgelig kombinert bruk av MBR systemer, lab automatisering og DOE har vist seg for å være en kraftig metode i bioteknologi,8,,16,,33,,34,,35.

En protokoll for medier optimalisering presenteres kombinere state-of-the-art lab automatisering, MBR teknologi med elektronisk prosess overvåking og Kriging-basert data analyse/eksperimentell design. Kriging-metode er implementert i en MATLAB verktøykasse ("KriKit") som kan lastes ned og brukes uten kostnad36. Som eksempel vises maksimering av sekretoriske grønne fluorescent protein (GFP) med C. glutamicum ved å optimalisere sammensetningen av CgXII minimal medium. GFP titer ble valgt som optimalisering målet som det kan kvantifiseres lett og det er mye brukt som modell protein for studier på MBR systemer37,38,39.

Presentert rammene er delt i fire trinn, som er illustrert i figur 1. Trinnene er merket av for rammer og svarer til deler av protokollen. Det første trinnet (figur 1A) er å definere prosjektmålene og å finne de nødvendige metodene. Kombinasjonen av DOE metoder, MBR teknologi og lab automatisering lar en økt eksperimentelle overføringshastighet som krever kraftig databehandling. Det andre trinnet (figur 1B) mål å oppdage følsom design variabler (dvs., mellomstore komponenter) med høy innflytelse på optimalisering målet. Dette fører til et redusert antall design variabler av interesse. Det tredje trinnet (figur 1 c) består av en iterativ optimalisering for en mer detaljert undersøkelse av funksjonelle forholdet mellom gjenstående design variablene og målet med interesse. Bruker suksessivt utvidet datasettet, brukes Kriging tilnærming til å forutsi eksperimentelle utfallet unmeasured steder. Iterativ syklusen stopper så snart Kriging modellen spår en optimal eller platå med tilstrekkelig nøyaktighet. Resultatene er bekreftet i fjerde trinn (figur 1 d), begynner med en ytterligere sensitivitetsanalyse rundt identifiserte optimal. Hvis først ufølsom komponenter er funnet for å være ufølsom også i regionen optimal, er det rimelig å anta at dette gjelder under iterativ optimalisering prosedyren i det tredje trinnet. Etterpå er det anbefales å bekrefte optimalisering resultater ved ortogonale metoder, for eksempel en aktivitet analysen eller SDS-side.

Den generiske typen presentert protokollen tillater enkel tilpasning til ulike laboratorieutstyr, andre uttrykk verter og målet proteiner av valg, i tillegg til ytterligere bioprocess variabler som pH verdien eller dyrking temperatur.Videre kan andre optimalisering mål som protein produksjon rate, bestemt avkastning eller produktkvalitet være valgt for å passe omfanget av andre optimalisering studier.

Figure 1
Figur 1 : Arbeidsflyt optimalisering studium. Fire ramme boksene svarer til deler av protokollen, "Bli gravid the studie og definisjon av metoder" (del 1), "Sensitivitetsanalyse" (del 2), "Iterativ optimalisering" (del 3) og "Validering" (del 4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

1. bli gravid studier og definisjon av metoder (figur 1: del A)

Merk: Definisjon av optimalisering målet: er en gang løpet av produktet dannelse behov eller er bare en begrenset tidsintervallet eller enda et fast punkt relevant? Også vurdere potensielle problemer som stabilitet, innsats av analytiske kvantifisering eller dyrking tid. Som et alternativ til siste protein titer, kan andre mål betraktes som biomasse eller dyrking. Biomasse er reflektert av biomasse bestemt produkt avkastning, mens dyrking tid gjenspeiles av rom-tid-yield. (Minimum) kvalitet kan også være et mål. Flere objektive optimalisering kan være nødvendig i visse situasjoner, som diskutert annetsteds40. I denne studien GFP titer etter 17 h dyrking ble valgt som optimalisering mål. GFP fluorescens kan følges online ved hjelp av utstyr tilgjengelig i denne studien, som forenkler å bestemme konsentrasjonen av modellen protein.
Merk: Definisjon av parametere til å være optimalisert: CgXII medium består av 16 enkeltkomponenter41 og undersøke alle disse i full faktoriell design vil resultere i 216 ≈ 65000 eksperimenter. Derfor må søke plass reduseres på rasjonelle og -drevet. Valg av media-komponenter som er vurdert for optimalisering kan støttes av tilgjengelige fagkunnskap eller litteratur data.

  1. Bestemme hvilke middels komponent konsentrasjoner bør ikke varieres. For optimalisering av CgXII medium, ble følgende komponenter valgt til å være faste:
    1. Glukose fast på 10 g/L. Optimeringen er trivielt fordi mer glukose gir mer GFP sekresjon biomasse. Målet var å vise ikke-intuitive middels effekter.
    2. 3-(N-morpholino) propanesulfonic syre (MOPPER) fast på 42 finans. Dette gir bufring kapasitet under satsvis dyrking og metaboliseres ikke.
      Merk: Tillegg av MOPPER på denne siste konsentrasjonen sikrer en startverdi på pH 7, selv med de forskjellige volumene av andre lager løsninger lagt, som ikke er ved pH 7. Men hvis du vil utelate eventuelle avvik i å starte pH-verdier, bør pH sjekkes for middels komposisjoner der alle lager løsninger legges på maksimum og minimum volumene.
    3. KH2PO4 og K2HPO4 er fast på 1 g/L hver. Dette gir også bufring kapasitet, og tjene som en fosfat.
    4. Urea er fast på 5 g/L. Dette fungerer som en basal nitrogen kilde og pH-stabilisere agent, tilstrekkelig til å hindre N-begrensning.
    5. Biotin er fast på 0,2 mg/L. C. glutamicum ATCC13032 er auxotrophic for biotin.
    6. Protocatechuic syre (PCA) fast på 30 mg/L. Det fungerer som et strykejern chelaterande agent.
    7. Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) er fast på 100 µM. Det induserer uttrykk for gfp genet.
  2. Velg høye og lave konsentrasjoner av media komponentene for første følsomhet screenings. Her ble komponenter fra tre typiske mediekomponenter valgt. Undersøkte lave og høye konsentrasjonen for hver komponent er:
    1. Standard nitrogen kilde: (NH4)2SO4 (8-32 g/L); variasjonen av nitrogen kilde ble rapportert å være lovende for optimalisering av biomasse-spesifikke GFP signal8.
    2. Sporstoffer: FeSO4 ∙ 7T2O (4-16 mg/L), MnSO4 ∙ H2O (4-16 mg/L), ZnSO4 ∙ 7T2O (0,4-1.6 mg/L), CuSO4 ∙ 5t2O (125-501 µg/L), NiCl2 ∙ 6 H2O ( 8-32 µg/L) og CoCl2 ∙ 6t2O (52-208 µg/L). Sammensetningen av sporstoffer er arvet fra den første utgivelsen av CgXII medium41. I tillegg Na2MoO4 ∙ H2O (26-104 µg/L) og H3BO3 (20-80 µg/L) var inkludert som sporstoffer, som de er brukt i en publisert variant av CgXII medium42.
    3. Makro elementer: MgSO4 ∙ 7T2O (0,2-0,4 g/L), CaCl2 ∙ 2t2O (5.3-21,2 mg/L). Disse ble funnet blant andre divalent kasjoner å forbedre sekretoriske GFP produksjon i en annen studie14, der C. glutamicum belastning R ble brukt med en annen middels bakgrunn og CgR0949 Tat signal peptid.
  3. Utarbeidelse av materialer og definisjon prosedyrer
    Merk: Det anbefales å definere og fikse de eksperimentelle metodene på et detaljert nivå. Denne standardiseringen sikrer at forskjellige resultater kan spores tilbake til innebygd biologisk variasjon eller annet medium komposisjoner.
    Merk: Media lager løsninger: forberede individuelle lager løsninger for alle undersøkt mediekomponenter. Forberede Høykonsentrert aksjer å tillate fortynning av ulike volumer for alle komponenter. Dette betyr at etter kombinere alle lager løsninger på deres høyeste volum i henhold til design planen, dette ikke kan overskride siste dyrking volumet, jf avsnitt "Generasjon av middels lagerløsning pipettering" trinn 1.3.3. Hvis tillegg av en svært konsentrert løsning i et lite tillegg volum, f.eks < 1/100th av siste dyrking volumet, fortynne lagerløsning tilsvarende. For eksempel i denne studien ble et pipettering volum på mindre enn 10 µL definert for å være umulig. Vanligvis spor element løsninger er konsentrert så høyt som 1,000fold med hensyn til siste standard konsentrasjon i medium. Det er fordelaktig å konsentrere media komponentene som multiplum (X-fold) med hensyn til konsentrasjoner i referanse oppskriften. Dermed unngås umulig pipettering mengder brøk desimaler. Detaljert oppskrifter for alle lager løsninger CgXII middels gis i supplerende dokumentet.
    1. Arbeider cellen bank (WCB)
      Merk: Hver vekst eksperiment, en WCB aliquot brukes. Hvis det trengs mer dele, bruk 100 mL hjernen hjertet infusjon (BHI) medium i 1000 mL forbløffet riste flasker eller vaksinere flere riste flasker, som er samlet før en glyserol løsning.
      1. Tilbered enkelt kolonier av rekombinant uttrykk belastning C. glutamicum pCGPhoDBs- GFP43 på agar plater (37 finans BHI pulver, 20 finans agar, 25 mg/L kanamycin). Kontaktflate materiale kan enten kommer fra frisk transformasjon eller fra en cryopreserved aliquot.
Ruge på 30 ° C helt utseendet til enkelt koloniene; Dette tar vanligvis en til to dager.
  • Vaksinere en shaker kolbe kultur (50 mL BHI medium med 25 mg/L kanamycin, 500 mL forbløffet kolbe, 250 rpm, 25 mm risting diameter, 30 ° C) med kolonien materiale og ruge over natten (ca 16 h).
  • Kombiner ett volum for resulterende celle suspensjon med ett volum på 500 g/L sterilt glyserol løsning og distribuere i 2 mL dele i sterilt kryonisk bevaring hetteglass. Butikken på-80 ° C.
  • MBR dyrking protokollen
    Merk: For næringsdrivende BioLector MBR systemet i denne studien, spredt lys (biomasse) og GFP fluorescens er intensitet målinger, som trenger en bestemt gevinst verdi tildelt. Jo høyere gevinst, jo høyere optisk signal forsterkes; Dette er også hvorfor spredte lys og fluorescens måles i vilkårlig enheter (a.u.). Bestemme passende forsterkningen for biomasse og GFP gjenkjenning i foreløpige eksperimenter, egnet risting frekvens og fylle volum for å unngå oksygen-begrensning på høyere biomasse konsentrasjoner under senere prosesstrinn. De næringsdrivende dyrking forholdene ("Flowerplates", dvs., blomsten-formet 48-og MTPs, risting frekvensen av 1200 rpm, fylle volum av 1000 µL, 10 finans glukose som viktigste karbon kilde) sikret oksygen ubegrenset i nærområdet. For maksimalt oksygen forflytning ratene fra andre kombinasjoner av fylle volumer og riste frekvenser i blomst-formet 48-og MTPs, er dataark fra leverandøren tilgjengelig. Også, vekst mangler enkelte kulturer kan oppstå på grunn av lave mengder sekundære underlag (f.eks, nitrogen, sporstoffer). Kontroller derfor biomasse konsentrasjonen på slutten av nærområdet. I denne studien ble uten slike effekter observert.
    1. Definere dyrking protokollen for MBR-systemet ("BioLector") som følger:
    2. Filterset 1: Biomasse, få 14. Filterset 2: pH, gevinst er forhåndsinnstilt. Filterset 3: pO2, gevinst er forhåndsinnstilt. 4: GFP, få 80.
    3. Risting frekvens: 1200 rpm.
    4. Temperatur: 30 ° C.
    5. Tidspunkt: 15 min.
    6. Eksperimentet tid: manuell (dyrking ikke stoppes automatisk).
  • Generasjon av middels lagerløsning pipettering liste
    Merk: Nesten alle flytende håndtering robot system er i stand til å lese pipettering handlinger fra eksterne filer. I utgangspunktet er den minimale informasjonen overføringen volumet og plasseringen av reagens kilden og målet for hver representert ved en labware posisjon på robot dekk og en bestemt hulrom i labware. Imidlertid må forskjellige syntakser om forskjellige væske håndteringssystemer vurderes. Figur 2 viser et eksempel filstrukturen for næringsdrivende pipettering systemet i denne studien.
    1. Fire typer lager løsninger er pipetted i hver dyrking også:
      1. Lager løsninger av media-komponenter som er variert ("Variant aksjer").
      2. Vann for å kompensere for ulike kumulative mengder over aksjer.
      3. En lager løsning ("Resten lager") som inneholder alle komponenter som er løst. Denne lager løsningen kan være sammensatt fra aksjer som inneholder de forskjellige komponentene som er, f.ekslagret ved forskjellige temperaturer eller sterilisert av ulike metoder.
      4. Inoculum, som skal legges til som siste komponenten og sette på skrivebordet bare før addisjon å unngå bosetting av cellene.
    2. Per dyrking Vel, beregne volumene overføres for alle mediekomponenter i henhold til:
      Equation 1
      Volumet skal legges for enkelte Variant aksjer kanskje null, dvsnår denne spesifikke komponenten utelates.
    3. Revidere alle beregnede volumer Vjeg for egnet tall. Pipettering volum intervaller i volum trinnene bør ikke være for liten. Juster konsentrasjonen av Variasjon aksjerom nødvendig. For eksempel, minimal pipettering volumet her ble definert som 10 µL og minimal økningen ble definert som 5 µL. Disse volumene bør generelt defineres basert på eksperimentelt bestemt presisjon og nøyaktighet for brukte flytende håndtering stasjon15,44.
    4. Beregne volumet av Resten lager med fast komponenter for alle brønnene som følger:
      Equation 2
      hvor det maksimale kumulative volumet i Variant lager Equation 3 brukes. Derfor beregne de nødvendige konsentrasjonene av fast Resten lager som følger:
      Equation 4
      Klargjør Resten lager tilsvarende.
    5. Per dyrking Vel, beregne volumet av vann legges som følger:
      Equation 5
    6. Per dyrking godt, viser alle volumer legges i følgende rekkefølge tillegg: VH2O, VRestStock, Vjeg, VInok. Formatere pipettering listen etter spesifikasjonene til væsken håndtering stasjon, som vises for eksempel i figur 2.
  • Frø kultur, automatisert media forberedelser og start viktigste kultur
    1. Opprette en protokoll for flytende håndtering robot. Se Figur 3 og Figur 4 for en eksempel protokoll for en «Janus»-system, implementert i tilsvarende "WinPREP" programvare. Protokollen bør vurdere følgende aspekter:
      1. Inkluder en tilstrekkelig runtime sterilt bolig før media forberedelse.
      2. Inkluder en innledende overdreven rengjøring og vask av alle pipettering tips og rør.
      3. Velg passende labware beholdere for lager løsninger. Her er dypt bra plater med 12 kolonner egnet for lagring av Variasjon aksjer, som alle åtte pipettering tips kan dyppe i en parallell ordning i kolonnene godt. Dette raskere mye media forberedelse. Hvis 15 mL eller 50 mL reagens rør brukes som reservoarene, kan eneste pipettering tips dyppe i det samtidig.
    • 100 mL trau brukes for andre aksjer som vann og Resten lager, som disse lager løsninger krever høyere salgsvolumer totalt.
  • Gi en tilstrekkelig totalvolumet for hver aksje løsning å kompensere for avfallsvolumer, høyde pipettering forskyvninger, osv.
  • Sett inn en bruker spørsmål før inoculation trinn, slik at dette trinnet utføres umiddelbart før frø kulturen prosedyren.
  • Forberede alle lager løsninger i et sterilt måte og store til bruk i passende beholdere, f.eks, sterile 15 mL og 50 mL reagensglass.
  • Sterilisere dypt godt platene for lagerløsning lagring på en worktable, f.eksved å tørke med 70% etanol og påfølgende tørking i laminær strømning hette.
  • Starte frø kulturen av vaksinere 50 mL BHI medium som inneholder 25 mg/L kanamycin med en aliquot fra WCB. Før MBR dyrking, forberede friske, viktige inoculum fra eksponensielt voksende frø kulturer i tilstrekkelig.
  • Plassere alle nødvendige labware på robot skrivebordet og hell aksje løsninger i de tilsvarende labware.
  • Starte robot arbeidsflyten for media forberedelse, slik at det siste trinnet (inokulasjon), er nådd i tid med starten av frø kultur. Totalt kjøretidsdetaljene av robot arbeidsflyten må vurderes tidligere. Her var det totale runtime ca 1,5 timer.
  • Smak frøet kultur etter ca 2 timer, så hver time, overvåke veksten av optisk densitet (OD600). Etter ca 5 h, kulturen kommer 3-4 OD600 og brukes til å vaksinere de viktigste kulturene.
  • Plasser frø kulturen på flytende handler skrivebordet og fortsette media forberedelse protocol. Forsegle dyrking MTP etter vaksinering.
  • Plasser forseglet dyrking MTP BioLector enheten og starter protokollen forhåndsdefinert dyrking.
  • Kast de gjenværende lager løsningene, ifølge biosafety regelverk om nødvendig, og frø kulturen fra robot skrivebordet. Rengjør gjenbrukbare labware og starter flytende handler dekontaminering protokollen.
  • Produktet kvantifisering og forbehandling av rådata for analyse
    1. Stopp den viktigste kulturen etter en 17 h runtime.
    2. Overføre måledataene fra BioLector MBR enheten tilkoblet datamaskinen med BioLection programvarepakken etter produsentens brukerveiledning.
    3. Bruk av "Data Management → dataene" funksjon "BioLection" programvarepakken som følger MBR systemet til å konvertere filen rå data i et regnearkformat for enkel tilgang. Kopier GFP signal dataene for alle dyrking brønner fra tidsstempel-kolonnen nærmest 17 h. identifisere GFP signaler fra referanse dyrking brønnene og gjennomsnittet. Normalisere alle gjenværende GFP signalet av gjennomsnittlig referanse signal.
    4. Kvantifisere GFP titer bruker flere metoder (hvis nødvendig)
      1. Overføring av cellen suspensjon fra alle dyrking brønner i prelabeled reaksjon rør og få cellen uten nedbryting etter sentrifugering i 10 min med maksimal hastighet med en Borstemmaskin sentrifuge.
      2. Overføre 200 µL av hver celle uten nedbryting til en svart 96-brønns MTP med gjennomsiktig bunn og lese GFP bestemt fluorescens på 488/520 nm likner en passende microplate. Normalisere GFP signalet fra alle brønner med gjennomsnittlig signalet fra referanse i nærområdet, som i trinn 1.5.3.
        Merk: Absolutt GFP fluorescens signalene kan ikke sammenlignes for ulike måling enheter. Derfor fungere de 5 referanse stammene fra alle viktigste nærområdet som en intern standard. Forbedring av GFP titer kan uttrykkes i forhold til den interne standarden. Dette gir sammenligning av resultatene fra forskjellige eksperimenter og forskjellige GFP kvantifisering (se neste to trinnene).
      3. Bestemme proteininnhold av celle-fri supernatants med standardprotokoller, f.eks, Bradford eller BCA analysen. I kombinasjon med resultatene fra trinn 2 er bestemmelse av en protein bestemte GFP titer mulig.
        Merk: Etter fluorescens måling, bruke prøven direkte fra denne microplate. Bruk av flerkanals Pipetter forenkler sterkt nødvendig væsken håndtering trinnene.
      4. Utføre en SDS side visualisering av celle-fri supernatants etter standardprotokoller for å kontrollere at de fleste av proteininnholdet økningen skyldes økt GFP sekret.
        Merk: SDS-siden er mer arbeidskrevende enn de tidligere nevnte metodene, spesielt med høy prøven Last. For bekreftelse er det ofte nok til å kjøre SDS-sider av cellen gratis supernatants fra referanse middels og siste optimalisert middels nærområdet15.

    • 2. sensitivitetsanalyse (figur 1: del B).

    Merk: Målet med denne delen er å identifisere de viktige faktorene som har en betydelig effekt på målet.

    1. Velg en innledende konsentrasjon rekke mediekomponenter. Referanse middels sammensetningen bør ligge innenfor valgte konsentrasjon områdene.
    2. Velg en passende DOE. Slike design kan bli funnet i litteratur, f.eksfra NIST/SEMATECH e-håndboken av statistiske metoder (tilgjengelig på www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm). Valgte design, avhenger av antall mediekomponenter rundt (her, 11) og antall utførte eksperimenter (her, 32). I den gitte eksemplet ble design "2IV11-6" valgt som resulterer i 32 eksperimenter og kan beregning av effekten av øker konsentrasjonen av en av de elleve komponentene på målet rundt. For å være mer spesifikk, er de viktigste effektene ikke forvirret med pair-wise faktor samhandling. De kan være forvirret med høyere orden interaksjoner som er, men sannsynligvis ikke betydelig.
    3. Bruke gjenværende brønnene (her, 16) for å utføre flere gjentak med referanse mediet å vurdere reproduserbarhet av prosessen. Gjentak bør like spres over platen til å oppdage posisjonelle effekter. Middelverdien av målt utdataene fra referanse eksperimenter brukes for normalisering. Dvs deles hver målt resultatet av sensitivitetsanalyse middelverdien av referanse utdataene.
    4. Beregne viktigste og hvis mulig kombinasjon effektene bruker riktig statistikk programvare. Klassisk design av eksperimentet er basert på en polynom tilnærming45. MATLAB funksjonen mvregress kan for eksempel brukes for estimering polynom koeffisientene.
    Funksjonen mvregress er del av statistikk og maskinen lære verktøykassen.
  • Identifisere relevante effekten av ulike mediekomponenter på målet ved hjelp av en t-test. I eksemplet NH4+ har en betydelig negativ effekt, og Ca2 + og Mg2 + viser den sterkeste positive effekten (figur 5). Fordi GFP signalet var normalisert, koeffisientene representerer den gjennomsnittlige relative endringen i GFP signalet når øker konsentrasjonen av den enkelte komponenten fra center verdien, Equation 7 , til maksimumsverdien.
  • Fast komponenter uten en relevant effekt er til referanseverdi under optimalisering.

    • 3. iterativ optimalisering (figur 1: del C)

    Merk: verktøyet MATLAB KriKit gjelder tolkningen og statistiske data analyse36. KriKit lar brukeren lage en data-drevet Kriging modell. Denne Kriging modellen spår funksjonell relasjonen mellom media komponentene og målet. Det gir også informasjon om prediksjon usikkerheten. Høy usikkerhet angir støyende data og/eller utilstrekkelige Datatetthet.

    1. DOE
      Merk: Nye eksperimenter er iterativt designet, basert på resultatene av den forrige løpe.
      1. I den første gjentakelsen, utforme nye eksperimenter for detaljert undersøkelse av identifiserte mediekomponenter rundt. Eksperimentelle resultater fra avsnitt 2 kan ikke overføres til iterativ optimalisering (del 3), som konsentrasjonen av komponenter uten relevante effekt er nå fast til de respektive referanseverdien. Følgelig er eksperimenter fra sensitivitetsanalyse og iterativ optimalisering ikke sammenlignbare.
      2. Ellers Følg ordningen illustrert i figur 1, ramme "Iterativ optimalisering". Hvis potensialet optimal ligger innenfor området definert konsentrasjon, er nye eksperimenter utformet med forventet forbedring40,46. Eksperimentell design basert på forventet forbedring er integrert i KriKit verktøykassen. Hvis optimal ligger på grensen, utvide området konsentrasjon.
    2. Utføre eksperimenter på designet prøvepunktene ifølge eksperimentelle metoder definert i del 2.
    3. Statistisk analyse
      1. Konstruere en Kriging modell de kombinerte dataene fra alle gjentakelser, inkludert gjeldende.
      2. Undersøke modell produksjonen av visualisering ved hjelp av omfattende verktøy for KriKit (2/3D interpolering, filmen analyse, screening tomten, etc.).
    4. Hvis en optimal området ble beregnet med tilstrekkelig nøyaktighet, stoppe optimalisering. Hvis ikke, fortsetter du med trinn 3.1.
      Merk: Figur 6 illustrerer iterativ optimalisering for test studier. Konsentrasjon området ble suksessivt utvidet til et platå ble funnet (gjentakelse 1-6). Den syvende runden ble brukt for å utforske grensene i mer detalj.

    4. verifisering av resultater (figur 1: del D)

    Merk: Etter endt iterativ optimalisering, første forutsetninger må kontrolleres for gyldighet.

    1. Gjør om sensitivitetsanalyse (del 2) for optimal medium komposisjon. Konsentrasjonen av komponenter som er undersøkt i figur 1 (del C) er faste til de optimale verdiene. Konsentrasjoner av andre komponenter er varierte etter en passende DOE.
      Merk: Lignende resultater i begge screenings indikerer at konsentrasjonen nivåene av de undersøkte komponentene ikke endrer effekten av andre komponenter. Hvis screening viser betydelige forskjeller i resultatene fra del B, komponenter med endrede effekt skal legges til bassenget undersøkte komponenter og del C skal gjentas.
    2. Når det gjelder indirekte måling (f.eks, fluorescens som indikator for produktet konsentrasjon), gjelde ortogonale måling tilnærminger (f.eksaktivitet analysen, Bradford eller BCA protein kvantifisering, SDS side) å bekrefte endringen i målet av interesse ved å sammenligne resultatene fra referanse mediet og optimalisert middels15.

    Representative Results

    Introdusert protokollen ble brukt for å maksimere titer av utskilles GFP. Spesielt GFP titer etter 17 h dyrking ble valgt som optimalisering mål. Online fluorescens oppdagelsen av GFP lov enkelt produkt kvantifisering. Men er normalisering av GFP signal med data fra en referanse dyrking uunnværlige for å garantere reproduserbarhet og sammenlignbare resultater. En pre-utvalget av media komponentene ble utført på en rasjonell basis som beskrevet i del 1. Eksperimenter ble utført følge instruksjonene av del 1: parameterne for våt laboratorium prosedyrer ble definert for hele studiet sikrer konsistens og reproduserbarhet resultater.

    Som beskrevet i del 2, ble en første screening utført for å identifisere relevante komponenter viser en betydelig innvirkning på optimalisering målet for videre, mer detaljerte studier. MTP-basert MBR systemet tillater 48 eksperimenter utføres parallelt. Tatt i betraktning maksimalt antall parallelle eksperimenter på en MTP (48) og antall medier komponenter (11) gjør den 2IVutforme11-6 Brøkdelen et passende valg. Denne eksperimentell design består av 32 eksperimenter og lar estimering av det hovedavdeling bevirke for hver av de undersøkte mediekomponenter. Gjenværende dyrking brønnene (16) ble brukt for flere gjentak eksperimenter med referanse medium for å vurdere reproduserbarhet og posisjonelle effekter. Dvs hvert eksperiment er utført én gang (ingen gjentak), unntatt for referanse eksperimentet (fem gjentak).

    Tabell 1 oppsummerer resultatet av screening analysen. I området vurdert konsentrasjon viser varierende flertallet av media komponentene ikke en merkbar effekt på målet. Komponenten NH4+ viser en sterk negativ effekt, mens Ca2 + og Mg2 + Vis sterkeste positiv tendensen. Effekten av Mg2 + er ikke betydning for dagens konsentrasjon utvalg, men kan være for bredere konsentrasjon. Det ble derfor besluttet å utelate NH4+ fra mediet og undersøke effekten av Ca2 + og Mg2 + i videre studier.

    Del 3 beskriver iterativ optimalisering fremgangsmåten som brukes for å maksimere GFP fluorescens signalet mens varierende konsentrasjonen av Ca2 + og Mg2 +. I gjentakelse 1 ble hypotesen at NH4+ kan utelates testet. Konsentrasjon området for Ca2 + og Mg2 + ble innført fra screening analyse. Den laveste konsentrasjonen av NH4+ ble satt til null og maksimal konsentrasjon ble vedtatt fra screening eksperimentet. I de følgende eksperimentene, ble komponent-konsentrasjoner distribuert over 3 x 3 x 3 rutenett i det definerte konsentrasjon utvalget, resulterer i 27 eksperimenter. Under alle i nærområdet, fem gjentak av referanse medium var inkludert, som tjente som interne standard og å sikre at ingen posisjonelle effekt over MTP oppstod. De resterende 16 brønner, ble konsentrasjonen av NH4+Ca2 +og Mg2 + tilfeldig delt innenfor de angitte områdene.

    Figur 5 A visualiserer resultatene av de første gjentakelsene. Akseetiketter se komponenten konsentrasjonen brukes i den opprinnelige referanse mediet, indikert ved x Ref. Blå overflater representerer Kriging innskuddene som ble beregnet ved hjelp av KriKit programvare. Hver overflaten er forbundet med en relativ konsentrasjon for NH4+ (mørk blå: 0 x Ref, rutete: 1 x Ref, lys blå: 2 x Ref). Denne visuelle representasjonen avslører at det er gunstig å utelate NH4+. Interpolering flater viser de positive effektene av både Mg2 + og Ca2 +, som alle flyene stige med økende konsentrasjoner.

    Basert på resultatene av gjentakelse 1, ble det besluttet å utvide konsentrasjon område av Ca2 + og Mg2 + ved å doble maksimumskonsentrasjoner og skiftende vinduet eksperimentell design til øverst til høyre, se figur 5 B. innenfor dette intervallet konsentrasjonen ble distribuert på en 6 x 6 rutenettet. Dette sikrer en jevn distribusjon over full konsentrasjon området, fører til optimal Kriging interpolering resultater. Figur 5 B viser Kriging interpolering tomten basert på samlede data målt i begge gjentakelser (røde prikker og gule ruter). For begge, Ca2 + og Mg2 +, fortsetter den positive effekten av økende konsentrasjonene. Følgelig prosedyren ble gjentatt ved å doble maksimal konsentrasjon og dermed vinduet eksperimentell design var flyttet å utforske grensene for øverst til høyre.

    Figur 6 A gir en oversikt over gjenstående optimalisering prosedyren. Analyse av innsamlede datasettet til gjentakelse 3 avslørte en begrensning av den positive effekten av Mg2 +, i.e., en optimal konsentrasjon utvalg av Mg2 + ble identifisert. Det ble derfor besluttet å utvide ytterligere konsentrasjon området bare for Ca2 + (gjentakelse 4). Denne fremgangsmåten ble gjentatt to ganger (gjentakelse 5 og 6) til en metning av GFP ble funnet. Denne metning er forklart av nedbør av Ca-salter for anvendt konsentrasjonen av Ca2 +, som ikke er tilgjengelig for cellene.

    Som eksperimentelle resultater er alltid opprørt av støy, den resulterende Kriging interpolering vises uregelmessig og visuell inspeksjon kan føre til falsk konklusjoner. Men kan hvilket optimal konsentrasjon media komponentene for mettet GFP signalet pålitelig identifiseres med statistiske z -test, som også er implementert i KriKit. Z -testen bruker direkte iboende statistisk informasjon gitt av Kriging metoden, dvs, prediksjon verdier og prediksjon usikkerhet. Figur 6 B viser identifiserte platået, som bestemt og visualisert ved hjelp KriKit verktøykassen.KriKit verktøykassen er fritt tilgjengelig36 og kommer med en detaljert tutorial som forklarer hvordan du bruker funksjonene.

    Hvis det finnes mer enn to aktuelle komponenter, når 3D-visualisering grensen. KriKit gir flere andre mulige visuell representasjon metoder som filmer eller "screening tomten". Hvis potensialet optimal ligger innenfor området definert konsentrasjon, er nye eksperimenter automatisk utformet med forventet forbedring40,46. Eksperimentell design basert på forventet forbedring er integrert i KriKit verktøykassen. Mer informasjon finnes i dokumentasjonen.

    Etter iterativ prosedyren, var en verifikasjon av resultatene gjennomført, som beskrevet i del D. Gyldigheten av første forutsetninger ble sjekket ved å utføre en ekstra sensitivitetsanalyse bruker den optimale medium komposisjonen. Dvs alle første mediekomponenter rundt var varierte, men Ca2 + og Mg2 + ble satt til deres optimal konsentrasjon nivåer. I denne studien de optimale konsentrasjonene Equation 8 = 32 x Ref og Equation 9 = 6,8 x Ref ble valgt. Tabell 2 viser resultatene av validering screening. Ligner på første følsomheten screening (jf. tabell 1), NH4+ har fortsatt en betydelig negativ påvirkning og gjenværende effekter er fortsatt ubetydelig.

    På grunn av lett tilgang, ble GFP fluorescens signalet fra dyrking suspensjon brukt til å kvantifisere den ekstracellulære GFP titer under alle eksperimenter. Verifikasjon årsaker ble GFP fluorescens validert mot andre målinger. Fordi GFP er secreted via Tat-veien, kan ikke fluorescens signalet forskjellsbehandle intra- og ekstracellulære GFP. Dermed ble nærområdet reprodusert med referanse mediet og optimalisert medium. Foruten fluorescens måling fra celle-fri dyrking supernatants, proteininnhold ble kvantifisert Bradford analysen og (semi)-kvalitative GFP forbedring visualisert ved SDS-side15. Alle resulterende måling signaler var omtrent fordoblet for lokalt med optimalisert medium i forhold til referanse medium og godkjent den ca 100% forbedring av utskillelsen av optimalisert medium. Følgelig betraktes GFP bestemt fluorescens for dyrking suspensjon som en egnet beregning for optimalisering målsettingen, dvsden ekstracellulære GFP titer.

    Figure 2
    Figur 2 : Skjermene fra volumlisten pipettering for sensitivitetsanalyse. Oppføringer i den første kolonnen tilordner en unik ID til alle volumer på rad; Denne identifikatoren er MTP nummer av målet dyrking MTP på flytende handler skrivebordet, jf Figur 4C. Resten av kolonnene kode volumer for ulike løsninger ("Sln-01" til "Sln-15") for å være pipetted. Det kumulative volumet i én rad tilsvarer siste dyrking volumet tilsvarende godt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 3
    Figur 3 : Skjermene fra væsken kontroll programvare "WinPREP". Venstre: Rad-bestilt kommandoer, inkludert en overføring kommando for hver aksje løsning å være pipetted. Før siste kommandoen for inoculum tillegg settes en bruker spørsmål for å sikre frø kulturen er plassert på bordet akkurat i tide. Høyre: Skjematisk av skrivebordet, inkludert kilde labware for variasjon aksjer (to dypt bra plater med 12 kolonnen som brønner), reagens bunnen for resten lager, vann og inoculum og media forberedelse målet dyrking MTP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 4
    Figur 4 : Samling av detaljert skjermbilder for oppsett av pipettering av en lagerløsning. (A) pakket kommandoen for pipettering av Fe lager. Kilde labware og kilde godt merket innenfor på skrivebordet, Les ramme og røde kolonne av tilsvarende dypt godt plate. Destinasjon labware og destinasjon brønner i merkes av blå ramme rundt og blå wells fra målet dyrking MTP. (B) detaljert eksempel syn på tildeling av pipettering volumer for dette trinnet (Fe lager løsning). Antall destinasjoner er lest fra pipettering listen, som har 48 rader. Dispense volumene alle mål brønner for Fe lagerløsning finnes i kolonne 4 i listen pipettering. Merk at den første kolonnen i listen pipettering inneholder identifikatorer og ikke volumer som skal overføres, se figur 2. (C) detaljer om destinasjon godt nummerering. Volumer som er skrevet i raden #1 tilsvarende pipettering listen vil bli pipetted i godt merket som #1 og så videre. Wells #01, #08, #41 og #48 tilsvarer brønner A01, A08, F01 og F08 alfanumerisk kodingen, som også er skrevet i dyrking MTP selv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 5
    Figur 5 : Detaljert resultater fra den første gjentakelsen. (A) Kriging interpolering basert på eksperimentelle data av gjentakelse 1. Røde prikkene angir datasettet. For sammenligning, alle tre interpolering flater er overlagd i en handling (mørk blå: 0 x Ref, rutete: 1 x Ref, lys blå: 2 x Ref). En alternativ representasjon av resultatene kan finnes andre steder15. (B) Kriging interpolering basert på eksperimenter utført i gjentakelse 1 (røde prikker) og gjentakelse 2 (gul ruter).Deler av dataene som vises i denne illustrasjonen har vært publisert tidligere15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 6
    Figur 6 : Skildring av iterativt samlet optimalisering resultater. (A) Final Kriging modell prediksjon. (B) Statistisk identifikasjon av optimale området (rød) basert på statistiske z-test, som leveres av KriKit. Bokser angir etterfølgende trinnene iterativ design og gjennomføring av eksperimenter. Deler av dataene som vises i denne illustrasjonen har vært publisert tidligere15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Komponent Normalisert koeffisienten middelverdien
    Fe2 + -0.08
    MN2 + -0.05
    Zn2 + -0.21
    Cu2 + -0.21
    NH4+ -2.04
    Ni2 + -0.11
    Co2 + -0.10
    MoO42- 0,03
    BO33- 0,06
    Ca2 + 1.00
    Mg2 + 0.45

    Tabell 1: resultatene av sensitivitetsanalyse. Koeffisient verdier som representerer den gjennomsnittlige effekten når øker respekt media komponent konsentrasjonen fra center verdien til maksimumsverdien. For optimal eksperimentell design, som finnes i standard litteratur og brukt her, standardavvik representerer direkte eksperimentell variasjonen skyldes replikering av referanse eksperimentet. Koeffisient verdier var normalisert av maksimums-verdien (0.0422 for komponent Ca2 +). Normalisert og absolutt koeffisient standardavviket er 0.54 og 0.0226, henholdsvis.

    Komponent Normalisert koeffisienten middelverdien
    Fe2 + -1.00
    MN2 + 1.00
    Zn2 + -3.48
    Cu2 + -0.52
    NH4+ -15.95
    Ni2 + 0.69
    Co2 + -0.51
    MoO42- -0.45
    BO33- -1.11

    Tabell 2: resultatene av den endelige sensitivitetsanalyse. Koeffisient verdier som representerer den gjennomsnittlige effekten når øker respekt media komponent konsentrasjonen fra center verdien til maksimumsverdien. Som en optimal eksperimentell design ble brukt, avhenger standardavviket bare eksperimentelle variasjon med optimalisert middels sammensetningen. Eksperimentell variasjoner økt litt i forhold til variasjon med referanse medium. Koeffisient verdier var normalisert av maksimums-verdien (0.0106 for komponent Mn2 +). Normalisert og absolutt koeffisient standardavviket er 3.63 og 0.0385, henholdsvis.

    Discussion

    Den generiske typen presentert protokollen lar ulike tilpasninger, f.eksfor å studere andre mikrobiell uttrykk verter9,47,48,49,50, 51, eller optimalisere andre egenskaper av målet protein, som glykosylering mønster eller disulphide obligasjoner. Protokollen må også tilpasses den tilgjengelige laboratorieutstyr. Integreringen av en MBR-system kan øke eksperimentelle gjennomstrømning, som gjør store besparelser i tid. Men når du erstatter fullstendig instrumenterte og kontrollerbar bioreaktorer MBR systemer, må skalerbarhet resultater vurderes8,37,52,53. Bruk av DOE metoder og matematisk modellering bidrar til å maksimere innhold av måledata når det gjelder de studerte objektive54 ved effektiv eksperimentelle planlegging og modell-basert data tolkning15.

    Endringer til metoden
    Ved siden av multi-purpose og utvides robot flytende håndteringssystemer som brukes i denne studien, bør det nevnes at det er flere mindre væske håndteringssystemer kommersielt tilgjengelig som er i stand til å utføre denne oppgaven, og kan plasseres innenfor laminær strømning arbeid benker. Hvis ingen automatiserte pipettering systemer er tilgjengelig, kan ulike medier komposisjoner i henhold til DOE planen også realiseres ved manuell pipettering bruker enkelt og/eller flerkanals pipetter. Siden manuell forberedelsene er mer utsatt for feil og krever svært fokusert arbeid for ganske lang tid, anbefales det å forberede et lavere antall forskjellige medier komposisjoner.

    Avhengig av funksjonene av næringsdrivende MBR, vil tilsvarende dyrking protokollen variere. For eksempel hvis ingen online måling av biomasse formasjon er tilgjengelig, kan det være tilstrekkelig å måle biomasse konsentrasjon etter ferdigstillelse av vekst eksperimentet. I kombinasjon med avlytting av pH og oppløst oksygen, som er implementert i flere MBR systemer, vekst metning kan bestemmes trygt. I prinsippet kan vekst eksperimenter utføres i MTPs alene plassert inne risting inkubatorer, uten bruk av en MBR-system. I dette tilfellet riktig dyrking forholdene må sikres: (1) oksygen-begrenset i nærområdet kan unngås ved å bruke MTPs med passende geometrier, sammen med riktig risting frekvenser og risting diameter, f.eks, square 96 eller 24 dyp bra plater drives på 1000 rpm på 3 mm kaste eller 250 rpm på 25 mm kaste, henholdsvis. Viktigere, jo lavere overføringshastigheter oppnåelig maksimalt oksygen, jo lavere viktigste karbon kilde bør være konsentrert. Som nevnt ovenfor, til denne studien var 10 g/L glukose egnet til å hindre oksygen-begrensning for næringsdrivende dyrking betingelsene; (2) prøvetaking av MTP kulturer for biomasse og produkt kvantifisering skal reduseres til et minimum. Hver gang MTP fjernes fra risting inkubator, oksygen overføring vil umiddelbart break-ned som kan resultere i ugunstig dyrking forhold; (3) i oppfatning av forfatterne anbefales ikke bruk av MTP lesere som dyrking enheter som disse enhetene ikke er utviklet for dette formålet. For eksempel risting mekanikk ble bygget for sporadiske blanding av microplates etter at reagens og dermed mangler ofte robusthet for lange serier av kontinuerlig risting levetid i dager. Videre kan ikke tilstrekkelig inngang kreves for mikrobiell nærområdet realiseres i disse leserne. Integrering av optisk tetthet i korte tidsintervaller krever stoppe av risting bevegelse, som fører til gjentatte perioder med oksygen-begrensning. Fordampning i slike systemer over lang dyrking perioder vil dessuten forvrenge resultater. Mer om overraskende komplisert tema på ved hjelp av MTPs for mikrobiell nærområdet, kalles leseren sitert litteratur22,23,24,25,26 og referanser der.

    Ytterligere vurderinger
    Å fremskynde iterativ optimering skritt anbefales det å nøye Velg analytisk for produktet kvantifisering. Raske og enkle metoder bør være foretrukket på bekostning av presisjon og nøyaktighet, som iterativ eksperimentell design strategien tåler eksperimentelle unøyaktighet. Men må de endelige resultatene bekreftes mot tilstrekkelig presise og nøyaktige produktet kvantifisering metoder som kan være mer komplisert. Generelt, nøye vurdering og beslutningsprosesser om studien prosedyrene krever innsats i begynnelsen av studien, men betaler ut i det lange løp, etter at rutinemessig metoder har blitt etablert.

    Det anbefales å definere en referanse eksperiment som er i forhold til alle eksperimentene under optimalisering. Dvs er anvendt middels komponent konsentrasjoner samt målt resultatet normalisert via dele referanseverdier. På denne måten hver brukes og målt verdi kan tolkes som x-fold av referanseverdi. Ta i kontoen variasjoner mellom platene, utføres fem referanse eksperimenter på hver plate. Middelverdien av målt resultatet brukes for normalisering.

    Det kan vanligvis ikke garanteres at utviklet mediet er også egnet for andre stammer. Men vil forbedret mediet sannsynligvis også være egnet for dyrking uttrykket stammer med små genetiske forskjeller, f.eksnår produsere enzym varianter med enkelt aminosyre erstatninger Hentet fra mutagenese studier ( men selv enkelt punkt mutasjoner har blitt beskrevet effekt cellenes stoffskifte og heterologous uttrykk ytelse55,56). I dette tilfellet, kan presenterte protokollen være et første skritt, etterfulgt av protokoller for høy gjennomstrømming uttrykk screenings57. Hvis protokollen brukes for middels utvikling med påfølgende skalere opp til matet-batch i nærområdet, må optimalisert mediet bekreftes tilsvarende bioprocess forholdene, som klone screening kampanjer på Mikroskala identifisert ulike topp utøvere for ulike fôring strategier og dyrking media52,58. Videre kan de introduserte KriKit36 generelt bidra til bedre helhetlig bioprocess optimalisering.Bare nylig ble verktøyet evnene utvidet til også støtte flere objektive optimalisering40, som kan være viktig for å optimalisere både oppstrøms og nedstrøms prosesser59,60.

    Disclosures

    Forfatterne ikke avsløre.

    Acknowledgments

    Den vitenskapelige aktiviteten til Bioeconomy Science Center ble økonomisk støttet av departementet for innovasjon, vitenskap og forskning innenfor rammen av NRW-Strategieprojekt BioSC (nr 313/323-400-002 13). Forfatterne takker departementet for innovasjon, vitenskap, og forskning av Nordrhein-Westfalen og Heinrich Heine University Düsseldorf for et stipend til Lars Freier i CLIB-Graduate klynge industrielle bioteknologi. Videre midler mottatt fra programmet for aktivering mellomrom "Helmholtz innovasjon Labs" av tyske Helmholtz forening til støtte til "mikrobiell Bioprocess Lab – A Helmholtz innovasjon Lab".

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BioLector m2p-labs G-BL-100
    Flowerplate m2p-labs MTP-48-BOH For cultivation in the BioLector device
    Sealing foil m2p-labs F-GP-10 Sterile sealing for Flowerplate
    MATLAB Mathworks 2016b
    KriKit Forschungszentrum Jülich n/a Freely available, MATLAB installation required
    Janus pipetting robot Perkin Elmer n/a Includes "WinPrep" software installation
    12-column deep well microplate E&K Scientific EK-2034 Container for medium stock solutions
    96 well microplates, transparent, F-bottom Greiner 655101 For Bradford protein assay
    µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom Greiner 655087 For flourescence measurement in cell-free supernatants
    Pipette Research plus multi-channel pipettes Eppendorf n/a Facilitates manual liquid handling with microplates
    TruPAG Precast Gels Sigma PCG2002 For SDS-Page analysis of cell-free supernantants
    Bradford Reagent Sigma B6916
    C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP n/a n/a Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Choi, J. -M., Han, S. -S., Kim, H. -S. Industrial applications of enzyme biocatalysis: Current status and future aspects. Biotechnol Adv. 33 (7), 1443-1454 (2015).
    2. Li, S., Yang, X., Yang, S., Zhu, M., Wang, X. Technology Prospecting on Enzymes: Application, Marketing and Engineering. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), (2012).
    3. Adrio, J. L., Demain, A. L. Microbial enzymes: tools for biotechnological processes. Biomolecules. 4 (1), 117-139 (2014).
    4. Yim, S. S., An, S. J., Kang, M., Lee, J., Jeong, K. J. Isolation of fully synthetic promoters for high-level gene expression in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 2959-2969 (2013).
    5. Hemmerich, J., et al. Use of a Sec signal peptide library from Bacillus subtilis.for the optimization of cutinase secretion in Corynebacterium glutamicum. Microb Cell Fact. 15 (1), 208 (2016).
    6. Wendisch, V. F. Microbial production of amino acids and derived chemicals: synthetic biology approaches to strain development. Curr Opin Biotechnol. 30, 51-58 (2014).
    7. Lee, J. -Y., Na, Y. -A., Kim, E., Lee, H. -S., Kim, P. The Actinobacterium Corynebacterium glutamicum, an Industrial Workhorse. J Microbiol Biotechnol. 26 (5), 807-822 (2016).
    8. Rohe, P., Venkanna, D., Kleine, B., Freudl, R., Oldiges, M. An automated workflow for enhancing microbial bioprocess optimization on a novel microbioreactor platform. Microb Cell Fact. 11 (1), 144 (2012).
    9. Liu, X., et al. Expression of recombinant protein using Corynebacterium glutamicum.: progress, challenges and applications. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 652-664 (2016).
    10. Freudl, R. Corynebacterium glutamicum as a Platform Organism for the Secretory Production of Heterologous Proteins. Corynebacterium glutamicum: From systems biology to biotechnological applications. Burkovski, A. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. 161-177 (2015).
    11. Yim, S. S., et al. Development of a new platform for secretory production of recombinant proteins in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 113 (1), 163-172 (2015).
    12. Limberg, M. H., et al. Metabolic profile of 1,5-diaminopentane producing Corynebacterium glutamicum under scale-down conditions: Blueprint for robustness to bioreactor inhomogeneities. Biotechnol Bioeng. 114 (3), 560-575 (2016).
    13. Käβ, F. Assessment of robustness against dissolved oxygen/substrate oscillations for C. glutamicum DM1933 in two-compartment bioreactor. Bioprocess Biosyst Eng. 37 (6), 1151-1162 (2014).
    14. Teramoto, H., Watanabe, K., Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. High yield secretion of heterologous proteins in Corynebacterium glutamicum.using its own Tat-type signal sequence. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 677-687 (2011).
    15. Freier, L., Hemmerich, J., Schöler, K., Wiechert, W., Oldiges, M., von Lieres, E. Framework for Kriging-based iterative experimental analysis and design: Optimization of secretory protein production in Corynebacterium glutamicum. Eng Life Sci. 16 (6), 538-549 (2016).
    16. Huber, R., Roth, S., Rahmen, N., Büchs, J. Utilizing high-throughput experimentation to enhance specific productivity of an E. coli. T7 expression system by phosphate limitation. BMC Biotechnol. 11 (1), 22 (2011).
    17. Kottmeier, K., Müller, C., Huber, R., Büchs, J. Increased product formation induced by a directed secondary substrate limitation in a batch Hansenula polymorpha culture. Appl Microbiol Biotechnol. 86 (1), 93-101 (2010).
    18. Kennedy, M. J., Krouse, D. Strategies for improving fermentation medium performance: A review. J Ind Microbiol Biotechnol. 23 (6), 456-475 (1999).
    19. Kleman, G. L., Strohl, W. R. Developments in high cell density and high productivity microbial fermentation. Curr Opin Biotechnol. 5 (2), 180-186 (1994).
    20. Jones, R., Gadd, G. Ionic nutrition of yeast: Physiological mechanisms involved and implications for biotechnology. Enzy Microb Technol. 12 (6), 402-418 (1990).
    21. Zhang, J., Greasham, R. Chemically defined media for commercial fermentations. Appl Microbiol Biotechnol. 51 (4), 407-421 (1999).
    22. Kensy, F., et al. Oxygen transfer phenomena in 48-well microtiter plates: Determination by optical monitoring of sulfite oxidation and verification by real-time measurement during microbial growth. Biotechnol Bioeng. 89 (6), 698-708 (2005).
    23. Hermann, R., Lehmann, M., Büchs, J. Characterization of gas-liquid mass transfer phenomena in microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 81 (2), 178-186 (2002).
    24. Duetz, W. A. Microtiter plates as mini-bioreactors: Miniaturization of fermentation methods. Trends Microbiol. 15 (10), 469-475 (2007).
    25. Funke, M., Diederichs, S., Kensy, F., Müller, C., Büchs, J. The baffled microtiter plate: Increased oxygen transfer and improved online monitoring in small scale fermentations. Biotechnol Bioeng. 103 (6), 1118-1128 (2009).
    26. Lattermann, C., Funke, M., Hansen, S., Diederichs, S., Büchs, J. Cross-section perimeter is a suitable parameter to describe the effects of different baffle geometries in shaken microtiter plates. J Biol Eng. 8, 18 (2014).
    27. Samorski, M., Müller-Newen, G., Büchs, J. Quasi-continuous combined scattered light and fluorescence measurements: A novel measurement technique for shaken microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 92 (1), 61-68 (2005).
    28. Kensy, F., Zang, E., Faulhammer, C., Tan, R. -K., Büchs, J. Validation of a high-throughput fermentation system based on online monitoring of biomass and fluorescence in continuously shaken microtiter plates. Microb Cell Fact. 8 (1), 31 (2009).
    29. Puskeiler, R., Kaufmann, K., Weuster-Botz, D. Development, parallelization, and automation of a gas-inducing milliliter-scale bioreactor for high-throughput bioprocess design (HTBD). Biotechnol Bioeng. 89 (5), 512-523 (2005).
    30. Bareither, R., Pollard, D. A review of advanced small-scale parallel bioreactor technology for accelerated process development: Current state and future need. Biotechnol Prog. 27 (1), 2-14 (2011).
    31. Hortsch, R., Stratmann, A., Weuster-Botz, D. New milliliter-scale stirred tank bioreactors for the cultivation of mycelium forming microorganisms. Biotechnol Bioeng. 106 (3), 443-451 (2010).
    32. Isett, K., George, H., Herber, W., Amanullah, A. Twenty-four-well plate miniature bioreactor high-throughput system: Assessment for microbial cultivations. Biotechnol Bioeng. 98 (5), 1017-1028 (2007).
    33. Motta Dos Santos, L. F., Coutte, F., Ravallec, R., Dhulster, P., Tournier-Couturier, L., Jacques, P. An improvement of surfactin production by B. subtilis BBG131 using design of experiments in microbioreactors and continuous process in bubbleless membrane bioreactor. Bioresour Technol. 218, 944-952 (2016).
    34. Islam, R. S., Tisi, D., Levy, M. S., Lye, G. J. Framework for the Rapid Optimization of Soluble Protein Expression in Escherichia coli Combining Microscale Experiments and Statistical Experimental Design. Biotechnol Prog. 23 (4), 785-793 (2007).
    35. Huber, R., et al. Robo-Lector: A novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb Cell Fact. 8 (1), 42 (2009).
    36. Freier, L., von Lieres, E. Kriging toolKit (KriKit). , Available from: https://github.com/modsim/KriKit (2017).
    37. Kensy, F., Engelbrecht, C., Büchs, J. Scale-up from microtiter plate to laboratory fermenter: evaluation by online monitoring techniques of growth and protein expression in Escherichia coli.and Hansenula polymorpha fermentations. Microb Cell Fact. 8 (1), 68 (2009).
    38. Lu, C., Bentley, W. E., Rao, G. A high-throughput approach to promoter study using green fluorescent protein. Biotechnol Prog. 20 (6), 1634-1640 (2004).
    39. Zanzotto, A., Boccazzi, P., Gorret, N., van Dyk, T. K., Sinskey, A. J., Jensen, K. F. In situ measurement of bioluminescence and fluorescence in an integrated microbioreactor. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 40-47 (2006).
    40. Freier, L., von Lieres, E. Multi-Objective Global Optimization (MOGO): Algorithm and Case Study in Gradient Elution Chromatography. Biotechnol J. , (2016).
    41. Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum.: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J Bacteriol. 175 (17), 5595-5603 (1993).
    42. Weuster-Botz, D., Kelle, R., Frantzen, M., Wandrey, C. Substrate Controlled Fed-Batch Production of L-Lysine with Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Prog. 13 (4), 387-393 (1997).
    43. Meissner, D., Vollstedt, A., van Dijl, J. M., Freudl, R. Comparative analysis of twin-arginine (Tat)-dependent protein secretion of a heterologous model protein (GFP) in three different Gram-positive bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 76 (3), 633-642 (2007).
    44. Morschett, H., Wiechert, W., Oldiges, M. Automation of a Nile red staining assay enables high throughput quantification of microalgal lipid production. Microb Cell Fact. 15, 34 (2016).
    45. Fisher, R. A. The design of experiments. , Oliver & Boyd. Edinburgh. (1935).
    46. Morschett, H., Freier, L., Rohde, J., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. A framework for accelerated phototrophic bioprocess development: Integration of parallelized microscale cultivation, laboratory automation and Kriging-assisted experimental design. Biotechnol Biofuels. 10, 26 (2017).
    47. Le Loir, Y., et al. Protein secretion in Lactococcus lactis: An efficient way to increase the overall heterologous protein production. Microb Cell Fact. 4 (1), 2 (2005).
    48. Anné, J., Vrancken, K., van Mellaert, L., van Impe, J., Bernaerts, K. Protein secretion biotechnology in Gram-positive bacteria with special emphasis on Streptomyces lividans. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1750-1761 (2014).
    49. Gupta, S. K., Shukla, P. Advanced technologies for improved expression of recombinant proteins in bacteria: perspectives and applications. Crit Rev Biotechnol. 36 (6), 1089-1098 (2016).
    50. Fu, L. L., Xu, Z. R., Li, W. F., Shuai, J. B., Lu, P., Hu, C. X. Protein secretion pathways in Bacillus subtilis: implication for optimization of heterologous protein secretion. Biotechnol Adv. 25 (1), 1-12 (2007).
    51. Yoon, S., Kim, S., Kim, J. Secretory Production of Recombinant Proteins in Escherichia coli. Rec Pat Biotechnol. 4 (1), 23-29 (2010).
    52. Hemmerich, J., et al. Comprehensive clone screening and evaluation of fed-batch strategies in a microbioreactor and lab scale stirred tank bioreactor system: application on Pichia pastoris producing Rhizopus oryzae lipase. Microb Cell Fact. 13 (1), 36 (2014).
    53. Glazyrina, J., Krause, M., Junne, S., Glauche, F., Strom, D., Neubauer, P. Glucose-limited high cell density cultivations from small to pilot plant scale using an enzyme-controlled glucose delivery system. New Biotechnol. 29 (2), 235-242 (2012).
    54. Gernaey, K. V., et al. Monitoring and control of microbioreactors: An expert opinion on development needs. Biotechnol J. 7 (10), 1308-1314 (2012).
    55. Rahmen, N., Fulton, A., Ihling, N., Magni, M., Jaeger, K. -E., Büchs, J. Exchange of single amino acids at different positions of a recombinant protein affects metabolic burden in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 14, 10 (2015).
    56. Rahmen, N., et al. A particular silent codon exchange in a recombinant gene greatly influences host cell metabolic activity. Microb Cell Fact. 14, 156 (2015).
    57. Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in E. coli. J Vis Exp. (89), e51464 (2014).
    58. Scheidle, M., et al. High-throughput screening of Hansenula polymorpha clones in the batch compared with the controlled-release fed-batch mode on a small scale. FEMS Yeast Res. 10 (1), 83-92 (2010).
    59. Baumann, P., Bluthardt, N., Renner, S., Burghardt, H., Osberghaus, A., Hubbuch, J. Integrated development of up- and downstream processes supported by the Cherry-Tag™ for real-time tracking of stability and solubility of proteins. J Biotechnol. 200, 27-37 (2015).
    60. Baumann, P., Hahn, T., Hubbuch, J. High-throughput micro-scale cultivations and chromatography modeling: Powerful tools for integrated process development. Biotechnol Bioeng. 112 (10), 2123-2133 (2015).

    Tags

    Bioteknologi problemet 130 Design av eksperimenter kriging lab automatisering flytende håndtering robot være ferdig innen plate microbioreactor Corynebacterium glutamicum heterologous protein sekresjon ernæring medier optimalisering
    Generisk protokoll for optimalisering av Heterologous Protein produksjonen ved hjelp av automatisert Microbioreactor teknologi
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, … More

    Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (130), e56234, doi:10.3791/56234 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter