Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generiskt protokoll för optimering av heterologa proteinproduktion med hjälp av automatiserad Microbioreactor teknik

Published: December 15, 2017 doi: 10.3791/56234
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2,4
1IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Jülich, 2Research Center Jülich, Bioeconomy Science Center (BioSC), 3Computational Systems Biotechnology (AVT.CSB), RWTH Aachen University, 4Institute for Biotechnology, RWTH Aachen University
* These authors contributed equally

Summary

Detta manuskript beskrivs en allmän metod för skräddarsydda design av mikrobiell odling medier. Detta är aktiverat genom en iterativ arbetsflöde som kombinerar Kriging-baserade experimentell design och microbioreactor teknik för tillräcklig odling genomströmning, vilket stöds av lab robotics att öka tillförlitlighet och snabbhet i vätskehantering media beredning.

Abstract

En kärnverksamhet i industriell bioteknik med mikrobiell produktion cell fabriker är iterativa processen av stam ingenjörskonst och optimering av bioprocess villkor. En viktig aspekt är förbättring av odling medium att ge en optimal miljö för mikrobiell bildandet av produkten av intresse. Det är väl accepterat att media sammansättning kan dramatiskt påverka bioprocess prestanda. Nutrition medium optimering är känt att förbättra rekombinant protein produktion med mikrobiella system och således, detta är en givande steg i bioprocess utveckling. Dock är mycket ofta standardmedia recept hämtade från litteraturen, eftersom skräddarsydda design av odling medium är en mödosam uppgift som kräver microbioreactor teknik för tillräcklig odling genomströmning, snabb produkt analytics, samt stöd av lab robotics aktivera tillförlitlighet i vätskehantering steg. Dessutom krävs avancerade matematiska metoder för att rationellt analysera mätdata och effektivt designa parallella experiment såsom för att uppnå optimal informationsinnehåll.

Generisk beskaffenhet presenteras protokollet möjliggör enkel anpassning till olika labbutrustning, andra uttryck värdar och målproteiner av intresse, liksom ytterligare bioprocess parametrar. Dessutom kan andra optimering mål som protein produktionstakt, viss avkastning eller produktkvalitet vara utvalda för att passa omfattningen av andra optimering studier. Verktygslådan för tillämpad Kriging (KriKit) är ett generellt verktyg för Design av experiment (DOE) som bidrar till förbättrad holistisk bioprocess optimering. Det stöder också flera mål optimering som kan vara viktiga i att optimera både uppströms och nedströms processer.

Introduction

Modern rekombinant genteknik möjliggör en omfattande användning av tekniska enzymer för olika applikationer i läkemedelsindustrin, djurfoder, organisk kemi, och livsmedelsbearbetning1,2,3. Produktionen av tekniska enzymer i stora kvantiteter är ett stort ämne för industriell bioteknik och optimerad rekombinant proteinproduktion, och både stam och bioprocess teknik behövs. För generationen av effektivt konstruerade produktion stammar, det finns olika genetiska bibliotek, t.ex., för balanserad gene expression4 eller ökad utsöndring effektivitet5.

Corynebacterium glutamicum är en stor producent av aminosyror på industriell skala6,7 och utgör en attraktiv icke-konventionella uttryck värd för sekretoriska produktion av rekombinanta proteiner8 ,9. Både allmänna sekretoriska (Sec) och twin-arginin translokation (Tat) väg finns i C. glutamicum och tillämpades för rekombinant protein sekretion10. Lång erfarenhet av bioprocess engineering angående aminosyra produktion i industriell skala, liksom förmågan att utsöndra proteiner till redov belopp11 och stor robusthet om bioprocess inhomogeneities Funna i stor skala odlingar12,13, göra C. glutamicum en lovande organism som plattform för sekretoriska produktionen av heterologa proteiner i industriell skala.

Nutrition medium optimering är känt att förbättra rekombinant proteinproduktion med mikrobiella system14,15,16,17 och följaktligen justeringen av medium sammansättningen är ett givande steg i bioprocess utveckling med avseende på optimal produktivitet18,19,20,21. Intensiv forskning om tillämpningen av mikrotiter plattor (Mbps) för mikrobiell odling22,23,24 banade väg för utveckling och design av Mbps för mikrobiell odling25 ,26 och utvecklingen av MTP-baserade microbioreactor (MBR) system med online-övervakning och kontroll27,28. MBRs möjliggör en betydande ökning av experimentell odling genomströmning. Dessutom finns MBR system som härrör från andra typer av bioreaktorer, t.ex., bubbla kolumner eller stirred tank reaktorer, tillgängliga för mikrobiell bioprocess optimering29,30,31, 32.

I allmänhet gynnas optimering studier av ökad experimentella genomströmning, som blir ännu mer kraftfull i kombination med DOE metoder, såsom att bedöma samspelet mellan design variabler eller minska högdimensionella Sök utrymmen. Den kombinerade användningen av MBR system, lab automation och DOE har följaktligen visat sig vara en kraftfull metod i bioteknik8,16,33,34,35.

Ett protokoll för medier optimering presenteras kombinerar state-of-the-art lab automation, MBR teknik med online processövervakning och Kriging-baserade data analys/experimentell design. Kriging metoden är implementerad i en MATLAB verktygslåda (”KriKit”) som kan laddas ner och användas utan kostnad36. Som exempel på tillämpning exempel visas maximering av sekretoriska grönt fluorescerande protein (GFP) produktion med C. glutamicum genom att optimera sammansättningen av CgXII minimalmedium. GFP titer valdes som optimering målet eftersom det kan kvantifieras enkelt och det är allmänt tillämpas som modell protein för studier på MBR system37,38,39.

Presenterade ramen är uppdelad i fyra steg, som illustreras i figur 1. Stegen indikeras av rutan bildrutor och motsvarar delar av protokollet. Det första steget (figur 1A) är att definiera projektmålen och bestämma de nödvändiga metoderna. Kombinationen av DOE metoder, MBR teknik och lab automation möjliggör en ökad experimentella genomströmning som kräver kraftfull databehandling. Det andra steget (figur 1B) syftar till att identifiera känsliga design variabler (dvsmedelstora komponenter) med hög påverkan på syftet optimering. Detta leder till ett minskat antal design variabler av intresse. Det tredje steget (figur 1 c) består av en iterativ optimering för en mer detaljerad undersökning av det funktionella sambandet mellan variablerna återstående design och målet av intresse. Metoden med Kriging används för att förutsäga den experimentella resultaten på ouppmätta platser och använder successivt utökade datauppsättningen. Den iterativa cykeln stannar så snart Kriging modellen förutspår en optimal eller platå med tillräcklig noggrannhet. I det fjärde steget (figur 1 d), börjar med en ytterligare känslighetsanalys runt den identifiera optimaln verifieras resultatet. Om inledningsvis okänsliga komponenter befinns vara okänsliga också i regionen optimalt, är det rimligt att anta att detta gäller under det iterativa optimering förfarandet i det tredje steget. Efteråt, det rekommenderas att kontrollera optimering resultatet av tillämpningen av ortogonala metoder, som en aktivitet assay eller SDS-Page.

Generisk beskaffenhet presenteras protokollet möjliggör enkel anpassning till olika labbutrustning, andra uttryck värdar och målproteiner för val, liksom ytterligare bioprocess variabler som pH värde eller odling temperatur.Dessutom kan andra optimering mål som protein produktionstakt, viss avkastning eller produktkvalitet vara utvalda för att passa omfattningen av andra optimering studier.

Figure 1
Figur 1 : Arbetsflöde för optimering studie. Rutorna fyra ram motsvarar delar av protokollet, ”att bli gravid den studien och Definition av metoder” (avsnitt 1), ”känslighetsanalys” (avsnitt 2), ”iterativ optimering” (avsnitt 3) och ”validering” (avsnitt 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

1. att utforma studier och Definition av metoder (figur 1: del A)

Obs: Definition av målet optimering: en dags kurs produkt bildas behövs eller är endast en begränsad tidsintervall eller ens en fast tidpunkt relevanta? Också överväga potentiella frågor såsom stabilitet, ansträngning av analytiska kvantifieringsgränsen, eller odling tid. Som ett alternativ till slutliga protein titer, kunde andra mål betraktas såsom biomassa eller odling tid. Biomassa reflekteras av biomassa specifik produkt avkastning, medan odling tid speglas av rymd-tid-avkastning. (Minimum) produktkvalitet kan också vara ett mål. Flera mål optimering kan krävas i vissa situationer, som diskuteras på andra ställen40. I denna studie valdes GFP titer efter 17 h odling som syftet optimering. GFP fluorescens kan följas online med utrustningen som finns i denna studie, vilket förenklar att bestämma koncentrationen av proteinet modell.
Obs: Definition av parametrar ska optimeras: CgXII medium består av 16 enskilda komponenter41 och undersöka alla dessa i en full faktoriell design skulle resultera i 216 ≈ 65.000 experiment. Sök utrymmet måste därför sänkas på grundval av rationella och erfarenhet-driven. Valet av media-komponenter för optimering kan stödjas av tillgängliga sakkunskap eller litteraturdata.

  1. Besluta vilka medium komponent koncentrationerna bör inte varieras. För optimering av CgXII medium valdes följande komponenter skall fastställas:
    1. Glukos är fast på 10 g/L. Denna optimering är trivialt eftersom mer glukos ger mer GFP utsöndrar biomassa. Syftet var att avslöja icke-intuitiv medium effekter.
    2. 3-(N-morpholino) propanesulfonic syra (moppar) är fast på 42 g/L. Detta ger tillräcklig buffertkapacitet under batch odling och metaboliseras inte.
      Obs: Tillägg av moppar på denna slutliga koncentration garanterar ett startvärde med pH 7, även med de olika volymerna av andra lager lösningar till, som inte är vid pH 7. För att utesluta eventuella avvikelser i Start pH-värden, bör dock pH kontrolleras för medelstora kompositioner där alla stamlösningar läggs på sin högsta och lägsta volymer.
    3. KH2PO4 och K2HPO4 är fasta på 1 g/L vardera. Dessa ger också buffertkapacitet och fungera som en fosfat källa.
    4. Urea är fast på 5 g/L. Detta fungerar som en basal kvävetillförseln och pH-stabiliserande agent, tillräckliga för att förhindra N-begränsning.
    5. Biotin är fast på 0,2 mg/L. C. glutamicum ATCC13032 är auxotrophic för biotin.
    6. Protocatechuic syra (PCA) är fastställd till 30 mg/L. Den fungerar som en järnkelatkomplexbildare.
    7. Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) har fastställts till 100 µM. Det inducerar uttryck av gfp -genen.
  2. Välj höga och låga koncentrationer av media-komponenter för inledande känslighet filmvisningar. Här valdes komponenter från tre typiska grupper av mediekomponenter. De undersökta låga och höga koncentrationerna för varje komponent är:
    1. Standard kväve Källa: (NH4)2SO4 (8-32 g/L); variationen av kvävetillförseln rapporterades vara lovande för optimering av biomassa-specifika GFP signalen8.
    2. Spårelement: FeSO4 ∙ 7 H2O (4-16 mg/L), MnSO4 ∙ H2O (4-16 mg/L), ZnSO4 ∙ 7 H2O (0,4-1,6 mg/L), CuSO4 ∙ 5 H2O (125-501 µg/L), NiCl2 ∙ 6 H2O () 8-32 µg/L) och CoCl2 ∙ 6 H2O (52-208 µg/L). Sammansättningen av spårämnen ärvs från den första publiceringen av CgXII medium41. Dessutom Na2MoO4 ∙ H2O (26-104 µg/L) och H3BO3 (20-80 µg/L) ingick som spårelement, som de används i en publicerad variant av CgXII medium42.
    3. Makro element: MgSO4 ∙ 7 H2O (0,2 – 0,4 g/L), CaCl2 ∙ 2 H2O (5.3-21,2 mg/L). Dessa hittades bland andra divalenta katjoner att förbättra sekretoriska GFP produktion i en annan studie14, där C. glutamicum stam R användes med en annan medelstor bakgrund och CgR0949 Tat signal peptiden.
  3. Beredning av material och definition förfaranden
    Obs: Det rekommenderas att definiera och fastställa de experimentella metoderna på en detaljerad nivå. Denna standardisering säkerställer att olika resultat kan spåras tillbaka till inneboende biologisk variation eller olika medium kompositioner.
    Obs: Media lager lösningar: förbereda enskilda lager lösningar för alla undersökta mediekomponenter. Förbereda högkoncentrerad bestånd för utspädning av olika volymer för alla komponenter. Detta innebär att detta efter kombinerar alla lager lösningar på högsta volym enligt design planen, inte får överstiga den slutliga odling volym, jfr punkt ”Generation av medelstora stamlösning pipettering lista” steg 1.3.3. Om tillägg av en starkt koncentrerad lösning resulterar i en mycket låg tillägg volym, t.ex. < 1/100th av slutliga odling volymen, späd stamlösningen med detta. Till exempel i denna studie definierades en pipettering volym på mindre än 10 µL för att vara omöjligt. Spårämnet lösningar är oftast koncentrerad så högt som 1,000fold med avseende på standard slutkoncentration i mediet. Det är fördelaktigt att koncentrera mediekomponenter som multipler (X-faldigt) när det gäller koncentrationer i referens receptet. På så sätt undviks omöjligt pipettering av volymer av fraktionerad decimaler. I det kompletterande dokumentet ges detaljerade recept för alla stamlösningar av CgXII medium.
    1. Fungerande cell bank (WCB)
      Obs: För varje tillväxt experiment används en WCB alikvotens. Om fler portioner behövs, Använd 100 mL hjärnan hjärtat infusion (BHI) medium i 1 000 mL förbryllad skaka kolvarna eller Inokulera flera skaka kolvar, som sammanförs före tillsats av glycerol lösning.
      1. Förbereda enda kolonier av rekombinant uttryck stam C. glutamicum pCGPhoDBs- GFP43 på agarplattor (37 g/L BHI pulver, 20 g/L agar, 25 mg/L kanamycin). Plätering material kan antingen komma från färska omvandling eller från en nedfrysta alikvot.
Inkubera vid 30 ° C tills uppkomsten av enstaka kolonier. Detta tar oftast en till två dagar.
  • Inokulera en shaker kolv kultur (50 mL BHI medium med 500 mL förbryllad kolv, 25 mm skakar diameter, 250 rpm, 25 mg/L kanamycin, 30 ° C) med kolonin material och inkubera över natten (ca 16 h).
  • Kombinera en volym av resulterande cellsuspension med en volym av steril glycerol lösning 500 g/L och fördela i 2 mL alikvoter i sterila frysförvaring injektionsflaskor. Förvaras vid-80 ° C.
  • MBR odling protokoll
    Obs: För sysselsatta BioLector MBR-systemet i denna studie, spritt ljus (biomassa) och god Jordbrukarsed fluorescens är intensitet mätningar, som behöver vissa vinst tilldelats ett värde. Ju högre vinst, ju högre den optiska signalen förstärks; Detta är också varför spritt ljus och fluorescens mäts i godtyckliga enheter (a.u.). Bestämma lämplig vinst värdena för biomassa och god Jordbrukarsed upptäckt i preliminära experiment, tillsammans med lämpliga skakar frekvens och fylla volym för att undvika syre begränsning vid högre biomassa koncentrationer under senare processteg. De sysselsatta odling villkor (”Flowerplates”, dvs, blomma-formade 48-väl Mbps, skakar frekvensen av 1200 rpm, fyllning volym på 1000 µL, 10 g/L glukos som huvudsakliga kolkälla) säkerställas syre obegränsad odlingar. För maximala syre överföringshastigheter som härrör från andra kombinationer av fylla volymer och skakar frekvenser i blomma-formade 48-väl Mbps, finns datablad från leverantören. Dessutom kan tillväxt defekter av enskilda kulturer uppstå på grund av låga mängder sekundär substrat (t.ex., kväve, spårämnen). Kontrollera därför biomassa koncentrationerna i slutet av odlingar. I denna studie observerades ingen sådan tillväxt.
    1. Definiera odling protokollet för MBR-systemet (”BioLector”) enligt följande:
    2. Filterset 1: Biomassa, få 14. Filterset 2: pH, vinst är förinställda. Filterset 3: pO2, vinst är förinställda. 4: GFP, få 80.
    3. Skakar frekvens: 1200 rpm.
    4. Temperatur: 30 ° C.
    5. Cykeltid: 15 min.
    6. Experiment tid: manual (odling inte kommer att stoppas automatiskt).
  • Generation av medelstora stamlösning pipettering lista
    Obs: Nästan alla vätskehanterande robotsystem är kapabel att läsa pipettering åtgärder från externa filer. Minimal information som behövs är egentligen den överföring volym och position av reagens källa samt destinationen för varje representerad av labware ställning robotic däck och en specifik hålrum i labware. Olika syntaxer för olika vätskehanterande system måste dock beaktas. Figur 2 visar ett exempel filstruktur för sysselsatta pipettering systemet i denna studie.
    1. Fyra typer av stamlösningar är pipetteras i varje odling väl:
      1. Lagerför lösningar av media-komponenter som är varierade (”Variation bestånd”).
      2. Vatten för att kompensera för olika kumulativa volymer av ovan bestånd.
      3. En stamlösning (”Övriga lager”) som innehåller alla komponenter som korrigeras. Denna stamlösning kan bestå från lager som innehåller de olika komponenter som är, t.ex., lagras vid olika temperaturer eller steriliseras genom olika metoder.
      4. Inokulatet, som bör läggas till som sista komponenten och sätta på arbetsbord strax före tillägg att undvika reglerandet av cellerna.
    2. Per odling, beräkna volymer överförs för alla mediekomponenter enligt:
      Equation 1
      Volymen som ska läggas för vissa Bestånd som Variation kanske noll, dvsnär denna specifika komponent utelämnas.
    3. Revidera alla beräknade volymer Vjag för lämplig nummer. Pipettering volym steg i volym steg bör inte vara för liten. Om nödvändigt, justera koncentrationerna av Variation bestånd. Till exempel minimal pipettering volymen här definierades som 10 µL och minimal ökningsvärdet definierades som 5 µL. I allmänhet bör dessa volymer definieras utifrån experimentellt bestämd precision och noggrannhet för den begagnade vätskehantering station15,44.
    4. Beräkna volymen av Resten lager som innehåller de fasta komponenterna för alla brunnar enligt följande:
      Equation 2
      där den högsta kumulativa volymen Variation lager Equation 3 används. Följaktligen, beräkna krävs koncentrationerna av de fasta komponenterna i Resten lager enligt följande:
      Equation 4
      Förbered Resten lager med detta.
    5. Per odling, beräkna mängden vatten som ska läggas till enligt följande:
      Equation 5
    6. Per odling väl, lista alla volymer som ska läggas till i följande ordning av tillägg: VH2O, VRestStock, Vjag, VInok. Formatera listan pipettering enligt specifikationerna i den vätskehantering station, så visas ett exempel i figur 2.
  • Utsäde kultur, automatiserade media förberedelse och start av huvudsakliga kultur
    1. Skapa ett protokoll för vätskehantering robot. Se figur 3 och figur 4 för ett exempel protokoll för ett ”Janus” genomfört i motsvarande ”WinPREP” programvara. Protokollet bör följande aspekter:
      1. Inkludera en tillräcklig runtime av sterila bostäder innan media förberedelse.
      2. Inkludera en inledande överdriven rengöring och tvättning av alla pipettering tips och slangar.
      3. Välja lämpliga labware behållare för stamlösningar. Här, är djupt plattor med 12 kolumner lämpliga för förvaring av Variation bestånd, eftersom alla åtta pipettering tips kan doppa i en parallell arrangemang i väl kolumner. Detta påskyndar kraftigt media förberedelse. Om 15 mL eller 50 mL reagensrör används som reservoarer, kan endast ett pipettering tips doppa i det på en gång.
    • För andra bestånd som vatten och Resten lageranvänds 100 mL dalar, som dessa lager lösningar kräver högre volymer totalt.
  • Tillhandahålla en tillräcklig total volym för varje stamlösning att kompensera avfallsvolymer, höjd pipettering förskjutningar, etc.
  • Infoga en användare fråga innan steget Inympning, se till att detta steg genomförs omedelbart före utsäde kultur.
  • Förbereda alla lager lösningar i ett sterilt sätt och butiken fram till användning, i lämplig behållare, t.ex., steril 15 mL och 50 mL provrör.
  • Sterilisera de djupt plattorna för stamlösningen lagring på ett arbetsbord, t.ex., genom att torka med 70% etanol och efterföljande torkning i en LAF.
  • Starta den utsäde kulturen genom ympning 50 mL BHI medium innehållande 25 mg/L kanamycin med en alikvot från WCB. Innan MBR odlingen, förbereda färska, vital inokulum från exponentiellt växande utsäde kulturer i en tillräcklig mängd.
  • Placera alla nödvändiga labware på den robotic arbetsbord och häll stamlösningar i den motsvarande labware.
  • Starta robotic arbetsflödet för media förberedelse, så att det sista steget (ympning), nås i tid med starten av utsäde kultur. Den totala körningstiden för robotic arbetsflödet måste utvärderas tidigare. Här var den totala runtime cirka 1,5 h.
  • Prov den utsäde kulturen efter ca 2 h, sedan varje timme, att övervaka tillväxten av optisk densitet (OD600). Efter ungefär 5 h, kulturen når 3-4 OD600 och används för att vaccinera de huvudsakliga kulturerna.
  • Placera den utsäde kulturen på den flytande handler arbetsbord och fortsätta media förberedelse protokollet. Försegla odling MTP efter inympningen.
  • Placera den förseglade odlingen MTP i BioLector enheten och börja fördefinierad odling protokollet.
  • Kassera de återstående stamlösningar, enligt biosäkerhet föreskrifter om det behövs, och utsäde kulturen från den robotic arbetsbord. Rengör den re-usable labware och starta protokollet flytande handler sanering.
  • Produkten kvantifiering och förbehandling av rådata för analysen.
    1. Stoppa den huvudsakliga kulturen efter en 17 h runtime.
    2. Överföra mätdata från BioLector MBR enhet till den anslutna datorn med hjälp av programpaketet BioLection enligt tillverkarens bruksanvisning.
    3. Användning av ”datahantering → omvandla Data” funktion av programpaketet ”BioLection” som åtföljer MBR systemet för att konvertera raw-data-fil till ett kalkylbladsformat för enkel åtkomst. Kopiera GFP signal data för alla odling brunnar från kolumnen tidsstämpel närmast 17 h. identifiera GFP signaler från referens odling brunnarna och genomsnittliga. Normalisera alla återstående GFP signal av den genomsnittliga referenssignal.
    4. Kvantifiera GFP titern med ytterligare metoder (vid behov)
      1. Överföra cellsuspensioner från alla odling brunnar i företiketterade reaktionsrören och skaffa cellfria supernatanten efter centrifugering i 10 min vid maximal hastighet med hjälp av en bänkmonterade centrifug.
      2. Överföra 200 µL av varje cellfria supernatanten till en svart 96 brunnar MTP med transparent botten, och läsa GFP specifika fluorescensen på 488/520 nm med en lämplig microplate reader. Normalisera GFP signalen från alla brunnar med genomsnittliga signal från referens odlingar, som i steg 1.5.3.
        Obs: Absolut GFP fluorescens signalerna kan inte jämföras för olika mätutrustning. Därför tjäna de 5 referensstammar från alla huvudsakliga odlingar som intern standard. Förbättring av GFP titer kan uttryckas i förhållande till den interna standarden. Detta möjliggör jämförelser av resultat från olika experiment och olika metoder för kvantifiering av GFP (se nästa två steg).
      3. Bestämma proteinhalten i cellfria supernatanterna med standardprotokoll, t.ex., Bradford eller BCA assay. I kombination med resultaten från steg 2 är bestämning av en protein specifika GFP titer möjligt.
        Obs: Efter fluorescens mätning, använda provet direkt från denna mikroplattan. Användning av flerkanaligt pipetter underlättar avsevärt de nödvändiga stegen för vätskehantering.
      4. Utföra en SDS-Page visualisering av cellfria supernatanterna efter standardprotokoll för att verifiera att de flesta av öka proteininnehållet är på grund av ökad GFP utsöndring.
        Obs: SDS-Page är mer arbetskrävande än de tidigare nämnda metoderna, särskilt med höga prov belastning. För kontrolländamål är det ofta tillräckligt att köra SDS-sidor av cellfria supernatanterna från referens medellång och slutliga optimerad medelstora odlingar15.

    • 2. känslighetsanalys (figur 1: del B).

    Obs: Syftet med denna del är att identifiera de viktiga faktorer som har en betydande inverkan på målet.

    1. Välja en initial koncentration utbud av mediekomponenter. Den referens medium sammansättningen bör ligga inuti de valda koncentrationsintervall.
    2. Välja en lämplig DOE. Sådana mönster kan hittas i litteraturen, t.ex., i NIST/SEMATECH e-handbok av statistiska metoder (finns på www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm). Den valda designen beror på antal mediekomponenter sevärdheter (här, 11) och antalet utförda experiment (här, 32). I exemplet med viss valdes design ”2IV11-6” som resulterar i 32 experiment och tillåter uppskattning av effekten att öka koncentrationen av en av de elva komponenterna på målet av intresse. För att vara mer specifik, är de huvudsakliga effekterna inte ihop med parvisa faktor interaktioner. De kan förväxlas med högre ordning interaktioner som är dock troligen inte betydande.
    3. Använda återstående brunnarna (här, 16) för att utföra flera replikat med referens medlet att bedöma reproducerbarheten för processen. Replikat bör fördelas lika över plattan att upptäcka positionella effekter. Medelvärdet av uppmätt utdata från referens experimenten används för normalisering. Det vill säga divideras varje uppmätt utgång av känslighetsanalysen med medelvärdet av referens utdata.
    4. Beräkna huvudsakligen och om möjligt de kombinatoriska effekterna med hjälp av lämpliga statistik programvara. Klassisk design av experiment är baserad på en polynom tillnärmning45. Exempelvis kan den MATLAB funktionen mvregress användas för skattning av polynom koefficienterna.
    Funktionen mvregress är en del av den statistik och maskininlärning verktygslåda.
  • Identifiera de relevanta effekterna av olika media-komponenter på syftet med ett t-test. I exemplet, NH4+ har en betydande negativ effekt och Ca2 + och Mg2 + Visa starkaste positiva effekter (figur 5). Eftersom god Jordbrukarsed signal var normaliserade, koefficienterna som representerar den genomsnittliga relativa förändringen i GFP-signalen när ökad koncentration av den särskilda komponenten från dess centrum värde, Equation 7 , till sitt maximala värde.
  • Fasta komponenter utan en relevant effekt är deras referensvärdet under optimeringen.

    • 3. iterativ optimering (figur 1: del C)

    Obs: MATLAB verktyget KriKit användes för tolkning och statistiska data analys36. KriKit tillåter användaren att bygga en datadriven Kriging modell. Kriging modellen förutspår det funktionella sambandet mellan mediekomponenter och målet. Det ger också information om prognos osäkerheten. Hög osäkerhet anger bullriga uppgifter eller otillräckliga Datadensitet.

    1. DOE
      Obs: Nya experiment är iterativt utformade, baserat på resultaten av den föregående körningen.
      1. I den första upprepningen, utforma nya experiment för detaljerad utredning av identifierade mediekomponenter sevärdheter. Experimentella resultat från avsnitt 2 kan inte överföras till den iterativa optimeringen (avsnitt 3), eftersom koncentrationerna av komponenter utan relevant effekt är nu fast respektive referensvärdet. Experiment från känslighetsanalysen och iterativ optimering är därför inte jämförbara.
      2. Annars följ det system som illustreras i figur 1, frame ”iterativ optimering”. Om den optimala potentialen ligger inuti det definierat koncentrationsintervallet, är nya experiment utformade med den förväntade förbättring40,46. Experimentell design baserat på den förväntade förbättringen är integrerad i verktygslådan KriKit. Om optimaln ligger på gränsen, expandera koncentrationsintervallet.
    2. Utföra experiment på designade prov punkter enligt experimentella metoder definieras i avsnitt 2.
    3. Statistisk analys
      1. Konstruera en Kriging modell med hjälp av kombinerade data från alla iterationer, inklusive nuvarande.
      2. Undersöka modell utdata genom visualisering med omfattande verktyg för KriKit (2/3D interpolation, film analys, screening plot, etc.).
    4. Om en optimal yta uppskattas med tillräcklig noggrannhet, sluta optimering. Om så inte är fallet, Fortsätt med steg 3.1.
      Obs: Figur 6 illustrerar den iterativa optimeringen för test studien. Koncentrationsintervallet utökades successivt tills en platå hittades (iteration 1-6). Den sjunde iterationen användes för att utforska gränserna mer i detalj.

    4. kontroll av resultaten (figur 1: del D)

    Obs: Efter avslutad iterativ optimering, utgångsantagandena måste kontrolleras för giltigheten.

    1. Gör om känslighetsanalys (avsnitt 2) för optimal medium sammansättning. Koncentrationerna av komponenter som undersöks i figur 1 (del C) är fasta till deras optimala värden. Koncentrationer av andra komponenter är varierade enligt en lämplig DOE.
      Obs: Liknande resultat i båda visningarna indikerar att halter av de undersökta komponenterna inte förändrar effekten av andra komponenter. Om screeningen visar signifikanta skillnader till resultaten från del B, komponenter med en ändrad effekt bör läggas till i poolen med undersökta komponenter och del C bör upprepas.
    2. När det gäller indirekt mätning (t.ex., fluorescens som indikator för produkten koncentration), tillämpa ortogonal mätning metoder (t.ex., aktivitet assay, Bradford eller BCA protein kvantifiering, SDS sida) att bekräfta ändringen i målet av intresse genom att jämföra resultat från referens medium och optimerad medelstora15.

    Representative Results

    Introducerade protokollet tillämpades för att maximera antikroppnivåns på utsöndrade GFP. Särskilt god Jordbrukarsed titern efter 17 h odling valdes som syftet optimering. Online fluorescens detektion av GFP tillåtna enkel produkt kvantifiering. Normalisering av GFP signal med data från en referens-odling är dock nödvändigt att säkerställa reproducerbarhet och resultaten kan jämföras. Ett första urval av mediekomponenter utfördes på rationell grund som beskrivs i avsnitt 1. Experimenten utfördes enligt anvisningarna i avsnitt 1: parametrarna för de våta labb förfaranden definieras för hela studien säkerställa samstämmighet och reproducerbarheten av resultaten.

    Som beskrivs i avsnitt 2, utfördes en inledande screening för att identifiera relevanta komponenter visar en betydande inverkan på optimering målet för ytterligare och mer detaljerade studier. MTP-baserade MBR systemet tillåter 48 experiment kan utföras parallellt. 11-6 fraktionerad tar hänsyn till det maximala antalet möjliga parallella experiment på en MTP (48) och det totala antalet media komponenter (11) gör det 2IVoch utforma ett lämpligt val. Denna experimentella design består av 32 experiment och tillåter skattning av den huvudsakliga effekten för samtliga undersökta media komponenter. Återstående odling brunnarna (16) användes för flera replikat av experiment med referens mediet för att bedöma reproducerbarheten och positionella effekter. Det vill säga varje experiment utförs en gång (inget replikat), utom referens experimentet (fem replikat).

    Tabell 1 sammanfattar resultaten av screening analysen. I den ansedda koncentrationsintervall visade varierande majoriteten av mediekomponenter inte en märkbar effekt på målet. Komponenten NH4+ visar starkt negativt, medan Ca2 + och Mg2 + visar den starkaste positiva tendensen. Effekten av Mg2 + för den aktuella koncentrationsintervall är inte betydande men kan vara för en bredare koncentration. Det beslutades därför att utelämna NH4+ från medlet och att undersöka effekten av Ca2 + och Mg2 + i ytterligare experiment.

    Avsnitt 3 beskriver hur iterativ optimering som används för att maximera GFP fluorescens signalen samtidigt varierande koncentrationerna av Ca2 + och Mg2 +. I iteration 1 testades hypotesen att NH4+ kan utelämnas. Koncentrationsintervall för Ca2 + och Mg2 + antogs av screening-analysen. Den lägsta koncentrationen av NH4+ sattes till noll och maximikoncentrationer antogs från screening experiment. I de följande experiment distribuerades komponent koncentrationerna över ett 3 x 3 x 3 rutnät inuti den definierat koncentrationsintervall, vilket resulterar i 27 experiment. Under alla odlingar, det ingick fem replikat av referens medium, som tjänade som intern standard och att säkerställa att inga positionella effekter över MTP uppstått. För de återstående 16 brunnarna distribuerades slumpmässigt koncentrationerna av NH4+, Ca2 +och Mg2 + släpper de givna intervall.

    Figur 5 A visualiserar resultaten av de första iterationerna. Axeletiketterna avse de komponent-koncentrationer som används i det ursprungliga referens mediet, anges av x Ref. De blå ytorna representera de Kriging interpolationer som beräknades med hjälp av KriKit programvara. Varje yta är associerade med en relativ koncentrationsnivå för NH4+ (mörkblå: 0 x Ref, rutig: 1 x Ref, ljusblå: 2 x Ref). Denna visuella representation avslöjar att det är gynnsamt att utelämna NH4+. Interpolation ytor visar också de positiva effekterna av både Mg2 + och Ca2 +, alla flygplan stiger med ökande koncentrationer.

    Baserat på resultaten av iteration 1, beslutades det att expandera den koncentration utbud av Ca2 + och Mg2 + genom att fördubbla de maximala koncentrationerna och skiftande experimentell design-fönstret till det övre högra hörnet, se figur 5 B. inuti detta intervall, koncentrationerna distribuerades på ett 6 x 6-rutnät. Detta säkerställer en jämn fördelning över intervallet full koncentration, vilket leder till optimal Kriging interpolation resultat. Figur 5 B visar Kriging interpolation tomten baserat på kombinerade data mäts i båda iterationer (röda prickar och gula rutor). För båda, Ca2 + och Mg2 +, fortsätter den positiva effekten av ökande deras koncentrationer. Följaktligen proceduren upprepades genom att fördubbla den maximala koncentrationen och således fönstret experimentell design flyttades till utforska gränserna för det övre högra hörnet.

    Figur 6 A ger en översikt över återstående optimering förfarandet. Analysen av insamlade data set upp till iteration 3 visade en begränsning av den positiva effekten av Mg2 +, dvs, en optimal koncentration utbud av Mg2 + identifierades. Det beslutades därför att ytterligare utöka koncentrationsintervall endast för Ca2 + (iteration 4). Denna procedur upprepades två gånger (iteration 5 och 6) tills en mättnad av GFP signal hittades. Denna mättnad förklaras av utfällning av Ca-salter för tillämpad koncentrationerna av Ca2 +, som inte är tillgängliga för cellerna.

    Som experimentella resultat är alltid oroad över buller, den resulterande Kriging interpolation visas oregelbundna och okulärbesiktning kan leda till falska avslutningar. Dock kan det optimala koncentrationen utbudet av media-komponenter för mättade GFP signalen identifieras tillförlitligt med statistiska z -test, som genomförs också i KriKit. Z -testet använder direkt inneboende statistiska uppgifter från Kriging metod, dvs., förutsägelse värden och förutsägelse osäkerheter. Figur 6 B visar identifierade platån, som beslutsamt och visualiseras med hjälp av verktygslådan KriKit.KriKit verktygslådan är fritt tillgängliga36 och kommer med en utförlig handledning som förklarar hur till använda dess funktioner.

    Om fler än två relevanta komponenter finns, når 3D-visualisering sin gräns. KriKit innehåller flera andra möjliga visuella representation metoder såsom filmer eller ”screening tomt”. Om den optimala potentialen ligger innanför det definierat koncentrationsintervallet, konstruerade nya experiment automatiskt med den förväntade förbättring40,46. Experimentell design baserat på den förväntade förbättringen är integrerad i verktygslådan KriKit. Mer detaljerad information finns i dokumentationen till programvaran.

    Efter förfarandet för iterativ genomfördes en verifiering av resultaten, som beskrivs i del D. Giltigheten av grundantaganden kontrollerades genom att utföra en ytterligare känslighetsanalys med den optimala medium sammansättningen. Det vill säga alla ursprungliga media komponenter av intresse var varierade, men Ca2 + och Mg2 + sattes till sin optimala koncentrationsnivåer. I denna studie, de optimala koncentrationerna Equation 8 = 32 x Ref och Equation 9 = 6,8 x Ref valdes. Tabell 2 visar resultatet av valideringen screening. Liknar den ursprungliga känslighet screening (Se tabell 1), NH4+ fortfarande har en betydande negativ inverkan och återstående effekter är fortfarande försumbar.

    På grund av enkel åtkomst användes GFP fluorescens signalen från odling suspensionen att kvantifiera den extracellulära GFP-titern under alla experiment. För verifiering skäl validerades GFP fluorescens mot andra mätningar. Eftersom god Jordbrukarsed utsöndras via Tat-vägen, inte kan fluorescens signalen diskriminera mellan intra- och extracellulära GFP. Således, odlingar reproducerades använder referens mediet och optimerad medium. Förutom fluorescens mätningen från cellfria odling supernatanterna, kvantifierades proteininnehåll av Bradford assay och (semi)-kvalitativ god Jordbrukarsed förbättring visualiseras av SDS-Page15. Alla resulterande mätning signaler var ungefär fördubblats för odlingar med optimerad medium jämfört med referens medium och validerade den ungefärligt 100% förbättring av sekretion prestanda optimerad medium. Följaktligen, GFP specifika fluorescens odling suspension kan anses vara ett lämpligt mått för optimering målet, dvsden extracellulära GFP-titern.

    Figure 2
    Figur 2 : Skärmdump från volymlistan pipettering för känslighetsanalys. Poster i den första kolumnen tilldela en unik identifierare för alla volymer av en rad; identifieraren är den väl antal mål odling MTP på den flytande handler arbetsbord, jfr figur 4CMTP. Återstående kolumner koda volymer för olika lösningar (”Sln-01” till ”Sln-15”) för att vara pipetteras. Kumulativa volymen av en rad motsvarar den slutliga odling volymen av motsvarande väl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 3
    Figur 3 : Skärmdump från den vätskehantering styrprogram ”WinPREP”. Vänster: Rad-beställt kommandon, inklusive ett överföring-kommando för varje stamlösningen till vara pipetteras. Före sista kommandot för inokulum tillägg infogas en användaren prompt för att säkerställa utsäde kulturen är placerad vid bordet precis i tid. Höger: Schematisk bild av den arbetsbord, inklusive den källa labware för Variation lager (två djupt plattor med 12 kolumn-liknande brunnar), reagens dalvärdet för resten lager, vatten och inokulum och media förberedelse målet odling MTP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 4
    Figur 4 : Sammanställning av detaljerade skärmdumpar för inställning av pipettering av en stamlösning. (A) oöppnade kommando för pipettering av Fe lager. Källa labware och källa väl markeras inom på arbetsbord av Läs ram och röd kolumn av motsvarande djup väl plattan. Destination labware och destination brunnar inom markeras av blå ram runt och blå brunnar i målet odling MTP. (B) detaljerade exempel Visa på uppdrag för pipettering av volymer för det här steget (Fe stamlösning). Antal resmål läses från listan pipettering, som har 48 rader. Dispensering volymer för alla destination brunnar för Fe stamlösning finns i kolumn 4 i listan pipettering. Observera att den första kolumnen i listan pipettering innehåller identifierare och inte volymer som ska överföras, se figur 2. (C) information om destination väl numrering. Volymer som skriven i raden #1 för motsvarande pipettering lista kommer vara pipetteras i brunn som markerats som #1, och så vidare. Wells #01, #08, #41 och #48 motsvarar brunnar A01, A08, F01 och F08 för Alfa-numeriska kodning, som trycks också in i odlingen MTP själv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 5
    Figur 5 : Detaljerade resultat från den första upprepningen. (A) Kriging interpolation baserat på experimentella data av iteration 1. Röda prickar indikerar datauppsättningen. För jämförelse, alla tre interpolation ytor är overlayed i en komplott (mörkblå: 0 x Ref, rutig: 1 x Ref, ljusblå: 2 x Ref). En alternativ representation av resultaten kan hittas någon annanstans15. (B) Kriging interpolation baserat på experimenten utförs i iteration 1 (röda prickar) och iteration 2 (gula rutor).Delar av de data som presenteras i denna siffra har varit tidigare publicerade15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 6
    Figur 6 : Skildring av iterativt insamlade optimering resultat. (A) slutliga Kriging modell förutsägelse. (B) statistiska identifiering av optimal område (röd) baserat på statistiska z-testet, som tillhandahålls av KriKit. Rutorna ange successiva steg iterativ design och genomförande av experiment. Delar av de data som presenteras i denna siffra har varit tidigare publicerade15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Komponent Normaliserade koefficient medelvärdet
    FE2 + -0,08
    Mn2 + -0,05
    Zn2 + -0,21
    Cu2 + -0,21
    NH4+ -2.04
    Ni2 + -0,11
    Co2 + -0,10
    MoO42- 0,03
    BO33- 0,06
    Ca2 + 1,00
    Mg2 + 0,45

    Tabell 1: resultaten av känslighetsanalysen. Värden på adsorptionskoefficienten som representerar den genomsnittliga effekten när öka respektive media komponent koncentrationen från dess centrum värde till sitt maximala värde. För optimal experimentell design, som finns i standard litteraturen och används här, den standardavvikelse representerar direkt experimentell variation på grund av replikering av referens experiment. Värden på adsorptionskoefficienten var normaliserade av maxium värde (0.0422 för komponenten Ca2 +). Normaliserat och absolut koefficienten standardavvikelsen är 0,54 och 0.0226, respektive.

    Komponent Normaliserade koefficient medelvärdet
    FE2 + -1.00
    Mn2 + 1,00
    Zn2 + -3.48
    Cu2 + -0.52
    NH4+ -15.95
    Ni2 + 0,69
    Co2 + -0.51
    MoO42- -0.45
    BO33- -1.11

    Tabell 2: resultat av den slutliga känslighetsanalysen. Värden på adsorptionskoefficienten som representerar den genomsnittliga effekten när öka respektive media komponent koncentrationen från dess centrum värde till sitt maximala värde. En optimal experimentell design användes, beror standardavvikelsen bara på experimentell variation med den optimerade medium sammansättningen. Experimentell variation ökade något jämfört med variationen med referens medium. Värden på adsorptionskoefficienten var normaliserade av maxium värde (0.0106 för komponenten Mn2 +). Normaliserat och absolut koefficienten standardavvikelsen är 3,63 och 0.0385, respektive.

    Discussion

    Den generiska typen av presenterade protokollet tillåter olika anpassningar, t.ex., för att studera andra mikrobiella uttryck värdar9,47,48,49,50, 51, eller att optimera andra egenskaper hos målproteinet, som glycosylation mönster eller disulphide obligationer. Protokollet kan också behöva anpassas till de tillgängliga labbutrustning. Integreringen av en MBR-systemet gör öka experimentella genomströmning, vilket möjliggör stora besparingar i tid. Dock när du byter fullt instrumenterade och kontrollerbar bioreaktorer av MBR systems, måste skalbarhet av resultaten anses8,37,52,53. Användning av DOE metoder och matematisk modellering hjälper till att maximera mätdata med avseende på den studera objektiva54 datainnehåll genom effektiv experimentell planering och modell-baserade data tolkning15.

    Ändringar till metoden
    Bredvid flera syften och utbyggbart robotic vätskehanterande system som det som används i denna studie, bör det nämnas att det finns flera mindre vätskehanterande system kommersiellt tillgängliga som är kapabel att utföra denna uppgift och kan placeras inuti laminärt flöde arbete bänkar. Om ingen automatiserad pipettering system är tillgängliga, kan olika medier kompositioner enligt DOE planen också förverkligas genom manuell pipettering med enstaka eller flera kanaler pipetter. Eftersom manuell beredning är mer felbenägna och kommer kräva mycket fokuserat arbete för ganska lång tid, rekommenderas att förbereda ett lägre antal olika medier kompositioner.

    Beroende på funktionerna i det sysselsatta MBR-systemet, kommer att motsvarande odling protokollet variera. Till exempel om ingen online mätning av biomassa bildandet är tillgänglig, kan det räcka att mäta biomassa koncentration efter avslutad tillväxt experimentet. I kombination med online-övervakning av pH och löst syre, som implementeras i flera MBR system, tillväxt mättnaden kan fastställas säkert. I princip kan de tillväxt-experiment genomföras i Mbps ensam placeras inuti skakar inkubatorer, utan användning av en MBR-systemet. I det här fallet korrekt odling villkor måste säkerställas: (1) syre-begränsad odlingar kan undvikas genom att använda Mbps med lämplig geometrier, i kombination med ordentlig skakar frekvenser och skakar diametrar, t.ex., torget 96 eller 24 djup plattor med drivs vid 1000 rpm på 3 mm throw eller vid 250 rpm på 25 mm throw, respektive. Ännu viktigare, ju lägre uppnås maximal syre överföringshastighet, desto lägre den huvudsakliga kolkälla bör koncentreras. Som nämnts ovan, för denna studie, var användningen av 10 g/L glukos lämplig för att förhindra att syre begränsning för de sysselsatta odling villkor; (2) provtagning av MTP kulturerna för biomassa och produkten kvantifiering bör minskas till ett minimum. Varje gång MTP tas bort från skakningar inkubatorn, syretransporten kommer omedelbart breaken-down som kan resultera i unfavorable odling villkor; (3) enligt författarna rekommenderas inte användning av MTP läsare som odling enheter som dessa enheter inte har utvecklats för detta ändamål. Till exempel skakningar mekanik byggdes för tillfällig blandning av mikroplattor efter reagens tillägg och således saknar ofta robusthet för långa serier av kontinuerlig skakningar varar i dagar. Dessutom kan inte tillräcklig ineffekt behövs för mikrobiell odlingar realiseras i dessa läsare. Integrationen av Absorbansavläsningar kort tidsintervall kräver stopp av skakningar rörelse, vilket resulterar i upprepade perioder av syre begränsning. Dessutom kommer avdunstning i sådana system över lång odling perioder snedvrida resultaten. För mer information om överraskande komplexa ämnet på att använda Mbps för mikrobiell odlingar, hänvisas till den citerade litteraturen22,23,24,25,26 och referenser däri.

    Ytterligare överväganden
    Speed-up iterativ optimering steg, är det klokt att noga välja den analytiska metoden för produkten kvantifiering. Snabba och enkla metoder att föredra på bekostnad av precision och noggrannhet, som strategin iterativ experimentell design tål experimentella felaktighet. Dock måste de slutliga resultaten verifieras mot tillräckligt precisa och korrekta produkten kvantifiering metoder som kan vara mer komplicerat. I allmänhet noggrann utvärdering och beslutsfattande om studien förfaranden kräver ansträngning i början av studien, men betalar på sikt, efter rutinmetoder har fastställts.

    Det rekommenderas starkt att definiera ett referens-experiment som jämförs till alla experiment under optimeringen. Det vill säga är den tillämpad medium komponent koncentrationer samt uppmätta utdata normaliserade via divideras med referensvärden. På så sätt varje tillämpas och uppmätta värdet kan tolkas som x-luckan av referensvärdet. För att ta in i konto variationer mellan plattorna, utförs fem referens experiment på varje tallrik. Medelvärdet för de uppmätta resultatet används för normalisering.

    Det kan generellt inte garanteras att det utveckla mediet är också optimal för andra stammar. Det förbättra mediet kommer troligen också dock lämpliga för odling uttrycket stammar med små genetiska skillnader, t.ex., när producerar enzymet varianter med enda aminosyra substitutioner erhållits från mutagenes studier ( även om ens enda punktmutationer har beskrivits att effekt cellulär metabolism och heterologa uttryck prestanda55,56). I detta fall kan presenteras protokollet vara ett första steg, följt av protokoll för hög genomströmning uttryck filmvisningar57. Om protokollet används för medium utveckling med efterföljande skala upp till fed-batch odlingar, bör optimerad medium kontrolleras för motsvarande bioprocess villkor, som klon screening kampanjer på den hur provtagningsutrustningen skall identifieras olika topp Artister för olika utfodring strategier och odling media52,58. Dessutom kan den introducerade KriKit36 generellt bidra till förbättrad holistisk bioprocess optimering.Nyligen utvidgades verktyg förmåga att också stödja flera mål optimering40, som kan vara viktiga för att optimera både uppströms och nedströms processer59,60.

    Disclosures

    Författarna har något att avslöja.

    Acknowledgments

    Den vetenskapliga verksamheten på bioekonomi Science Center stöddes ekonomiskt av ministeriet för Innovation, vetenskap och forskning inom ramen för den NRW-Strategieprojekt BioSC (nr 313/323-400-002 13). Författarna vill tacka de ministeriet för Innovation, vetenskap, och forskning av norr Rhine-Westphalia och Heinrich Heine universitetet Düsseldorf för ett stipendium till Lars Freier inom CLIB-examen kluster industriell bioteknik. Ytterligare finansiering mottogs från programmet aktivera Spaces ”Helmholtz Innovation Labs” tyska Helmholtz Association att stödja den ”mikrobiell Bioprocess Lab – A Helmholtz Innovation Lab”.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BioLector m2p-labs G-BL-100
    Flowerplate m2p-labs MTP-48-BOH For cultivation in the BioLector device
    Sealing foil m2p-labs F-GP-10 Sterile sealing for Flowerplate
    MATLAB Mathworks 2016b
    KriKit Forschungszentrum Jülich n/a Freely available, MATLAB installation required
    Janus pipetting robot Perkin Elmer n/a Includes "WinPrep" software installation
    12-column deep well microplate E&K Scientific EK-2034 Container for medium stock solutions
    96 well microplates, transparent, F-bottom Greiner 655101 For Bradford protein assay
    µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom Greiner 655087 For flourescence measurement in cell-free supernatants
    Pipette Research plus multi-channel pipettes Eppendorf n/a Facilitates manual liquid handling with microplates
    TruPAG Precast Gels Sigma PCG2002 For SDS-Page analysis of cell-free supernantants
    Bradford Reagent Sigma B6916
    C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP n/a n/a Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Choi, J. -M., Han, S. -S., Kim, H. -S. Industrial applications of enzyme biocatalysis: Current status and future aspects. Biotechnol Adv. 33 (7), 1443-1454 (2015).
    2. Li, S., Yang, X., Yang, S., Zhu, M., Wang, X. Technology Prospecting on Enzymes: Application, Marketing and Engineering. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), (2012).
    3. Adrio, J. L., Demain, A. L. Microbial enzymes: tools for biotechnological processes. Biomolecules. 4 (1), 117-139 (2014).
    4. Yim, S. S., An, S. J., Kang, M., Lee, J., Jeong, K. J. Isolation of fully synthetic promoters for high-level gene expression in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 2959-2969 (2013).
    5. Hemmerich, J., et al. Use of a Sec signal peptide library from Bacillus subtilis.for the optimization of cutinase secretion in Corynebacterium glutamicum. Microb Cell Fact. 15 (1), 208 (2016).
    6. Wendisch, V. F. Microbial production of amino acids and derived chemicals: synthetic biology approaches to strain development. Curr Opin Biotechnol. 30, 51-58 (2014).
    7. Lee, J. -Y., Na, Y. -A., Kim, E., Lee, H. -S., Kim, P. The Actinobacterium Corynebacterium glutamicum, an Industrial Workhorse. J Microbiol Biotechnol. 26 (5), 807-822 (2016).
    8. Rohe, P., Venkanna, D., Kleine, B., Freudl, R., Oldiges, M. An automated workflow for enhancing microbial bioprocess optimization on a novel microbioreactor platform. Microb Cell Fact. 11 (1), 144 (2012).
    9. Liu, X., et al. Expression of recombinant protein using Corynebacterium glutamicum.: progress, challenges and applications. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 652-664 (2016).
    10. Freudl, R. Corynebacterium glutamicum as a Platform Organism for the Secretory Production of Heterologous Proteins. Corynebacterium glutamicum: From systems biology to biotechnological applications. Burkovski, A. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. 161-177 (2015).
    11. Yim, S. S., et al. Development of a new platform for secretory production of recombinant proteins in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 113 (1), 163-172 (2015).
    12. Limberg, M. H., et al. Metabolic profile of 1,5-diaminopentane producing Corynebacterium glutamicum under scale-down conditions: Blueprint for robustness to bioreactor inhomogeneities. Biotechnol Bioeng. 114 (3), 560-575 (2016).
    13. Käβ, F. Assessment of robustness against dissolved oxygen/substrate oscillations for C. glutamicum DM1933 in two-compartment bioreactor. Bioprocess Biosyst Eng. 37 (6), 1151-1162 (2014).
    14. Teramoto, H., Watanabe, K., Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. High yield secretion of heterologous proteins in Corynebacterium glutamicum.using its own Tat-type signal sequence. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 677-687 (2011).
    15. Freier, L., Hemmerich, J., Schöler, K., Wiechert, W., Oldiges, M., von Lieres, E. Framework for Kriging-based iterative experimental analysis and design: Optimization of secretory protein production in Corynebacterium glutamicum. Eng Life Sci. 16 (6), 538-549 (2016).
    16. Huber, R., Roth, S., Rahmen, N., Büchs, J. Utilizing high-throughput experimentation to enhance specific productivity of an E. coli. T7 expression system by phosphate limitation. BMC Biotechnol. 11 (1), 22 (2011).
    17. Kottmeier, K., Müller, C., Huber, R., Büchs, J. Increased product formation induced by a directed secondary substrate limitation in a batch Hansenula polymorpha culture. Appl Microbiol Biotechnol. 86 (1), 93-101 (2010).
    18. Kennedy, M. J., Krouse, D. Strategies for improving fermentation medium performance: A review. J Ind Microbiol Biotechnol. 23 (6), 456-475 (1999).
    19. Kleman, G. L., Strohl, W. R. Developments in high cell density and high productivity microbial fermentation. Curr Opin Biotechnol. 5 (2), 180-186 (1994).
    20. Jones, R., Gadd, G. Ionic nutrition of yeast: Physiological mechanisms involved and implications for biotechnology. Enzy Microb Technol. 12 (6), 402-418 (1990).
    21. Zhang, J., Greasham, R. Chemically defined media for commercial fermentations. Appl Microbiol Biotechnol. 51 (4), 407-421 (1999).
    22. Kensy, F., et al. Oxygen transfer phenomena in 48-well microtiter plates: Determination by optical monitoring of sulfite oxidation and verification by real-time measurement during microbial growth. Biotechnol Bioeng. 89 (6), 698-708 (2005).
    23. Hermann, R., Lehmann, M., Büchs, J. Characterization of gas-liquid mass transfer phenomena in microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 81 (2), 178-186 (2002).
    24. Duetz, W. A. Microtiter plates as mini-bioreactors: Miniaturization of fermentation methods. Trends Microbiol. 15 (10), 469-475 (2007).
    25. Funke, M., Diederichs, S., Kensy, F., Müller, C., Büchs, J. The baffled microtiter plate: Increased oxygen transfer and improved online monitoring in small scale fermentations. Biotechnol Bioeng. 103 (6), 1118-1128 (2009).
    26. Lattermann, C., Funke, M., Hansen, S., Diederichs, S., Büchs, J. Cross-section perimeter is a suitable parameter to describe the effects of different baffle geometries in shaken microtiter plates. J Biol Eng. 8, 18 (2014).
    27. Samorski, M., Müller-Newen, G., Büchs, J. Quasi-continuous combined scattered light and fluorescence measurements: A novel measurement technique for shaken microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 92 (1), 61-68 (2005).
    28. Kensy, F., Zang, E., Faulhammer, C., Tan, R. -K., Büchs, J. Validation of a high-throughput fermentation system based on online monitoring of biomass and fluorescence in continuously shaken microtiter plates. Microb Cell Fact. 8 (1), 31 (2009).
    29. Puskeiler, R., Kaufmann, K., Weuster-Botz, D. Development, parallelization, and automation of a gas-inducing milliliter-scale bioreactor for high-throughput bioprocess design (HTBD). Biotechnol Bioeng. 89 (5), 512-523 (2005).
    30. Bareither, R., Pollard, D. A review of advanced small-scale parallel bioreactor technology for accelerated process development: Current state and future need. Biotechnol Prog. 27 (1), 2-14 (2011).
    31. Hortsch, R., Stratmann, A., Weuster-Botz, D. New milliliter-scale stirred tank bioreactors for the cultivation of mycelium forming microorganisms. Biotechnol Bioeng. 106 (3), 443-451 (2010).
    32. Isett, K., George, H., Herber, W., Amanullah, A. Twenty-four-well plate miniature bioreactor high-throughput system: Assessment for microbial cultivations. Biotechnol Bioeng. 98 (5), 1017-1028 (2007).
    33. Motta Dos Santos, L. F., Coutte, F., Ravallec, R., Dhulster, P., Tournier-Couturier, L., Jacques, P. An improvement of surfactin production by B. subtilis BBG131 using design of experiments in microbioreactors and continuous process in bubbleless membrane bioreactor. Bioresour Technol. 218, 944-952 (2016).
    34. Islam, R. S., Tisi, D., Levy, M. S., Lye, G. J. Framework for the Rapid Optimization of Soluble Protein Expression in Escherichia coli Combining Microscale Experiments and Statistical Experimental Design. Biotechnol Prog. 23 (4), 785-793 (2007).
    35. Huber, R., et al. Robo-Lector: A novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb Cell Fact. 8 (1), 42 (2009).
    36. Freier, L., von Lieres, E. Kriging toolKit (KriKit). , Available from: https://github.com/modsim/KriKit (2017).
    37. Kensy, F., Engelbrecht, C., Büchs, J. Scale-up from microtiter plate to laboratory fermenter: evaluation by online monitoring techniques of growth and protein expression in Escherichia coli.and Hansenula polymorpha fermentations. Microb Cell Fact. 8 (1), 68 (2009).
    38. Lu, C., Bentley, W. E., Rao, G. A high-throughput approach to promoter study using green fluorescent protein. Biotechnol Prog. 20 (6), 1634-1640 (2004).
    39. Zanzotto, A., Boccazzi, P., Gorret, N., van Dyk, T. K., Sinskey, A. J., Jensen, K. F. In situ measurement of bioluminescence and fluorescence in an integrated microbioreactor. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 40-47 (2006).
    40. Freier, L., von Lieres, E. Multi-Objective Global Optimization (MOGO): Algorithm and Case Study in Gradient Elution Chromatography. Biotechnol J. , (2016).
    41. Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum.: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J Bacteriol. 175 (17), 5595-5603 (1993).
    42. Weuster-Botz, D., Kelle, R., Frantzen, M., Wandrey, C. Substrate Controlled Fed-Batch Production of L-Lysine with Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Prog. 13 (4), 387-393 (1997).
    43. Meissner, D., Vollstedt, A., van Dijl, J. M., Freudl, R. Comparative analysis of twin-arginine (Tat)-dependent protein secretion of a heterologous model protein (GFP) in three different Gram-positive bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 76 (3), 633-642 (2007).
    44. Morschett, H., Wiechert, W., Oldiges, M. Automation of a Nile red staining assay enables high throughput quantification of microalgal lipid production. Microb Cell Fact. 15, 34 (2016).
    45. Fisher, R. A. The design of experiments. , Oliver & Boyd. Edinburgh. (1935).
    46. Morschett, H., Freier, L., Rohde, J., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. A framework for accelerated phototrophic bioprocess development: Integration of parallelized microscale cultivation, laboratory automation and Kriging-assisted experimental design. Biotechnol Biofuels. 10, 26 (2017).
    47. Le Loir, Y., et al. Protein secretion in Lactococcus lactis: An efficient way to increase the overall heterologous protein production. Microb Cell Fact. 4 (1), 2 (2005).
    48. Anné, J., Vrancken, K., van Mellaert, L., van Impe, J., Bernaerts, K. Protein secretion biotechnology in Gram-positive bacteria with special emphasis on Streptomyces lividans. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1750-1761 (2014).
    49. Gupta, S. K., Shukla, P. Advanced technologies for improved expression of recombinant proteins in bacteria: perspectives and applications. Crit Rev Biotechnol. 36 (6), 1089-1098 (2016).
    50. Fu, L. L., Xu, Z. R., Li, W. F., Shuai, J. B., Lu, P., Hu, C. X. Protein secretion pathways in Bacillus subtilis: implication for optimization of heterologous protein secretion. Biotechnol Adv. 25 (1), 1-12 (2007).
    51. Yoon, S., Kim, S., Kim, J. Secretory Production of Recombinant Proteins in Escherichia coli. Rec Pat Biotechnol. 4 (1), 23-29 (2010).
    52. Hemmerich, J., et al. Comprehensive clone screening and evaluation of fed-batch strategies in a microbioreactor and lab scale stirred tank bioreactor system: application on Pichia pastoris producing Rhizopus oryzae lipase. Microb Cell Fact. 13 (1), 36 (2014).
    53. Glazyrina, J., Krause, M., Junne, S., Glauche, F., Strom, D., Neubauer, P. Glucose-limited high cell density cultivations from small to pilot plant scale using an enzyme-controlled glucose delivery system. New Biotechnol. 29 (2), 235-242 (2012).
    54. Gernaey, K. V., et al. Monitoring and control of microbioreactors: An expert opinion on development needs. Biotechnol J. 7 (10), 1308-1314 (2012).
    55. Rahmen, N., Fulton, A., Ihling, N., Magni, M., Jaeger, K. -E., Büchs, J. Exchange of single amino acids at different positions of a recombinant protein affects metabolic burden in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 14, 10 (2015).
    56. Rahmen, N., et al. A particular silent codon exchange in a recombinant gene greatly influences host cell metabolic activity. Microb Cell Fact. 14, 156 (2015).
    57. Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in E. coli. J Vis Exp. (89), e51464 (2014).
    58. Scheidle, M., et al. High-throughput screening of Hansenula polymorpha clones in the batch compared with the controlled-release fed-batch mode on a small scale. FEMS Yeast Res. 10 (1), 83-92 (2010).
    59. Baumann, P., Bluthardt, N., Renner, S., Burghardt, H., Osberghaus, A., Hubbuch, J. Integrated development of up- and downstream processes supported by the Cherry-Tag™ for real-time tracking of stability and solubility of proteins. J Biotechnol. 200, 27-37 (2015).
    60. Baumann, P., Hahn, T., Hubbuch, J. High-throughput micro-scale cultivations and chromatography modeling: Powerful tools for integrated process development. Biotechnol Bioeng. 112 (10), 2123-2133 (2015).

    Tags

    Bioteknik fråga 130 Design av experiment kriging lab automation vätskehantering robot mikrotiter tavla microbioreactor Corynebacterium glutamicum heterologa proteiner sekretion nutrition medier optimering
    Generiskt protokoll för optimering av heterologa proteinproduktion med hjälp av automatiserad Microbioreactor teknik
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, … More

    Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (130), e56234, doi:10.3791/56234 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter