Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generisk protokol for optimering af heterolog Protein produktion ved hjælp af automatiserede Microbioreactor teknologi

Published: December 15, 2017 doi: 10.3791/56234
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2,4
1IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Jülich, 2Research Center Jülich, Bioeconomy Science Center (BioSC), 3Computational Systems Biotechnology (AVT.CSB), RWTH Aachen University, 4Institute for Biotechnology, RWTH Aachen University
* These authors contributed equally

Summary

Dette manuskript beskriver en generisk tilgang til skræddersyede design af mikrobielle dyrkning medier. Denne aktiveres af en iterativ arbejdsproces kombinere Kriging funderede eksperimenterende design og microbioreactor teknologi for tilstrækkelig dyrkning overførselshastighed, som støttes af lab robotteknologi til at øge pålidelighed og hastighed i flydende håndtering af medier forberedelse.

Abstract

En kerneforretning inden for industriel bioteknologi ved hjælp af mikrobiel produktion cellefabrikker er den iterative proces af stamme engineering og optimering af bioproces betingelser. Et vigtigt aspekt er forbedringen af dyrkning medium at give et optimalt miljø for mikrobiel dannelsen af produktet af interesse. Det er godt accepteret, at medierne sammensætning dramatisk kan påvirke samlede bioproces ydeevne. Ernæring medium optimering er kendt for at forbedre rekombinante protein produktion med mikrobielle systemer og dermed, dette er en givende skridt i bioproces udvikling. Men meget ofte standard medier opskrifter er taget fra litteratur, da skræddersyet design af dyrkning medium er en kedelig opgave, der kræver microbioreactor teknologi for tilstrækkelig dyrkning overførselshastighed, hurtig produkt analytics og støtte af lab robotteknologi til aktiverer pålidelighed i flydende håndtering trin. Desuden er avancerede matematiske metoder nødvendige for rationel analysere måledata og effektivt designe parallelle eksperimenter såsom for at opnå optimal informationsindhold.

Den generiske karakter af præsenteres protokollen giver mulighed for nem tilpasning til forskellige lab udstyr, andre udtryk værter og target proteiner af interesse, samt yderligere bioproces parametre. Desuden kan andre optimering mål som protein produktion sats, specifikke udbytte eller produktkvalitet vælges passer til anvendelsesområdet for andre optimering undersøgelser. Den anvendte Kriging værktøjskasse (KriKit) er et generelt værktøj til Design af eksperimenter (DOE) det bidrager til forbedret holistisk bioproces optimering. Den støtter også multi objektive optimering, som kan være vigtige i at optimere både opstrøms og nedstrøms processer.

Introduction

Moderne rekombinant genteknologi giver den omfattende brug af tekniske enzymer til forskellige applikationer i den farmaceutiske industri, dyrefoder, organisk kemi, og fødevareforarbejdning1,2,3. Produktion af tekniske enzymer i bulk mængder er et vigtigt emne for industriel bioteknologi og optimeret rekombinante protein produktion, og begge stamme og bioproces engineering er nødvendig. I generation af effektivt manipuleret produktionsstammer, forskellige genetiske biblioteker er tilgængelige, f.eks., for afbalanceret gen expression4 eller øget sekretion effektivitet5.

Corynebacterium glutamicum er en stor producent af aminosyrer på industriel skala6,7 og repræsenterer en attraktiv ikke-konventionelle udtryk vært for sekretoriske produktionen af rekombinante proteiner8 ,9. Både generelle sekretoriske (Sec) og twin-argininog translokation (Tat) pathway er til stede i C. glutamicum og blev med succes anvendt for rekombinante protein sekretion10. Omfattende erfaring i bioproces engineering aminosyre produktion i industriel skala samt evnen til at udskille proteiner til g/L beløb11 og stor robusthed vedrørende bioproces inhomogeneities fundet i stor skala, som udlæg til planteavl12,13, gøre C. glutamicum en lovende platform organisme for sekretoriske produktionen af heterolog proteiner i industriel skala.

Ernæring medium optimering er kendt for at forbedre rekombinante protein produktion med mikrobielle systemer14,15,16,17 og derfor justering i medium sammensætning er en givende skridt i bioproces udvikling med hensyn til optimal produktivitet18,19,20,21. Intens forskning om anvendelsen af mikrotiter plader (MTPs) for mikrobielle dyrkning22,23,24 banede vejen for udvikling og design af MTPs for mikrobiel dyrkning25 ,26 og udviklingen af MTP-baseret microbioreactor (MBR) systemer med online overvågning og miljømæssige styre27,28. MBRs aktiverer en betydelig stigning i eksperimentel dyrkning overførselshastighed. Desuden er MBR systemer stammer fra andre typer af bioreaktorer, f.eks., bubble kolonner eller omrørt tank reaktorer, tilgængelige for mikrobiel bioproces optimering29,30,31, 32.

I almindelighed, optimering undersøgelser drage fordel af øget eksperimentelle overførselshastighed, som bliver endnu mere magtfulde i kombination med DOE metoder, såsom at vurdere samspillet mellem design variabler eller reducere high-dimensionelle Søg rum. Derfor, den kombinerede brug af MBR systemer, lab automatisering og DOE har vist sig for at være en kraftfuld metode i bioteknologi8,16,33,34,35.

En protokol til media optimering præsenteres kombinerer state-of-the-art laboratorium automation, MBR teknologi med online proces overvågning og Kriging-baserede data analyse/eksperimentelle design. Kriging metode er gennemført i en MATLAB værktøjskasse ("KriKit"), som kan downloades og bruges gratis af afgift36. Som ansøgning eksempel, er maksimering af sekretoriske grønne fluorescent protein (NGL) produktion med C. glutamicum vist ved at optimere sammensætningen af CgXII minimal medium. Normal god landbrugspraksis titer blev valgt som optimering mål, som det kan kvantificeres nemt og det er almindeligt anvendt som model protein for studier på MBR systemer37,38,39.

De præsenterede rammer er opdelt i fire trin, som er illustreret i figur 1. Trinene er angivet med boks rammer og svarer til sektioner af protokollen. Det første skridt (figur 1A) er at definere projektets mål og fastlægge de nødvendige metoder. Kombinationen af DOE metoder, MBR teknologi og lab automation giver en øget eksperimentelle overførselshastighed, der kræver kraftig behandling af personoplysninger. Det andet trin (figur 1B) har til formål at afsløre følsomme design variabler (dvs., medium komponenter) med høj indflydelse på optimering mål. Dette fører til et begrænset antal design variabler. Det tredje trin (figur 1 c) består af en iterativ optimering for en mere detaljeret undersøgelse af den funktionelle relation mellem de resterende design variabler og mål af interesse. Hjælp af successivt udvidet data sæt, er Kriging tilgang anvendt til at forudsige det eksperimentelle resultat ikke målt steder. Iterativ cyklus stopper så snart Kriging model forudsiger en optimal eller plateau med tilstrækkelig nøjagtighed. Resultaterne verificeres i fjerde trin (fig. 1 d), begyndende med en yderligere følsomhedsanalyse omkring identificerede optimalt. Hvis i første omgang, ufølsom komponenter findes for at være ufølsom også i regionen optimalt, er det rimeligt at antage, at dette gælder under iterative optimering proceduren i det tredje trin. Bagefter, det anbefales at kontrollere optimering resultater ved anvendelse af ortogonale metoder, som en aktivitet assay eller SDS-Page.

Den generiske karakter af præsenteres protokollen giver mulighed for nem tilpasning til forskellige lab udstyr, andre udtryk værter og target proteiner af valg, samt yderligere bioproces variabler som pH værdi eller dyrkning temperatur.Derudover kan andre optimering mål som protein produktion sats, specifikke udbytte eller produktkvalitet vælges passer til anvendelsesområdet for andre optimering undersøgelser.

Figure 1
Figur 1 : Workflow af optimering undersøgelse. Fire ramme bokse svarer til sektioner af protokollen, "Opfatte den undersøgelse og Definition af metoder" (afsnit 1), "Følsomhedsanalyse" (afsnit 2), "Iterativ optimering" (afsnit 3) og "Validering" (afsnit 4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. undfange undersøgelse og Definition af metoder (figur 1: del A)

Bemærk: Definition af målet optimering: er et tidsforløb af produkt dannelse behov for eller er kun et begrænset tidsinterval eller endda et fast tidspunkt relevante? Også overveje potentielle problemer som stabilitet, indsats af analytiske kvantificering, eller dyrkning tid. Som et alternativ til endelige protein titer, bør der overvejes andre mål såsom biomasse eller dyrkning tid. Biomasse er afspejlet af biomasse bestemt produkt udbytte, mens dyrkning tid afspejles af rum-tid-udbytte. (Minimum) produktkvalitet kunne også være et mål. Multi objektive optimering kan være påkrævet i visse situationer, som omtalt andetsteds40. I denne undersøgelse, normal god landbrugspraksis titer efter 17 h dyrkning blev valgt som optimering mål. Normal god landbrugspraksis fluorescens kan følges online ved hjælp af det udstyr til rådighed i denne undersøgelse, som forenkler bestemmelse af koncentrationen af model protein.
Bemærk: Definition af parametre til optimeres: CgXII medium består af 16 enkelte komponenter41 og undersøge alle disse i et fuldt faktordesign ville resultere i 216 ≈ 65.000 eksperimenter. Søg plads skal derfor nedsættes på grundlag af rationelle og erfaring-drevet. Valg af medier komponenter anses for optimering kan støttes af tilgængelige ekspertviden eller litteraturen data.

  1. Beslutte, hvilke medium komponent koncentrationer bør ikke ændres. Til optimering af CgXII medium, blev følgende komponenter udvalgt til at være fast:
    1. Glucose er fastsat til 10 g/L. Denne optimering er trivielt, fordi flere glukose udbytter mere normal god landbrugspraksis secernerende biomasse. Formålet var at afsløre ikke-intuitive medium virkninger.
    2. 3-(N-morpholino) propanesulfonic syre (MOPPER) er fastsat til 42 g/L. Dette giver tilstrækkelig stødpudeevne under batch dyrkning og metaboliseres ikke.
      Bemærk: Tilsætning af MOPS på denne endelige koncentration sikrer en startværdi af pH 7, selv med de forskellige bind af de anden stamopløsninger tilføjet, som ikke ved pH 7. For at udelukke enhver afvigelse i begyndende pH værdier, skal pH kontrolleres for mellemstore kompositioner hvor alle stamopløsninger er tilføjet på deres maksimale og minimale mængder.
    3. KH2PO4 og K2HPO4 er fastsat på 1 g/L hver. Disse giver også stødpudeevne, og tjene som fosfat kilde.
    4. Urea er fastsat til 5 g/L. Dette tjener som en basal kvælstof kilde og pH-stabiliserende agent, tilstrækkelige til at forhindre N-begrænsning.
    5. Biotin er fastsat til 0,2 mg/L. C. glutamicum ATCC13032 er auxotrophic for biotin.
    6. Protocatechuic syre (PCA) er fastsat til 30 mg/L. Det tjener som en jern chelaterende agent.
    7. Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) er fastsat til 100 µM. Det inducerer udtryk for normal god landbrugspraksis -genet.
  2. Vælg høje og lave koncentrationer af medier komponenter til indledende følsomhed screeninger. Her, blev komponenter fra tre typiske grupper af medier komponenter udvalgt. De undersøgte lave og høje koncentrationer for hver komponent er:
    1. Standard kvælstof kilde: (NH4)2SO4 (8-32 g/L). variation af kvælstof kilde blev rapporteret at være lovende for optimering af biomasse-specifikke normal god landbrugspraksis signal8.
    2. Sporstoffer: FeSO4 ∙ 7 H2O (4-16 mg/L), MnSO4 ∙ H2O (4-16 mg/L), ZnSO4 ∙ 7 H2O (0,4-1,6 mg/L), CuSO4 ∙ 5 H2O (125-501 µg/L), NiCl2 ∙ 6 H2O () 8-32 µg/L) og CoCl2 ∙ 6 H2O (52-208 µg/L). Sammensætningen af sporstoffer er nedarvet fra den første offentliggørelse af CgXII medium41. Derudover Na2MoO4 ∙ H2O (26-104 µg/L) og H3BO3 (20-80 µg/L) blev medtaget som sporstoffer, som de bruges i en publiceret variant af CgXII medium42.
    3. Makro elementer: MgSO4 ∙ 7 H2O (0,2-0,4 g/L), CaCl2 ∙ 2 H2O (5.3-21,2 mg/L). Disse blev fundet blandt andre divalent kationer til at forbedre sekretoriske normal god landbrugspraksis produktion i en anden undersøgelse14, hvor C. glutamicum stamme Rasmussen blev brugt sammen med en anden medium baggrund og CgR0949 Tat signal peptid.
  3. Forberedelse af materialer og procedurer, definition
    Bemærk: Det tilrådes at definere og fastsætte de eksperimentelle metoder på et detaljeret niveau. Denne standardisering sikrer, at forskellige resultater kan spores tilbage til iboende biologiske variation eller anden mellemlang kompositioner.
    Bemærk: Medier lager løsninger: forberede alle individuelle stamopløsninger undersøgt medier komponenter. Forberede højkoncentreret bestande at tillader til fortynding af forskellige mængder for alle komponenter. Det betyder, at efter kombinerer alle stamopløsninger på deres højeste volumen planmæssigt design, dette ikke kan overstige den endelige dyrkning volumen, jf. stk. "Generation af medium stamopløsning pipettering liste" trin 1.3.3. Hvis tilføjelsen af en meget koncentreret opløsning resulterer i en meget lav tilføjelse volumen, fx < 1/100th af den endelige dyrkning volumen, fortyndes stamopløsningen i overensstemmelse hermed. For eksempel, i denne undersøgelse var en pipettering volumen af mindre end 10 µL defineret til at være umuligt. Typisk, mikronaeringsstof løsninger er koncentreret så højt som 1,000fold med hensyn til standard slutkoncentration på mellemlang. Det er en fordel at koncentrere medier komponenter som multipla (X-fold) med hensyn til koncentrationer i reference opskrift. Dermed undgås umuligt pipettering mængder af fraktioneret decimaler. Detaljerede opskrifter til alle stamopløsninger af CgXII medium er givet i det supplerende dokument.
    1. Arbejde celle bank (WCB)
      Bemærk: Til hver vækst eksperiment, en WCB alikvot er brugt. Hvis flere delprøver er nødvendigt, brug 100 mL hjernen hjerte infusion (BHI) medium i 1.000 mL forbløffet ryste kolber eller podes flere ryste kolber, der sammenlægges, før tilsætning af glycerol løsning.
      1. Forberede enkelt kolonier af rekombinant udtryk stamme C. glutamicum pCGPhoDBs- normal god landbrugspraksis43 på agar plader (37 g/L BHI pulver, 20 g/L agar, 25 mg/L kanamycin). Plating materiale kan enten komme fra frisk transformation eller en befrugtede delprøve.
Der inkuberes ved 30 ° C indtil udseendet af enkelt kolonier; det tager normalt en til to dage.
  • Podes en shaker kolbe kultur (50 mL BHI medium med 25 mg/L kanamycin forbløffet kolbe på 500 mL, 250 rpm, 25 mm ryster diameter, 30 ° C) med koloni materiale, og der inkuberes natten over (ca. 16 h).
  • Kombinere én diskenhed af resulterende cellesuspension med et volumen på 500 g/L steril glycerol løsning og distribuere i 2 mL alikvoter i sterile kryopræservering hætteglas. Opbevares ved-80 ° C.
  • MBR dyrkning protokol
    Bemærk: For de erhvervsdrivende BioLector MBR system i denne undersøgelse, spredt lys (biomasse) og normal god landbrugspraksis Fluorescens er intensiteten målinger, som har brug for en vis gevinst værdi er tildelt. Jo højere den gevinst, jo højere den optisk signal forstærkes; Det er også hvorfor spredt lys og fluorescens måles i arbitrære enheder (a.u.). Fastlægge passende gevinst værdier for biomasse og normal god landbrugspraksis påvisning i indledende forsøg, sammen med passende ryster frekvens og fylde volumen for at undgå ilt begrænsning ved højere biomasse koncentrationer under senere procesfaser. De erhvervsdrivende dyrkning betingelser ("Flowerplates", dvs, flower-formet 48-godt MTPs, ryster hyppigheden af 1200 rpm, påfyldning volumen af 1.000 µL, 10 g/L glukose som vigtigste carbon kilde) sikrede ilt ubegrænset udlæg til planteavl. For maksimal ilt henlægge takster som følge af andre kombinationer af udfylde diskenheder og ryster frekvenser i flower-formet 48-godt MTPs, er datablade fra leverandøren tilgængelige. Også, vækst mangler af enkelte kulturer kan opstå på grund af lavt beløb af sekundære substrater (f.eks., kvælstof, sporstoffer). Derfor tjekke biomasse koncentrationer i slutningen af udlæg til planteavl. I denne undersøgelse, blev ingen sådanne vækst virkninger observeret.
    1. Definere dyrkning protokol til MBR-systemet ("BioLector") som følger:
    2. Filterset 1: Biomasse, få 14. Filterset 2: pH, gevinst er forudindstillet. Filterset 3: pO2, gevinst er forudindstillet. 4: normal god landbrugspraksis, få 80.
    3. Ryster frekvens: 1200 rpm.
    4. Temperatur: 30 ° C.
    5. Cyklustid: 15 min.
    6. Eksperiment tid: manual (dyrkning ikke stoppes automatisk).
  • Generation af medium stamopløsning pipettering liste
    Bemærk: Næsten alle flydende håndtering robot system er i stand til at læse pipettering handlinger fra eksterne filer. Dybest set, de nødvendige minimal oplysninger er overførsel volumen og placeringen af reagens kilde og destination af hver repræsenteret ved en labware holdning til den robot dæk og en specifik hulrum inden for labware. Dog betragtes som forskellige grammatikker for forskellige flydende håndteringssystemer. Figur 2 viser et eksempel filstruktur for de erhvervsdrivende pipettering system i denne undersøgelse.
    1. Fire typer af stamopløsninger er pipetted i hver dyrkning godt:
      1. Lager løsninger af media-komponenter, der er varieret ("Variation bestande").
      2. Vand for at kompensere for forskellige kumulative mængder over bestande.
      3. En stamopløsning ("Resten Stock") indeholder alle komponenter, der er faste. Denne stamopløsning kan være sammensat fra lagre, der indeholder de forskellige komponenter, der er, f.eks.opbevares ved forskellige temperaturer eller steriliseret ved hjælp af forskellige metoder.
      4. Inokulum, der skal tilføjes som den sidste komponent og sætte på arbejdsbord lige før tilsætning at undgå afregning af celler.
    2. Per dyrkning, beregne diskenheder skal overføres til alle medier komponenter i henhold til:
      Equation 1
      Volumen til at blive føjet til bestemte Variation bestande måske nul, dvs, når denne specifikke komponent udelades.
    3. Revidere alle beregnede diskenheder, V,jeg for passende tal. Pipettering volumen stigninger i volumen trin bør ikke være for lille. Hvis det er nødvendigt, justere koncentrationerne af Variation bestande. For eksempel, minimal pipettering lydstyrken her blev defineret som 10 µL, og minimal tidsforøgelse blev defineret som 5 µL. Generelt bør disse mængder defineres baseret på eksperimentelt bestemte præcision og nøjagtighed for den brugte væske håndtering station15,44.
    4. Beregne omfanget af Resten Stock indeholdende de faste komponenter for alle brønde som følger:
      Equation 2
      hvor den maksimale kumulative volumen af Variation Stock Equation 3 bruges. Derfor Beregn de krævede koncentrationer af de faste bestanddele i Resten Stock som følger:
      Equation 4
      Forbered Resten Stock i overensstemmelse hermed.
    5. Per dyrkning, beregne mængden af vand tilføjes som følger:
      Equation 5
    6. Per dyrkning godt, en liste over alle diskenheder skal tilføjes i følgende rækkefølge af tilføjelse: VH2O, VRestStock, Vjeg, VInok. Formatere listen pipettering specifikationerne af væsken håndtering station, som vist for en eksempel i fig. 2.
  • Frø kultur, automatiseret media forberedelse og start af vigtigste kultur
    1. Oprette en protokol for flydende håndtering robot. Se figur 3 og figur 4 for en eksempel protokol for en "Janus" system, implementeret i tilsvarende "WinPREP" software. Protokollen bør overveje følgende aspekter:
      1. Omfatte en tilstrækkelig længde af sterile boliger inden medier forberedelse.
      2. Omfatte en indledende overdreven rengøring og vask af alle pipettering tips og slanger.
      3. Vælge passende labware beholdere til stamopløsninger. Her, er dyb brønd plader med 12 kolonner velegnet til opbevaring af Variation bestande, som alle otte pipettering tips kan dyppe i et parallelt arrangement i kolonnerne godt. Dette fremskynder stærkt media forberedelse. Hvis 15 mL eller 50 mL reagens rør anvendes som reservoirer, kan kun én pipettering tip dyppe i det på én gang.
    • For andre bestande som vand og Resten Stockbruges 100 mL trug, da disse stamopløsninger kræver større mængder i alt.
  • Give et tilstrækkeligt volumen for hver stamopløsning at kompensere for affaldsmængderne, højde pipettering forskydninger, osv.
  • Indsæt en bruger prompten før podning skridt, at sikre, at dette trin udføres umiddelbart før frø kultur procedure.
  • Forberede alle stamopløsninger i en steril måde og i butikken indtil brug, i passende beholdere, fx, sterile 15 mL og 50 mL reagensglas.
  • Sterilisere dyb brønd pladerne for stamopløsning opbevaring på et arbejdsbord, fxved aftørring med 70% ethanol og efterfølgende tørring i en laminar flow hætte.
  • Start frø kultur ved at vaccinere 50 mL BHI medium indeholder 25 mg/L kanamycin med en alikvot fra WCB. Før MBR dyrkning, forberede frisk, vital inokulum fra eksponentielt voksende frø kulturer i en tilstrækkelig mængde.
  • Placere alle nødvendige labware på den robot arbejdsbord og hæld stamopløsninger i den tilsvarende labware.
  • Starte robot arbejdsprocessen for media forberedelse, således at de sidste trin (podning), nås i gang med starten af frø kultur. Den samlede runtime af robot arbejdsprocessen skal evalueres tidligere. Her, var den samlede længde ca 1,5 time.
  • Prøve frø kultur efter ca 2 h, så hver time, til at overvåge væksten af optisk densitet (OD600). Efter ca. 5 h, kulturen når 3-4 OD600 og bruges til at finde de vigtigste kulturer.
  • Placer frø kultur på flydende handleren arbejdsbord og fortsætte media forberedelse protokol. Forsegle dyrkning MTP efter podning.
  • Placer den forseglede dyrkning MTP i BioLector enheden og starte foruddefinerede dyrkning protokol.
  • Bortskaf de resterende stamopløsninger, ifølge biosikkerhed forordninger om nødvendigt, og frø kultur fra den robot arbejdsbord. Rengør den genbrugelige labware og starte flydende handleren dekontaminering protokol.
  • Produkt kvantificering og forbehandling af rå data til analyse
    1. Stop de vigtigste kultur efter en 17 h runtime.
    2. Overfør måledata fra BioLector MBR enhed tilsluttet computeren ved hjælp af BioLection softwarepakke ifølge fabrikantens brugsanvisning.
    3. Brug den "Data Management → transformere Data" funktion af den "BioLection" software-pakke, der ledsager MBR systemet for at konvertere rå datafilen til en nem adgang regnearksformat. Kopiere normal god landbrugspraksis signal data for alle dyrkning wells fra kolonnen timestamp tættest på 17 h. identificere normal god landbrugspraksis signaler fra reference dyrkning brønde og gennemsnittet. Normalisér alle resterende normal god landbrugspraksis signal af den gennemsnitlige reference signal.
    4. Kvantificere normal god landbrugspraksis titer ved hjælp af flere metoder (hvis påkrævet)
      1. Overføre celle suspensioner fra alle dyrkning brønde i prelabeled reaktion rør og få den celle-fri supernatanten efter centrifugering i 10 min. ved maksimal hastighed ved hjælp af en benchtop centrifuge.
      2. Overføre 200 µL af hver celle-fri supernatanten til en sort 96-brønd MTP med gennemsigtig bund, og læse den normal god landbrugspraksis specifikke fluorescens på 488/520 nm ved hjælp af en passende mikrotiterplade læser. Normalisere normal god landbrugspraksis signalet fra alle brønde med gennemsnitlige signal fra udlæg til planteavl reference, som i trin 1.5.3.
        Bemærk: De absolutte normal god landbrugspraksis fluorescens signaler kan ikke sammenlignes for forskellige måleanordninger. Derfor, de 5 reference stammer fra alle vigtigste udlæg til planteavl fungere som en intern standard. Forbedring af normal god landbrugspraksis titer kan udtrykkes i forhold til den interne standard. Dette giver mulighed for sammenligning af resultater fra forskellige eksperimenter og forskellige normal god landbrugspraksis kvantificering metoder (se næste to trin).
      3. Bestemme de celle-fri analysere med standardprotokoller, fx, Bradford eller BCA assay proteinindhold. I kombination med resultaterne fra trin 2 er fastsættelsen af en protein specifikke normal god landbrugspraksis titer muligt.
        Bemærk: Efter fluorescens målingen, bruge prøve direkte fra denne mikrotiterplade. Brug af multi-kanal pipetter i høj grad letter den nødvendige væske håndtering trin.
      4. Udføre en SDS-Page visualisering af celle-fri analysere følgende standardprotokoller for at kontrollere, at de fleste af stigning proteinindhold skyldes øget normal god landbrugspraksis sekretion.
        Bemærk: SDS-Page er mere besværlige end de tidligere nævnte metoder, især med en høj sample belastning. Til kontrolformål er det ofte tilstrækkeligt at køre SDS-sider af celle-gratis supernatanter fra reference medium og endelige optimeret medium udlæg til planteavl15.

    • 2. en følsomhedsanalyse (figur 1: del B).

    Bemærk: Målet med denne del er at identificere de vigtige faktorer, der har en betydelig virkning på målet.

    1. Vælg en begyndelseskoncentration række medier komponenter. Reference medium sammensætning bør ligge inde de valgte koncentrationsintervaller.
    2. Vælg en passende DOE. Sådanne design kan findes i litteraturen, fxfra NIST/SEMATECH e-håndbogen af statistiske metoder (findes på www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm). Det valgte design afhænger af antallet af medier komponenter af interesse (her, 11), og antallet af udførte eksperimenter (her, 32). I eksemplet med given blev design "2IV11-6" valgt som resulterer i 32 eksperimenter og giver mulighed for vurdering af effekten af stigende koncentration af en af de elleve komponenter på mål af interesse. For at være mere specifik, er de vigtigste virkninger ikke forvirret med parvise faktor interaktioner. De kan blive beskæmmet med højere rækkefølge interaktioner, der dog sandsynligvis ikke betydelig.
    3. Bruge de resterende brønde (her, 16) til at udføre flere gentagelser med reference medium at vurdere reproducerbarhed af processen. Replikater bør være ligeligt fordelt over pladen til at opdage positionelle effekter. Middelværdien af de målte output fra reference eksperimenter er brugt til normalisering. Det vil sige, er hver målte output af følsomhedsanalysen opdelt på gennemsnitsværdien af reference output.
    4. Beregne største og om muligt de kombinatorisk effekter ved hjælp af relevante statistikker software. Det klassiske design af eksperimentet er baseret på en polynomisk tilnærmelse45. For eksempel, kan MATLAB funktion mvregress bruges til vurdering af de polynomiske koefficienter.
    Funktionen mvregress er en del af de statistikker og machine learning værktøjskasse.
  • Identificere relevante virkningerne af forskellige medier komponenter på mål ved hjælp af en t-test. I eksemplet, NH4+ har en betydelig negativ virkning, og Ca2 + og Mg2 + Vis de stærkeste positive virkninger (figur 5). Fordi normal god landbrugspraksis signal var normaliseret, koefficienterne, der repræsenterer den gennemsnitlige relative ændring i normal god landbrugspraksis signal når stigende koncentration af den konkrete komponent fra dens center værdi, Equation 7 , at dens maksimale værdi.
  • Faste komponenter uden en relevant effekt er på deres referenceværdi under optimeringen.

    • 3. iterativ optimering (figur 1: del C)

    Bemærk: værktøjet MATLAB KriKit blev brugt til fortolkning og statistiske data analyse36. KriKit tillader brugeren at konstruere en datastyret Kriging model. Denne Kriging model forudsiger funktionelle forholdet mellem medier komponenter og målet. Det indeholder også oplysninger om forudsigelse usikkerhed. Stor usikkerhed angiver støjende data og/eller utilstrækkelige data tæthed.

    1. DOE
      Bemærk: Nye eksperimenter er iterativt beregnet, baseret på resultaterne af den foregående opstille.
      1. I den første iteration, designe nye eksperimenter for detaljeret undersøgelse af identificerede medier komponenter af interesse. Eksperimentelle resultater fra sektion 2 kan ikke overføres til den iterative optimering (afsnit 3), som koncentrationen af komponenter uden relevant effekt er nu fastsat til den respektive referenceværdien. Derfor er eksperimenter fra følsomhedsanalysen og iterativ optimering ikke sammenlignelige.
      2. Ellers skal du følge den ordning, der er illustreret i figur 1, frame "Iterativ optimering". Hvis det optimale potentiale ligger inden for den fastlagte koncentrationsområde, er nye eksperimenter designet ved hjælp af den forventede forbedring40,46. Den eksperimentelle design baseret på den forventede forbedring er integreret i KriKit værktøjskasse. Hvis optimalt ligger på grænsen, udvide koncentrationsområde.
    2. Udføre eksperimenter på designet eksempelpunkterne efter eksperimentelle metoder, der er defineret i afsnit 2.
    3. Statistisk analyse
      1. Konstruere en Kriging model ved hjælp af den kombinerede data fra alle gentagelser, herunder aktuelt.
      2. Undersøge model output af visualisering ved hjælp af omfattende værktøjer af KriKit (2/3D interpolation, film analyse, screening plot, osv.).
    4. Hvis en optimal område blev anslået med tilstrækkelig nøjagtighed, stoppe optimering. Hvis ikke, du fortsætte med trin 3.1.
      Bemærk: Figur 6 illustrerer den iterative optimering for test-undersøgelse. Koncentrationsområde blev successivt udvidet indtil et plateau blev fundet (iteration 1-6). Den syvende iteration blev brugt til at udforske grænser nærmere.

    4. efterprøvning af resultater (figur 1: del D)

    Bemærk: Efter at have afsluttet den iterative optimering, de oprindelige antagelser skal kontrolleres for gyldighed.

    1. Redo følsomhedsanalyse (afsnit 2) for optimal medium sammensætning. Der er er koncentrationerne af komponenter, der er undersøgt i figur 1 (del C) fastgjort til deres optimale værdier. Koncentrationer af andre komponenter er varierede efter en passende DOE.
      Bemærk: Lignende resultater i både screeninger viser koncentrationsniveauer for de undersøgte komponenter ikke ændrer effekten af de andre komponenter. Hvis screeningen viser væsentlige forskelle på resultaterne fra del B, komponenter med en ændret virkning skal føjes til puljen af undersøgte komponenter og del C skal gentages.
    2. I tilfælde af indirekte måling (f.eks., fluorescens som indikator for produkt koncentration), anvende ortogonale måling metoder (fxaktivitet assay, Bradford eller BCA protein kvantificering, SDS side) til at bekræfte ændringen i mål af interesse ved at sammenligne resultaterne fra reference medium og optimeret medium15.

    Representative Results

    Den indførte protokol blev anvendt til at maksimere titer af udskilles normal god landbrugspraksis. Specifikt, normal god landbrugspraksis titer efter 17 h dyrkning blev valgt som optimering mål. Online fluorescens påvisning af normal god landbrugspraksis tilladt simpelt produkt kvantificering. Normalisering af normal god landbrugspraksis signal med data fra en reference dyrkning er imidlertid uomgængeligt at sikre reproducerbarhed og sammenlignelige resultater. En Forhåndsudvælgelse af medier komponenter blev udført på et rationelt grundlag, som beskrevet i afsnit 1. Eksperimenter blev udført ifølge vejledningen i afsnit 1: parametrene i de våde lab procedurer blev defineret for hele studiet at sikre konsistens og reproducerbarhed af resultaterne.

    Som beskrevet i afsnit 2, blev en indledende screening udført for at identificere relevante komponenter viser en betydelig indvirkning på optimering mål for yderligere og mere detaljerede studier. MTP-baseret MBR system giver mulighed for 48 forsøg skal udføres parallelt. Under hensyntagen til den maksimal mulige antal parallelle forsøg på en MTP (48) og det samlede antal medier komponenter (11) gør de 2IVdesign11-6 fraktioneret et passende valg. Denne eksperimentelle design består af 32 eksperimenter og giver mulighed for vurdering af de vigtigste virkning for hver af de undersøgte medier komponenter. De resterende dyrkning brønde (16) blev brugt til flere replikater af eksperimenter med reference medium for at vurdere reproducerbarhed og positionelle effekter. Dvs hvert eksperiment udføres én gang (ingen gentagelser), med undtagelse af referencen eksperiment (fem replikater).

    Tabel 1 sammenfatter resultaterne af screening analyse. I den pågældende koncentrationsområde udviste varierende størstedelen af media-komponenter ikke en mærkbar effekt på målet. Komponent NH4+ viser en stærk negativ virkning, mens Ca2 + og Mg2 + viser den stærkeste positive tendens. Effekten af Mg2 + er ikke signifikant for det aktuelle koncentrationsområde men kan være for et bredere koncentrationsområde. Derfor blev det besluttet at udelade NH4+ fra mediet og undersøge effekten af Ca2 + og Mg2 + i yderligere eksperimenter.

    Afsnit 3 beskriver den iterative optimering procedure, der er brugt til at maksimere normal god landbrugspraksis fluorescens signal mens varierende koncentrationer af Ca2 + og Mg2 +. I iteration 1, blev den hypotese, at NH4+ kan udelades testet. Koncentrationsområde for Ca2 + og Mg2 + blev vedtaget fra screening analyse. Den mindste koncentration af NH4+ blev sat til nul og den maksimale koncentration blev vedtaget fra screening eksperiment. I de følgende eksperimenter, blev komponent koncentrationer distribueret over et 3 x 3 x 3 gitter inde den fastlagte koncentrationsområde, resulterer i 27 eksperimenter. Under alle udlæg til planteavl, fem replikater af reference medium var inkluderet, der serveres som intern standard og for at sikre, at ingen positionelle virkninger over MTP opstod. For de resterende 16 brønde, blev koncentrationer af NH4+, Ca2 +og Mg2 + tilfældigt fordelt indenfor de givne områder.

    Figur 5 A visualiserer resultaterne af de første iterationer. Akseetiketter refererer til komponent bruges i den oprindelige reference medium, angivet ved x Ref. De blå overflader repræsenterer Kriging interpolation, der blev beregnet ved hjælp af KriKit software. Hver overflade er forbundet med en relativ koncentrationsniveau for NH4+ (mørk blå: 0 x Ref, ternet: 1 x Ref, lyseblå: 2 x Ref). Denne visuelle repræsentation afslører, at det er gunstigt at udelade NH4+. Interpolation overflader også vise de positive virkninger af både Mg2 + og Ca2 +, som alle fly stiger med stigende koncentrationer.

    Baseret på resultaterne af iteration 1, blev det besluttet at udvide koncentration vifte af Ca2 + og Mg2 + ved at fordoble de maksimale koncentrationer og flytte designvinduet eksperimentelle til øverste højre hjørne, se figur 5 B. inde i dette interval, koncentrationerne var fordelt på en 6 x 6-gitter. Dette sikrer en jævn fordeling over rækken fuld koncentration, hvilket fører til optimale Kriging interpolation resultater. Figur 5 B viser Kriging interpolation plot baseret på den kombinerede data målt i begge gentagelser (røde prikker og gul pladser). For begge, Ca2 + og Mg2 +, fortsætter den positive effekt af stigende deres koncentrationer. Derfor proceduren blev gentaget ved at fordoble den maksimale koncentration og dermed, designvinduet eksperimentelle blev flyttet til at udforske grænser i øverste højre hjørne.

    Figur 6 A en oversigt over de resterende optimering procedure. Analyse af indsamlede data op til iteration 3 afslørede en begrænsning af den positive effekt af Mg2 +, dvs, en optimal koncentration vifte af Mg2 + blev identificeret. Det blev derfor besluttet at udvide koncentrationsområde kun for Ca2 + (iteration 4). Denne procedure blev gentaget to gange (iteration 5 og 6) indtil en mætning af normal god landbrugspraksis signal blev fundet. Denne mætning kan forklares ved udfældning af Ca-salte de anvendte koncentrationer af Ca2 +, som ikke er tilgængelige til cellerne.

    Som eksperimentelle resultater er altid rystet af støj, den resulterende Kriging interpolation vises uregelmæssige og besigtigelse kan føre til forkerte konklusioner. Dog kan rækken optimal koncentration af medier komponenter for mættede normal god landbrugspraksis signalet identificeres pålideligt med den statistiske z -test, der er også implementeret i KriKit. Z -testen bruger direkte de iboende statistiske oplysninger, som den Kriging metode, dvs., forudsigelse værdier og forudsigelse usikkerheder. Figur 6 B viser det identificerede plateau, som bestemmes og visualiseret ved hjælp af KriKit værktøjskasse.KriKit værktøjskasse er frit tilgængelige36 og kommer med en detaljeret tutorial, der forklarer hvordan man bruger sine funktioner.

    Hvis mere end to relevante komponenter findes, når 3D-visualisering sin grænse. KriKit indeholder flere andre mulige visuel repræsentation metoder såsom film eller "screening plot". Hvis det optimale potentiale ligger inden for den fastlagte koncentrationsområde, designet nye eksperimenter automatisk ved hjælp af den forventede forbedring40,46. Den eksperimentelle design baseret på den forventede forbedring er integreret i KriKit værktøjskasse. Mere detaljerede oplysninger kan findes i softwaredokumentationen.

    Efter den iterative procedure, blev en bekræftelse af resultaterne gennemført, som beskrevet i del D. Gyldigheden af oprindelige antagelser blev kontrolleret ved at udføre en ekstra følsomhedsanalyse ved hjælp af den optimale medium sammensætning. Det vil sige alle oprindelige medier komponenter af interesse var varierede, men Ca2 + og Mg2 + var placere hen til deres optimal koncentrationsniveauer. I denne undersøgelse, de optimale koncentrationer Equation 8 = 32 x Ref og Equation 9 = 6,8 x Ref blev valgt. Tabel 2 viser resultaterne af valideringen screening. I lighed med den oprindelige følsomhed screening (jf. tabel 1), NH4+ stadig har en betydelig negativ indflydelse og resterende effekter er stadig ubetydelig.

    På grund af nem adgang, blev normal god landbrugspraksis fluorescens signal fra dyrkning suspension brugt til at kvantificere de ekstracellulære normal god landbrugspraksis titer under alle eksperimenter. Verifikation grunde, blev normal god landbrugspraksis fluorescens valideret mod andre målinger. Fordi normal god landbrugspraksis er udskilles via Tat-vej, kan ikke fluorescens signal diskriminere mellem intra- og ekstracellulært normal god landbrugspraksis. Således blev udlæg til planteavl gengivet ved hjælp af reference medium og optimeret medium. Udover fluorescens målingen fra celle-fri dyrkning analysere proteinindhold var kvantificeres ved Bradford assay og (semi)-normal god landbrugspraksis kvalitativt visualiseret ved SDS-Page15. Alle deraf følgende måling signaler var cirka fordoblet for udlæg til planteavl med optimeret medium i forhold til reference medium og valideret de ca 100% forbedring af optimeret medium sekretion ydeevne. Normal god landbrugspraksis specifikke fluorescens af dyrkning suspension kan derfor betragtes som en egnet metrik for optimering mål, dvs., de ekstracellulære normal god landbrugspraksis titer.

    Figure 2
    Figur 2 : Skærmbillede fra listen volumen pipettering for følsomhedsanalyse. Poster i den første kolonne tildele et entydigt id til alle diskenheder på en række; dette id er MTP godt antal mål dyrkning MTP på flydende handleren arbejdsbord, jf. figur 4C. Resterende kolonner indkode diskenheder for forskellige løsninger ("Sln-01" til "Sln-15") for at være pipetted. Den akkumulerede volumen af en række svarer til den endelige dyrkning volumen af den tilsvarende godt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 3
    Figur 3 : Skærmbillede fra væsken håndtering kontrol software "WinPREP". Venstre: Række-bestilt kommandoer, herunder en overførsel kommando for hver stamopløsning at være pipetted. Før den sidste kommando for inokulum tilsætning indsættes en bruger prompt for at sikre frø kulturen placeres på bordet lige i tide. Højre: Skematisk af arbejdsbord, herunder kilde labware for Variation aktier (to dyb brønd plader med 12 kolonne-lignende wells), reagens lavpunktet for resten Stock, vand og inokulum og medier forberedelse target dyrkning MTP. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 4
    Figur 4 : Udarbejdelse af detaljerede screenshots for opsætning af pipettering af en stamopløsning. (A) uindpakkede kommando for Pipettering af Fe lager. Kilde labware og kilde godt er inden for markeret på arbejdsbord med Læs ramme og røde kolonne med den tilsvarende dyb brønd plade. Rejsemål labware og bestemmelsessted brønde i er markeret med blå ramme rundt og blå wells af target dyrkning MTP. (B) detaljeret eksempel syn på tildeling af pipettering diskenheder til dette trin (Fe stamopløsning). Antallet af destinationer er læst fra listen pipettering, der har 48 rækker. Dispensere-diskenheder for alle destination brønde for Fe stamopløsning findes i kolonne 4 i listen pipettering. Bemærk at den første kolonne i listen pipettering indeholder id'er og ikke mængder overføres, se figur 2. (C) nærmere oplysninger om destination godt nummerering. Bind skrevet i #1 række og den tilsvarende pipettering liste vil blive pipetted ind i godt markeret som #1 og så videre. Brønde #01, #08, #41 og #48 svarer til brønde A01, A08, F01 og F08 til alpha-numerisk kodning, som er også trykt i dyrkning MTP selv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 5
    Figur 5 : Detaljerede resultater fra den første iteration. (A) Kriging interpolation baseret på forsøgsdata for iteration 1. Røde prikker angiver datasættet. Til sammenligning, alle tre interpolation overflader er overlagt i et plot (mørkeblå: 0 x Ref, ternet: 1 x Ref, lyseblå: 2 x Ref). En alternativ repræsentation af resultaterne kan findes andetsteds15. (B) Kriging interpolation baseret på eksperimenterne udført i iteration 1 (røde prikker) og iteration 2 (gul pladser).Dele af de data, der præsenteres i denne figur har været tidligere udgivet15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 6
    Figur 6 : Skildring af iterativt indsamlede optimering resultater. (A) Endelig Kriging model forudsigelse. (B) statistiske identifikation af optimal område (rød) baseret på den statistiske z-test, som er fastsat af KriKit. Kasser angive successive trin af iterative design og udførelse af eksperimenter. Dele af de data, der præsenteres i denne figur har været tidligere udgivet15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Komponent Normaliserede koefficient middelværdien
    Fe2 + -0.08
    MN2 + -0.05
    Zn2 + -0.21
    Cu2 + -0.21
    NH4+ -2.04
    Ni2 + -0.11
    Co2 + -0.10
    MoO42- 0,03
    BO33- 0,06
    Ca2 + 1,00
    Mg2 + 0,45

    Tabel 1: resultaterne af følsomhedsanalysen. Koefficient værdier repræsenterer den gennemsnitlige effekt, når de respektive medier komponent koncentration fra dens center værdi til sin maksimale værdi. For optimal eksperimentelle design, som standard litteraturen og bruges her, standardafvigelse repræsenterer direkte eksperimentel variation på grund af replikering af reference eksperiment. Koefficient værdier var normaliseret efter maksimal værdi (0.0422 for komponenten Ca2 +). Normaliserede og absolut koefficient standardafvigelse er 0,54 og 0.0226, henholdsvis.

    Komponent Normaliserede koefficient middelværdien
    Fe2 + -1.00
    MN2 + 1,00
    Zn2 + -3.48
    Cu2 + -0.52
    NH4+ -15.95
    Ni2 + 0,69
    Co2 + -0.51
    MoO42- -0.45
    BO33- -1.11

    Tabel 2: resultatet af den sidste følsomhedsanalyse. Koefficient værdier repræsenterer den gennemsnitlige effekt, når de respektive medier komponent koncentration fra dens center værdi til sin maksimale værdi. Som en optimal eksperimentelle design blev brugt, afhænger standardafvigelsen kun eksperimentel variation ved hjælp af optimeret medium sammensætning. Eksperimentel variation steg svagt i forhold til variationen ved hjælp af reference medium. Koefficient værdier var normaliseret efter maksimal værdi (0.0106 for komponent Mn2 +). Normaliserede og absolut koefficient standardafvigelse er 3.63 og 0.0385, henholdsvis.

    Discussion

    Den generiske karakter af præsenteres protokollen tillader forskellige tilpasninger, f.eks.for at studere andre mikrobielle udtryk værter9,47,48,49,50, 51, eller at optimere andre egenskaber af target proteinet, ligesom glykosylering mønster eller disulphide obligationer. Protokollen skal muligvis også tilpasses til den tilgængelige lab udstyr. Integration af en MBR system giver mulighed for øget eksperimentelle overførselshastighed, som giver mulighed for store besparelser i tid. Dog, når du udskifter fuldt instrumenterede og kontrollerbar bioreaktorer af MBR systemer, skalerbarhed af resultater skal tages i betragtning8,37,52,53. Brugen af DOE metoder og matematisk modellering hjælper med at maksimere informationsindhold måleresultater, for så vidt angår de studerede objektive54 af effektiv eksperimentelle planlægning og model-baserede data fortolkning15.

    Ændringer til metoden
    Ved siden af multi-purpose og udvidelige robot flydende håndteringssystemer som den, der anvendes i denne undersøgelse, bør det nævnes at der er flere mindre væske håndteringssystemer kommercielt tilgængelige som er i stand til at udføre denne opgave og kan placeres inde i af laminar flow arbejde bænke. Hvis ingen automatiserede pipettering system er tilgængelig, kan forskellige medier kompositioner planmæssigt DOE også realiseres ved manuel pipettering ved hjælp af enkelt og/eller multi-kanal pipetter. Da den manuelle forberedelse er mere fejlbehæftet og vil kræve meget fokuseret arbejde i ganske lang tid, anbefales det at forberede et lavere antal forskellige medier kompositioner.

    Afhængigt af den erhvervsdrivende MBR system egenskaber vil tilsvarende dyrkning protokollen variere. For eksempel, hvis nogen online måling af biomasse dannelse er tilgængelig, kan det være tilstrækkeligt at måle biomasse koncentration efter afslutningen af vækst eksperiment. I kombination med online overvågning af pH og oploest ilt, som er gennemført i flere MBR systemer, vækst mætning kan bestemmes sikkert. I princippet kan vækst eksperimenter foretages i MTPs alene placeret inde ryster væksthuse, uden brug af en MBR system. I dette tilfælde korrekt dyrkning betingelser skal sikres: (1) ilt-limited udlæg til planteavl kan undgås ved hjælp af MTPs med passende geometrier, i kombination med ordentlig ryster frekvenser og ryster diametre, fx, pladsen 96 eller 24 dyb godt plader drives ved 1000 rpm på 3 mm kaste eller på 250 rpm på 25 mm kast, henholdsvis. Vigtigere, jo lavere overførselshastighed kan opnås maksimal ilt, jo lavere vigtigste CO2-kilde skal være koncentreret. Som nævnt ovenfor, for denne undersøgelse, var anvendelse af 10 g/L glucose egnet til at forhindre ilt begrænsning for de erhvervsdrivende dyrkning betingelser; (2) prøveudtagningen MTP kulturer for biomasse og produkt kvantificering bør reduceres til et minimum. Hver gang MTP er fjernet fra ryster rugemaskine ilt overførsel vil straks opdeling som kan resultere i ugunstige dyrkning betingelser; (3) i udtalelsen fra forfatterne, er brugen af MTP læsere som dyrkning enheder anbefales ikke som disse enheder ikke er udviklet til dette formål. For eksempel, ryster mekanik blev bygget for lejlighedsvise blanding af mikroplader efter reagens tilsætning og ofte mangler derfor, robusthed for langture af kontinuerlig ryster varig for dage. Derudover kan ikke tilstrækkelig power input, der kræves for mikrobiel udlæg til planteavl realiseres i disse læsere. Integrationen af absorbansaflæsningerne i korte tidsintervaller kræver standsning af de rystende bevægelse, resulterer i gentagne perioder af ilt begrænsning. Derudover vil fordampning i sådanne systemer over lange dyrkning perioder fordreje resultater. For flere detaljer om den overraskende kompleks emne på ved hjælp af MTPs for mikrobiel udlæg til planteavl, henvises læseren til at de citerede litteratur22,23,24,25,26 og referencer heri.

    Yderligere overvejelser
    At speed-up iterativ optimering trin anbefales det at omhyggeligt vælge analysemetode for produkt kvantificering. Hurtige og enkle metoder bør foretrækkes på bekostning af præcision og nøjagtighed, da iterative eksperimentelle design strategi tolererer eksperimentelle unøjagtighed. Dog skal de endelige resultater kontrolleres mod tilstrækkeligt præcise og nøjagtige produkt kvantificering metoder, der kan være mere kompliceret. I almindelighed, omhyggelig vurdering og beslutningstagning om undersøgelse procedurer kræver indsats i begyndelsen af undersøgelsen, men betale i det lange løb efter rutinemetoder har opstillet.

    Det anbefales stærkt at definere en reference eksperiment, der er i forhold til alle eksperimenter under optimeringen. Det vil sige, er den anvendte medium komponent koncentrationer samt målte output normaliseret via dividere med referenceværdier. På denne måde, hver gælder og målte værdi kan fortolkes som x-fold af referenceværdien. For at tage til variationer mellem pladerne, udføres fem reference forsøg på hver plade. Middelværdien af de målte udfald bruges til normalisering.

    Det kan generelt ikke garanteres, at den udviklede medium er også optimal til andre stammer. Dog vil forbedret medium højst sandsynligt også være passende til at dyrke udtryk stammer med små genetiske forskelle, f.eks., når producerer enzym varianter med enkelt aminosyre udskiftninger opnået fra mutagenese undersøgelser ( Selvom endnu enkelt punkt mutationer har betegnet effekt cellulære metabolisme og Heterolog ekspression ydeevne55,56). I dette tilfælde kan den præsenteres protokol være et første skridt, efterfulgt af protokoller for høj overførselshastighed udtryk screeninger57. Hvis protokollen bruges til mellemstore udvikling med efterfølgende opskalering til fed-batch udlæg til planteavl, bør optimeret medium efterprøves i forhold til de tilsvarende bioproces, som klon screening kampagner på individuel identificeret forskellige top kunstnere til forskellige fodringsstrategier og dyrkning media52,58. Derudover kan de indførte KriKit36 generelt bidrage til forbedret holistisk bioproces optimering.For nylig blev værktøj evner udvides også understøtter multi objektive optimering40, hvilket kan være vigtigt for at optimere både opstrøms og nedstrøms processer59,60.

    Disclosures

    Forfatterne har ikke noget at oplyse.

    Acknowledgments

    De videnskabelige aktiviteter af Bioeconomy Science Center blev økonomisk støttet af Ministeriet for Innovation, videnskab og forskning som led i NRW-Strategieprojekt BioSC (nr. 313/323-400-002 13). Forfatterne takke Ministeriet for Innovation, videnskab, og forskning i Nordrhein-Westfalen og Heinrich Heine Universitet Düsseldorf for et stipendium til Lars Freier inden for CLIB-kandidat klynge industriel bioteknologi. Yderligere finansiering blev modtaget fra aktivering rum Program "Helmholtz Innovation Labs" af tyske Helmholtz Association til at støtte den "mikrobiel bioproces Lab – A Helmholtz Innovation Lab".

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BioLector m2p-labs G-BL-100
    Flowerplate m2p-labs MTP-48-BOH For cultivation in the BioLector device
    Sealing foil m2p-labs F-GP-10 Sterile sealing for Flowerplate
    MATLAB Mathworks 2016b
    KriKit Forschungszentrum Jülich n/a Freely available, MATLAB installation required
    Janus pipetting robot Perkin Elmer n/a Includes "WinPrep" software installation
    12-column deep well microplate E&K Scientific EK-2034 Container for medium stock solutions
    96 well microplates, transparent, F-bottom Greiner 655101 For Bradford protein assay
    µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom Greiner 655087 For flourescence measurement in cell-free supernatants
    Pipette Research plus multi-channel pipettes Eppendorf n/a Facilitates manual liquid handling with microplates
    TruPAG Precast Gels Sigma PCG2002 For SDS-Page analysis of cell-free supernantants
    Bradford Reagent Sigma B6916
    C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP n/a n/a Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Choi, J. -M., Han, S. -S., Kim, H. -S. Industrial applications of enzyme biocatalysis: Current status and future aspects. Biotechnol Adv. 33 (7), 1443-1454 (2015).
    2. Li, S., Yang, X., Yang, S., Zhu, M., Wang, X. Technology Prospecting on Enzymes: Application, Marketing and Engineering. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), (2012).
    3. Adrio, J. L., Demain, A. L. Microbial enzymes: tools for biotechnological processes. Biomolecules. 4 (1), 117-139 (2014).
    4. Yim, S. S., An, S. J., Kang, M., Lee, J., Jeong, K. J. Isolation of fully synthetic promoters for high-level gene expression in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 2959-2969 (2013).
    5. Hemmerich, J., et al. Use of a Sec signal peptide library from Bacillus subtilis.for the optimization of cutinase secretion in Corynebacterium glutamicum. Microb Cell Fact. 15 (1), 208 (2016).
    6. Wendisch, V. F. Microbial production of amino acids and derived chemicals: synthetic biology approaches to strain development. Curr Opin Biotechnol. 30, 51-58 (2014).
    7. Lee, J. -Y., Na, Y. -A., Kim, E., Lee, H. -S., Kim, P. The Actinobacterium Corynebacterium glutamicum, an Industrial Workhorse. J Microbiol Biotechnol. 26 (5), 807-822 (2016).
    8. Rohe, P., Venkanna, D., Kleine, B., Freudl, R., Oldiges, M. An automated workflow for enhancing microbial bioprocess optimization on a novel microbioreactor platform. Microb Cell Fact. 11 (1), 144 (2012).
    9. Liu, X., et al. Expression of recombinant protein using Corynebacterium glutamicum.: progress, challenges and applications. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 652-664 (2016).
    10. Freudl, R. Corynebacterium glutamicum as a Platform Organism for the Secretory Production of Heterologous Proteins. Corynebacterium glutamicum: From systems biology to biotechnological applications. Burkovski, A. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. 161-177 (2015).
    11. Yim, S. S., et al. Development of a new platform for secretory production of recombinant proteins in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 113 (1), 163-172 (2015).
    12. Limberg, M. H., et al. Metabolic profile of 1,5-diaminopentane producing Corynebacterium glutamicum under scale-down conditions: Blueprint for robustness to bioreactor inhomogeneities. Biotechnol Bioeng. 114 (3), 560-575 (2016).
    13. Käβ, F. Assessment of robustness against dissolved oxygen/substrate oscillations for C. glutamicum DM1933 in two-compartment bioreactor. Bioprocess Biosyst Eng. 37 (6), 1151-1162 (2014).
    14. Teramoto, H., Watanabe, K., Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. High yield secretion of heterologous proteins in Corynebacterium glutamicum.using its own Tat-type signal sequence. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 677-687 (2011).
    15. Freier, L., Hemmerich, J., Schöler, K., Wiechert, W., Oldiges, M., von Lieres, E. Framework for Kriging-based iterative experimental analysis and design: Optimization of secretory protein production in Corynebacterium glutamicum. Eng Life Sci. 16 (6), 538-549 (2016).
    16. Huber, R., Roth, S., Rahmen, N., Büchs, J. Utilizing high-throughput experimentation to enhance specific productivity of an E. coli. T7 expression system by phosphate limitation. BMC Biotechnol. 11 (1), 22 (2011).
    17. Kottmeier, K., Müller, C., Huber, R., Büchs, J. Increased product formation induced by a directed secondary substrate limitation in a batch Hansenula polymorpha culture. Appl Microbiol Biotechnol. 86 (1), 93-101 (2010).
    18. Kennedy, M. J., Krouse, D. Strategies for improving fermentation medium performance: A review. J Ind Microbiol Biotechnol. 23 (6), 456-475 (1999).
    19. Kleman, G. L., Strohl, W. R. Developments in high cell density and high productivity microbial fermentation. Curr Opin Biotechnol. 5 (2), 180-186 (1994).
    20. Jones, R., Gadd, G. Ionic nutrition of yeast: Physiological mechanisms involved and implications for biotechnology. Enzy Microb Technol. 12 (6), 402-418 (1990).
    21. Zhang, J., Greasham, R. Chemically defined media for commercial fermentations. Appl Microbiol Biotechnol. 51 (4), 407-421 (1999).
    22. Kensy, F., et al. Oxygen transfer phenomena in 48-well microtiter plates: Determination by optical monitoring of sulfite oxidation and verification by real-time measurement during microbial growth. Biotechnol Bioeng. 89 (6), 698-708 (2005).
    23. Hermann, R., Lehmann, M., Büchs, J. Characterization of gas-liquid mass transfer phenomena in microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 81 (2), 178-186 (2002).
    24. Duetz, W. A. Microtiter plates as mini-bioreactors: Miniaturization of fermentation methods. Trends Microbiol. 15 (10), 469-475 (2007).
    25. Funke, M., Diederichs, S., Kensy, F., Müller, C., Büchs, J. The baffled microtiter plate: Increased oxygen transfer and improved online monitoring in small scale fermentations. Biotechnol Bioeng. 103 (6), 1118-1128 (2009).
    26. Lattermann, C., Funke, M., Hansen, S., Diederichs, S., Büchs, J. Cross-section perimeter is a suitable parameter to describe the effects of different baffle geometries in shaken microtiter plates. J Biol Eng. 8, 18 (2014).
    27. Samorski, M., Müller-Newen, G., Büchs, J. Quasi-continuous combined scattered light and fluorescence measurements: A novel measurement technique for shaken microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 92 (1), 61-68 (2005).
    28. Kensy, F., Zang, E., Faulhammer, C., Tan, R. -K., Büchs, J. Validation of a high-throughput fermentation system based on online monitoring of biomass and fluorescence in continuously shaken microtiter plates. Microb Cell Fact. 8 (1), 31 (2009).
    29. Puskeiler, R., Kaufmann, K., Weuster-Botz, D. Development, parallelization, and automation of a gas-inducing milliliter-scale bioreactor for high-throughput bioprocess design (HTBD). Biotechnol Bioeng. 89 (5), 512-523 (2005).
    30. Bareither, R., Pollard, D. A review of advanced small-scale parallel bioreactor technology for accelerated process development: Current state and future need. Biotechnol Prog. 27 (1), 2-14 (2011).
    31. Hortsch, R., Stratmann, A., Weuster-Botz, D. New milliliter-scale stirred tank bioreactors for the cultivation of mycelium forming microorganisms. Biotechnol Bioeng. 106 (3), 443-451 (2010).
    32. Isett, K., George, H., Herber, W., Amanullah, A. Twenty-four-well plate miniature bioreactor high-throughput system: Assessment for microbial cultivations. Biotechnol Bioeng. 98 (5), 1017-1028 (2007).
    33. Motta Dos Santos, L. F., Coutte, F., Ravallec, R., Dhulster, P., Tournier-Couturier, L., Jacques, P. An improvement of surfactin production by B. subtilis BBG131 using design of experiments in microbioreactors and continuous process in bubbleless membrane bioreactor. Bioresour Technol. 218, 944-952 (2016).
    34. Islam, R. S., Tisi, D., Levy, M. S., Lye, G. J. Framework for the Rapid Optimization of Soluble Protein Expression in Escherichia coli Combining Microscale Experiments and Statistical Experimental Design. Biotechnol Prog. 23 (4), 785-793 (2007).
    35. Huber, R., et al. Robo-Lector: A novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb Cell Fact. 8 (1), 42 (2009).
    36. Freier, L., von Lieres, E. Kriging toolKit (KriKit). , Available from: https://github.com/modsim/KriKit (2017).
    37. Kensy, F., Engelbrecht, C., Büchs, J. Scale-up from microtiter plate to laboratory fermenter: evaluation by online monitoring techniques of growth and protein expression in Escherichia coli.and Hansenula polymorpha fermentations. Microb Cell Fact. 8 (1), 68 (2009).
    38. Lu, C., Bentley, W. E., Rao, G. A high-throughput approach to promoter study using green fluorescent protein. Biotechnol Prog. 20 (6), 1634-1640 (2004).
    39. Zanzotto, A., Boccazzi, P., Gorret, N., van Dyk, T. K., Sinskey, A. J., Jensen, K. F. In situ measurement of bioluminescence and fluorescence in an integrated microbioreactor. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 40-47 (2006).
    40. Freier, L., von Lieres, E. Multi-Objective Global Optimization (MOGO): Algorithm and Case Study in Gradient Elution Chromatography. Biotechnol J. , (2016).
    41. Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum.: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J Bacteriol. 175 (17), 5595-5603 (1993).
    42. Weuster-Botz, D., Kelle, R., Frantzen, M., Wandrey, C. Substrate Controlled Fed-Batch Production of L-Lysine with Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Prog. 13 (4), 387-393 (1997).
    43. Meissner, D., Vollstedt, A., van Dijl, J. M., Freudl, R. Comparative analysis of twin-arginine (Tat)-dependent protein secretion of a heterologous model protein (GFP) in three different Gram-positive bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 76 (3), 633-642 (2007).
    44. Morschett, H., Wiechert, W., Oldiges, M. Automation of a Nile red staining assay enables high throughput quantification of microalgal lipid production. Microb Cell Fact. 15, 34 (2016).
    45. Fisher, R. A. The design of experiments. , Oliver & Boyd. Edinburgh. (1935).
    46. Morschett, H., Freier, L., Rohde, J., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. A framework for accelerated phototrophic bioprocess development: Integration of parallelized microscale cultivation, laboratory automation and Kriging-assisted experimental design. Biotechnol Biofuels. 10, 26 (2017).
    47. Le Loir, Y., et al. Protein secretion in Lactococcus lactis: An efficient way to increase the overall heterologous protein production. Microb Cell Fact. 4 (1), 2 (2005).
    48. Anné, J., Vrancken, K., van Mellaert, L., van Impe, J., Bernaerts, K. Protein secretion biotechnology in Gram-positive bacteria with special emphasis on Streptomyces lividans. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1750-1761 (2014).
    49. Gupta, S. K., Shukla, P. Advanced technologies for improved expression of recombinant proteins in bacteria: perspectives and applications. Crit Rev Biotechnol. 36 (6), 1089-1098 (2016).
    50. Fu, L. L., Xu, Z. R., Li, W. F., Shuai, J. B., Lu, P., Hu, C. X. Protein secretion pathways in Bacillus subtilis: implication for optimization of heterologous protein secretion. Biotechnol Adv. 25 (1), 1-12 (2007).
    51. Yoon, S., Kim, S., Kim, J. Secretory Production of Recombinant Proteins in Escherichia coli. Rec Pat Biotechnol. 4 (1), 23-29 (2010).
    52. Hemmerich, J., et al. Comprehensive clone screening and evaluation of fed-batch strategies in a microbioreactor and lab scale stirred tank bioreactor system: application on Pichia pastoris producing Rhizopus oryzae lipase. Microb Cell Fact. 13 (1), 36 (2014).
    53. Glazyrina, J., Krause, M., Junne, S., Glauche, F., Strom, D., Neubauer, P. Glucose-limited high cell density cultivations from small to pilot plant scale using an enzyme-controlled glucose delivery system. New Biotechnol. 29 (2), 235-242 (2012).
    54. Gernaey, K. V., et al. Monitoring and control of microbioreactors: An expert opinion on development needs. Biotechnol J. 7 (10), 1308-1314 (2012).
    55. Rahmen, N., Fulton, A., Ihling, N., Magni, M., Jaeger, K. -E., Büchs, J. Exchange of single amino acids at different positions of a recombinant protein affects metabolic burden in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 14, 10 (2015).
    56. Rahmen, N., et al. A particular silent codon exchange in a recombinant gene greatly influences host cell metabolic activity. Microb Cell Fact. 14, 156 (2015).
    57. Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in E. coli. J Vis Exp. (89), e51464 (2014).
    58. Scheidle, M., et al. High-throughput screening of Hansenula polymorpha clones in the batch compared with the controlled-release fed-batch mode on a small scale. FEMS Yeast Res. 10 (1), 83-92 (2010).
    59. Baumann, P., Bluthardt, N., Renner, S., Burghardt, H., Osberghaus, A., Hubbuch, J. Integrated development of up- and downstream processes supported by the Cherry-Tag™ for real-time tracking of stability and solubility of proteins. J Biotechnol. 200, 27-37 (2015).
    60. Baumann, P., Hahn, T., Hubbuch, J. High-throughput micro-scale cultivations and chromatography modeling: Powerful tools for integrated process development. Biotechnol Bioeng. 112 (10), 2123-2133 (2015).

    Tags

    Bioteknologi spørgsmålet 130 Design af eksperimenter kriging lab automation flydende håndtering robot mikrotiter plade microbioreactor Corynebacterium glutamicum heterolog protein sekretion ernæring media optimering
    Generisk protokol for optimering af heterolog Protein produktion ved hjælp af automatiserede Microbioreactor teknologi
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, … More

    Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (130), e56234, doi:10.3791/56234 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter