Beredning av Keratin hydrolysat från kyckling fjädrar och dess tillämpning i kosmetika

Summary

Syftet med protokollet är att förbereda keratin hydrolysat från kyckling fjädrar av alkaliska-enzymatisk hydrolys och testa om att lägga till keratin hydrolysat in en kosmetika salva bas förbättrar hudens barriär (skärper återfuktning och minskande transepidermal vattenförlust). Tester utförs på män och kvinna volontärer.

Abstract

Keratin hydrolysat (KHs) är etablerad standard komponenter i kosmetik för hår. Det är fördelaktigt för hudvård kosmetika att förstå mjukgörande effekterna av KH. Målen i protokollet är: (1) att behandla kyckling fjädrar till KH alkaliska-enzymatisk hydrolys och rena det genom dialys, och (2) för att testa om att lägga till KH i en salva bas (OB) ökar återfuktning av huden och förbättrar hudens barriär av minskande Transepidermal vattenförlust (TEWL). Under alkaliska-enzymatisk hydrolys inkuberas fjädrar först vid en högre temperatur i alkalisk miljö och sedan, under milda förhållanden, hydrolyseras med proteolytiska enzym. Lösningen av KH är dialyseras, vakuum torkas och mals till ett fint pulver. Kosmetiska formuleringar bestående av olja i vatten emulsion (O/W) innehållande 2, tillagas 4 och 6 vikt % av KH (baserat på vikt OB). Testa de fuktgivande egenskaperna hos KH utförs på 10 män och 10 kvinnor med intervall på 1, 2, 3, 4, 24 och 48 h. testad beredningar sprids på avfettade volar underarmen platser. Återfuktningen av hornlagrets (stratum Corneum) bedöms genom att mäta kapacitans i huden, som är en av de mest world-wide används och enkla metoderna. TEWL bygger på att mäta mängden vatten som transporteras per ett definierat område och tid från huden. Båda metoderna är helt icke-invasiv. KH gör för en utmärkt ocklusiv; beroende på tillägg av KH i OB medför det en minskning med 30 procent av TEWL efter applicering. KH fungerar även som ett Fuktighetsbevarande medel, eftersom det binder vatten från de lägre skikten av epidermis till SC; vid optimal KH tillägg i OB inträffar upp till 19% ökning av återfuktning i män och 22% ökning av kvinnor.

Introduction

Slakterier, livsmedelsindustrin och garveriindustrin producerar årligen enorma mängder av solid keratin biprodukter – ull, fjädrar, borst, hovar, klor, horn och liknande. Enligt de senaste statistiska uppgifterna är den totala levande vikten av kycklingar, kalkoner, ankor och andra slaktade fjäderfän i USA 62,5 miljarder pounds per år¹; i EU är det cirka 28,7 miljarder pounds per år. Med tanke på att fjädrar upp till 8,5% av totala fjäderfä vikt, producerar USA ensam årligen ca 5,3 miljarder pounds av avfall fjädrar².

Keratin är ett protein som uppvisar hög kemisk resistens eftersom det är starkt korslänkad med disulfidbryggor som återger dess bearbetning svårt. Att erhålla vattenlösliga produkter kräver klyva tvärbindningar och eventuellt utföra hydrolys av peptidbindningar³. Klyvning av disulfide broar kan fortsätta genom en reaktion av tiol anjon enligt följande mönster^4,5:

S_en^– + – S_bS_c– ↔ – S_b^– + – S_enS_c^–

Med ett mycket högt pH-nivå visas hydrolys av disulfide broar också, enligt det mönster⁶

– SS^– , OH^– → – S^– + – SOH

Under milda förhållanden (pH ca 8) rum även sulfitolysis äger enligt följande mönster:

– SS – + HSO₃^– → – SH + – SSO₃^–

Det mest ekonomiska sättet att förnedrande keratin är mikrobiell nedbrytning, som kännetecknas av mild reaktion villkor under bearbetning och höga nedbrytningen effektivitet (ca 90%)^7,8. Keratinases produceras av vissa bakterier som isolerats från jord och keratin avfall⁹. Mikrobiella keratinases hydrolyserar styvt och starkt korslänkad keratin strukturer¹⁰ och den resulterande KH beredd är rik på lösliga proteiner, utan förlust i essentiella aminosyror som upptäckts i det¹¹.

För att införliva ett protein i kosmetiska preparat (t.ex., emulsioner, krämer och geler), kraven se till att sådana proteiner är lösliga i vatten, de givna system är transparent och att åter aggregering av peptiderna undviks tack vare hydrofoba interaktioner. Därför är en gemensam praxis att tillämpa hydrolysat av proteiner, såsom hydrolyserat kollagen, elastin och keratin. När du lägger hydrolysat i kosmetiska emulsioner, åtgärder för att säkerställa att Hydrolysatet löses först i vatten. I vissa fall är det önskvärt att proteinet (eller Hydrolysatet) är lösliga i alkohol eller andra organiska lösningsmedel¹².

KH är normalt med i schampo, balsam, lotion och närande serum för hår, samt mascara, nagellack och eye make-up agenter. KH effekterna förklarat brukar inkludera bildar en skyddande film, jämna ut håret eller nail struktur, ökad plasticitet och utseende av behandlade bildandet, reglera konsistensen av produkter, och att uppmuntra bildandet av skum^{13 , 14}. det har också visat att KH minskar ytspänningen, därav tillskott i kosmetika kan underlätta nedsättning av emulgeringsmedel lagt till att stabilisera krämer. KH begränsa effekterna av irritation som utlöses av rengöringsmedel (tensider) till hud, ögon och hår, vilket minskar eventuella biverkningar av rengöringsmedel på vävnad (t.ex., det uttorkning av huden, hårdhet, och nedsatt barriärfunktion av huden). Den höga buffring kapaciteten av hydrolysat utnyttjas också för att stabilisera pH-värdet i kosmetika; peptider av kortare längd har en större buffert effekt^15,16. Även om KHs har etablerat sig som standardkomponenter i hår och Nagel kosmetika samt utnyttjades i produkter för hudvård, studier av återfuktande effekten av KH inte visas i samtida litteratur.

Alkaline-enzymatisk teknik har utvecklats för bearbetning keratin biprodukter till KH och aktiv testning pågår på effekterna av ett antal kosmetiska tillsatsämnen^{17,18,19,20 , 21 , 22}. fördelen med tvåstegs alkaliska-enzymatisk hydrolys med mikrobiell proteaser för kyckling fjädrar uppnår hög effektivitet under mild reaktion villkor och kvaliteten på KH är mycket hög i motsats till hydrolys sysselsatt i starka syror eller alkalier. I den första etappen inkuberas fjädrar vid en högre temperatur i alkalisk miljö, som delvis stör strukturen keratin och sväller fjädrar; efter justering pH, är fjädrarna hydrolyserat med ett proteolytiskt enzym under milda förhållanden i den andra etappen. Dialyzed KH besitter en hög halt av proteiner.

Tillämpningen av den metod som beskrivs här är bearbetning fjäderfä fjädrar till en KH genom alkaliska-enzymatisk hydrolys och testa effekten av återfuktande egenskaper hos KH tillämpas på O/W kosmetiska emulsion. De fuktgivande egenskaperna utreds av instrumental icke-invasiva metoder i vivo. De vanligaste metoderna för att mäta hudens återfuktning och barriär-funktion för SC inkluderar mätning av elektriska egenskaper hos huden (konduktans eller kapacitans). Olika metoder för att undersöka SC återfuktning inkluderar nära infraröd Multispektrala föreställa metod (NIM), kärnmagnetisk resonans, optisk koherenstomografi eller övergående termotransfer²³. Barriär-funktion för SC korrelerar till TEWL av SC och mätas det av ventilerade kammare metod, ovädrade chamber metoden och öppen kammare metod²⁴.

Egenskaper av modell formuleringar bestäms med Multi sonden adapter MPA 5 med tre typer av sonder. Den första corneometer CM 825, åtgärder hud återfuktning genom att bedöma förändringar i den elektriska kapaciteten av hudens yta; mäta kondensatorn visar förändringar i kapacitans av hudytan i corneometric enheter. Corneometer ger endast en relativ bedömning av huden återfuktning²⁵. För TEWL används andra sonden, Tewametern TM 300, för att mäta täthetlutningen av vattenavdunstning (i en öppen kammare instrument baserat på Ficks diffusion lag) från huden indirekt av de två par av sensorer (temperatur och relativ fuktighet) som anger mängden vatten som transporteras per ett definierat område och tidsperiod (g/m2/h). Denna metod kan upptäcka även de minsta störningar av hudens barriär funktion²⁶. Huden pH är en indikator av barriären och anti-mikrobiella funktion för SC²⁷. Surhetsgraden i huden manteln mättes genom en (tredje) hud PH 905 sond ansluten till MPA 5 station. Detta specialdesignade sonden består av en platt-topped glaselektrod för fullständig hudkontakt, ansluten till en voltmeter. Systemet mäter potentiella förändringar på grund av aktiviteten av väte katjoner kring det mycket tunna lagret av halvfast former mätt överst i sonden. Förändringar i spänning visas som pH²⁸.

Vi presenterar experiment uppdelad i tre delar: (1) förberedelse av KH från kyckling fjädrar av tvåstegs alkaliska-enzymatisk hydrolys och dess rening genom dialys (ta bort salter och low-molecular fraktioner), (2) förberedelse av kosmetiska beredningar innehållande 2, 4 och 6% KH, och (3) provning egenskaperna för KH genom att mäta hudens återfuktning, TEWL, och huden pH. Tester genomfördes på 10 kvinnor med medelålder 27,2 år och 10 män med en medelålder på 26,2 år. Metoden för att välja frivilliga och själva Testerna genomfördes i enlighet med internationella etiska principer för biomedicinsk forskning utnyttja mänskliga försökspersoner²⁹; alla personer gav sitt samtycke före införandet i studien. Före testning påbörjades, ombads frivilliga fylla i ett frågeformulär på deras hälsostatus. De frivilliga som åtagit sig för att undvika att tillämpa någon kosmetisk produkt till provplatser och omgivande regioner under 24 h före och under testperioden; Dessutom tilläts de endast kort kväll tvättar med rinnande vatten.

Protocol

Frivilliga rekryterades bland anställda och studenter vid vårt universitet. Metoden för att välja genomfördes enligt ”internationella etiska riktlinjer för medicinsk forskning involvera försökspersoner. Rådet för internationella organisationer för medicinska vetenskaper, Geneva (2002) ”. KH är en vanlig kosmetisk ingrediens som används i hårvård produkter (schampo, balsam, etc.) och därmed krävs inte godkännande från den institutionella Granskningsnämnden. 1. pr…

Representative Results

KH upprättad enligt proceduren presenteras här (se figur 2) är gul i färgen, lättlösligt i vatten med hög proteinhalt (oorganiska fasta ämnen representerar < 2,0%), 1,0% lösning av KH pH är 5.3 och uppfyller kraven för kosmetiska-grade hydrolysat. Utbytet av KH från 50 g råvara är ca 30%. Molekylvikt distribution av KH bestämdes av SDS-PAGE och visas i figur 3. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa…

Discussion

Fördelen med alkaliska-enzymatisk hydrolys är att det kan modifieras enligt framtida tillämpningar av KH. Till exempel i hårvård kosmetika applikationer där en lätt brunaktig färg på en produkt inte är ett hinder, kan en högre temperatur i hydrolys tillämpas leder till en högre avkastning av KH. Dessutom längre handläggningstiden under båda stadier av det tekniska förfarandet väsentligt påverkar den övergripande processen effektivitet – avkastningen av KH stiger till 85%.

<p class="jove_content"…

Materials

Material or chemicals
LIPEX 100T	Novozymes	LJP30020	Lipex – enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 100 KLU/g
Savinase Ultra 16L	Novozymes	PXN40001	Savinase – enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 16 KNPU-S/g
Potassium hydroxide, KOH	Sigma-Aldrich	302510289	Potassium hydroxide, KOH, 97,0 %, Mr 56,11
Phosphoric acid solution, H3PO4	Sigma-Aldrich	W290017	Phosphoric acid solution, H3PO4, 85 wt. % concentration in water, Mr 98,00
Sodium chloride physiological solution	Sigma-Aldrich	52455	Tablets of BioUltra NaCl physiological solution; 1 tablet in 1000 mL of water yields 0.9 % NaCl
Sodium hydroxide, NaOH	Penta s.r.o.	40216	Sodium hydroxide, NaOH, 97,0 %, Mr 40,00
AmiFarm (Cremor base-A)	Fagron	608425	Hydrophilic oil in water (O/W) cream base; the composition: aqua, paraffin, paraffin liquid, cetearyl alkohol, Laureth 4, sodium hydroxide, carbomer, methylparaben, propylparaben.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
IKA EUROSTAR POWER control-visc stirrers	IKA-labortechnik	Z404020	Digital laboratory stirrer, for tasks up to the high viscosity range, 230V, 1/cs
IKA Propeller stirrer, 3-bladed	IKA-labortechnik	R 1381	Propeller stirrer, 3-bladed, stirrer Ø: 45 mm, shaft Ø: 8 mm, shaft length: 350 mm
Dialysis tubing closures	Sigma-Aldrich	Z371017-10EA	Dialysis tubing closures, red, size 110 mm
Dialysis tubing cellulose membrane	Sigma-Aldrich	D9402-100FT	Dialysis tubing cellulose membrane, average flat width 76 mm (3.0 in.)
DOMO Pot with stailess, LCD	DOMO Elektronic	DO42325PC	Preserving boiler stainless steel, 2000 W, 27-L container (diameter 37 cm, height 30 cm), temperature control 30-100 ° C, operation LCD display
Hettich zentrifugen Universal 32	Gemini bv	2770 GS1R	Mid bench centrifuge, speed 18000 rpm
LT 3 shaking device	Fischer Scientific	6470.0002	Orbital shaking device
KERN 440-47N	Kern	440-47N	Laboratory balance
KERN 770	Kern	770 -N	Laboratory analytical balance
VENTICELL 222 – Komfort	BMT, MMM Group	C 131749	Drying oven, temperature control 30-100 ° C, air circulation control
Vacucell 55 – EVO	BMT, MMM Group	B 050328	Vacuum drying oven, temperature control 30-100 ° C
PULVERISETTE 19	Fritsch	19.1030.00	Universal cutting mill, rotor with V-cutting edges and fixed knives
Multi Probe Adapter System MPA 5	Courage & Kazaka Electronic	10225237	MPA 5 Station – equipment for measurement hydratation, TEWL and pH
Skin pH-meter PH 905 probe	Courage & Kazaka Electronic		Probe to specifically measure the pH on the skin surface or the scalp
Corneometer CM 825 probe	Courage & Kazaka Electronic		Probe to determine the hydration level of the skin surface (Stratum corneum).
Tewameter TM 300	Courage & Kazaka Electronic		Probe for the assessment of the transepidermal water loss (TEWL)
Heidolph RZR 2020	Heidolph	13-225-007-03-1	Overhead stirrer, mechanical speed setting and stepless transmission; speed range 40-2000 rpm
Heidolph mechanical stirrer BR 10	Heidolph	Z336688-1EA	Blade impeller crossed stirrer
Fagor FS 12	Fagor	BTT-138	Laboratory refrigerator with freezer space
WTW bench pH/mV meter	WTW	Z313165	High-performance bench pH and pH/conductivity meters for routine and high precision laboratory measurements in research or quality control laboratories
Container	RPC Superfos		13-L plastic bucket, diameter 26 cm, height 26 cm
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Microsoft Office 2010	Microsoft
C+K software	Courage and Khazaka Electronic GmbH		MPA 5 station operating software