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Immunology and Infection

Vivo में एक टीकाकरण मॉडल का उपयोग कर प्रतिजन-विशिष्ट टी-सेल Cytolytic फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए परख

Published: November 28, 2017 doi: 10.3791/56255
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 2
1Department of Melanoma Medical Oncology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Immunology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Radiation Oncology, The Second Hospital of Jilin University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक murine मॉडल में किसी लक्ष्य कक्ष के vivo antigen-विशिष्ट killing में का पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए है ।

Abstract

प्रतिजन-विशिष्ट हत्या के लिए वर्तमान के तरीके में उपयोग या संक्रामक रोग मॉडल में इस्तेमाल किया इन विट्रो तक सीमित हैं । हालांकि, वहां एक प्रोटोकॉल विशेष रूप से एक संक्रमण के बिना प्रतिजन विशिष्ट हत्या को मापने के लिए इरादा नहीं है । यह प्रोटोकॉल डिज़ाइन किया गया है और सीडी+ टी कोशिकाओं vivo मेंकिसी लक्ष्य कक्ष की antigen-विशिष्ट हत्या का पता लगाने के लिए अनुमति देकर इन सीमाओं को दूर करने के लिए विधियों का वर्णन करता है । यह एक पारंपरिक CFSE के साथ एक टीकाकरण मॉडल विलय द्वारा पूरा किया है, लक्ष्य की हत्या परख लेबल । इस संयोजन की अनुमति देता है शोधकर्ता प्रतिजन-विशिष्ट CTL क्षमता का आकलन करने के लिए सीधे और जल्दी के रूप में परख ट्यूमर विकास या संक्रमण पर निर्भर नहीं है । इसके अलावा, readout प्रवाह cytometry पर आधारित है और इसलिए आसानी से सबसे शोधकर्ताओं के लिए सुलभ होना चाहिए । अध्ययन की प्रमुख सीमा वीवो में समयरेखा की पहचान है जो परिकल्पना के लिए उपयुक्त है परीक्षण किया जा रहा है । प्रतिजन शक्ति और टी कोशिकाओं है कि अंतर cytolytic समारोह में परिणाम हो सकता है में उत्परिवर्तनों में बदलाव के लिए सावधानी से सेल फसल और आकलन के लिए इष्टतम समय निर्धारित करने के लिए मूल्यांकन की जरूरत है । टीकाकरण के लिए पेप्टाइड की उचित एकाग्रता hgp10025-33 और ओवा257-264के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन अन्य पेप्टाइड्स कि अधिक एक दिया अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हो सकता है के लिए आगे सत्यापन की जरूरत होगी. कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल vivo में हत्या समारोह का एक त्वरित आकलन की अनुमति देता है और किसी भी प्रतिजन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

एक सीडी+ या सीडी+ T-सेल की cytolytic (CTL) क्षमता का आकलन करने के लिए एकाधिक प्रोटोकॉल मौजूद हैं । इस आकलन को आसानी से नियंत्रित शर्तों के तहत इन विट्रो में किया जा सकता है1,2,3. इसके अलावा, संक्रामक रोग मॉडल, जैसे LCMV, प्रतिष्ठित CTL समारोह में विभेदक CFSE (5-(और 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl एस्टर के उपयोग के माध्यम से जांच की है) लक्ष्य कोशिकाओं लेबल जहां CFSEहाय-लेबल कोशिकाओं रहे है एक पेप्टाइड और CFSElo-लेबल लक्ष्य कोशिकाओं के साथ स्पंदित छोड़ दिया जाता है । कोशिकाओं को तो एक 1:1 अनुपात में इंजेक्शन और CFSEहायके नुकसान के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं, प्रवाह cytometry4द्वारा लेबल स्पंदित लक्ष्य । वैक्सीन और अस्वीकृति मॉडल भी vivo में दोनों सीडी+ और सीडी+ टी कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से NK कोशिकाओं5,6द्वारा हत्या के आकलन के लिए इसी तरह की रणनीतियों का इस्तेमाल किया है । यह एक शक्तिशाली परख है, लेकिन संक्रामक एजेंटों के उपयोग की आवश्यकता है कि प्रधानमंत्री प्रतिरक्षा प्रणाली को लक्ष्य इंजेक्शन से पहले ।

इस प्रोटोकॉल, दूसरी ओर, मेजबान की कोई पूर्व संक्रमण की आवश्यकता है और इसके बजाय प्रधानमंत्री को एक टीकाकरण रणनीति प्रतिरक्षा प्रणाली का इस्तेमाल करने से पहले लक्ष्य इंजेक्शन के लिए । इस टीकाकरण एक पानी पेप्टाइड वैक्सीन का निर्माण आधारित है जो एक immunostimulatory कॉकटेल के प्रावधान की आवश्यकता है शामिल है covax7, एक टोल से मिलकर-रिसेप्टर की तरह 7 (TLR7) एगोनिस्ट (imiquimod क्रीम), एक agonistic विरोधी CD40 एंटीबॉडी, और interleukin-2 (IL-2) पेप्टाइड-विशिष्ट भड़काना और मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के संमिश्रण के लिए immunostimulatory एजेंटों के संयोजन synergistic करने के लिए अग्रणी । जैसे, इस परख CTL समारोह के एक त्वरित readout प्रदान करता है के रूप में वैक्सीन केवल तीन दिन के लक्ष्य कोशिकाओं के इंजेक्शन से पहले समारोह के आकलन के लिए कोशिकाओं के साथ प्रशासित है । इसके अलावा, covax भड़काने काफी मजबूत है कि प्रधानमंत्री प्रतिजन विशेष टी सेल की हत्या क्षमता इंजेक्शन के बाद 4 और 24 ज के बीच देखा जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमा vivo में लक्ष्य की हत्या का पता लगाने के लिए समयरेखा की पहचान है कि दोनों प्रतिजन और परिकल्पना परीक्षण किया जा रहा है के लिए उपयुक्त है । सावधान आकलन किया जाना चाहिए, प्रतिजन शक्ति में बदलाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आनुवंशिक परिवर्तन टी कोशिकाओं में परीक्षण किया जा रहा अंतर CTL समारोह है कि लक्ष्य की हत्या का एक अलग समय का पता लगाने की आवश्यकता होगी में परिणाम सकता है । इसके अलावा, जबकि टीकाकरण के लिए पेप्टाइड की उचित एकाग्रता मानव मेलेनोमा प्रतिजन glycopeptide १०० (hgp10025-33) और ovalbumin257-264 (ओवा257-264)8,9 के लिए अनुकूलित किया गया है , और अधिक किसी दिए गए अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हो सकता है एक antigen मॉडल का उपयोग आगे मांयता की आवश्यकता होगी । एक लक्ष्य प्रतिजनों की क्षमता में प्रत्याशित मतभेदों के कारण एक सहायक के रूप में covax के साथ संयोजन में CTL प्रभाव समारोह को उत्तेजित करने के लिए, IL-2 खुराक एकाग्रता और खुराक आवृत्ति के अनुकूलन के लिए वांछित लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है । कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल vivo में हत्या समारोह के एक त्वरित आकलन के लिए अनुमति देता है और किसी भी प्रतिजन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Protocol

सभी तरीकों यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और टेक्सास विश्वविद्यालय के एमडी एंडरसन कैंसर केंद्र के उपयोग की समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. वैक्सीन के लिए पेप्टाइड की तैयारी

  1. 30 एस के लिए उचित एकाग्रता और भंवर के लिए फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ lyophilized पेप्टाइड भंग.
    नोट: hgp10025-३३के लिए, अंतिम एकाग्रता 1 मिलीग्राम/एमएल और ओवा२५७-२६४के लिए है, अंतिम एकाग्रता ०.५ मिलीग्राम/एमएल है । इंजेक्शन से पहले पेप्टाइड का पुनर्गठन । पुनर्गठन के बाद स्टोर न करें ।

2. ट्रांसजेनिक माउस से Splenocytes का अलगाव

नोट: तिल्ली से कोशिका अलगाव एक बाँझ तरीके से किया जाना चाहिए.

  1. Euthanize-1 ट्रांसजेनिक माउस अनुमोदित CO2 asphyxiation विधि का उपयोग कर और तिल्ली निकालें ।
    नोट: उपयुक्त ट्रांसजेनिक माउस इस चरण में पसंद की पेप्टाइड के लिए विशिष्ट उपयोग किया जाता है ।
    1. इसके दाईं ओर माउस रखना । ७०% इथेनॉल (ेतोः) के साथ माउस के बाईं ओर स्प्रे । संदंश का उपयोग कर त्वचा खींचो और शल्य कैंची का उपयोग कर त्वचा में कटौती; तिल्ली पेरिटोनियल गुहा के भीतर दिखाई जाएगी । धीरे तिल्ली का उपयोग करने के लिए पेरिटोनियल गुहा खुला काट । संदंश का उपयोग कर तिल्ली निकालें.
  2. यह एक पेट्री डिश में एक ७० µm फिल्टर में रखकर तिल्ली को 2 मिलीलीटर मध्यम एक (1% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पंजाब) और एक सवार के अंत के साथ तिल्ली मुंहतोड़ द्वारा विसमुच्चय ।
    1. पेट्री डिश से splenocytes लीजिए और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में रखें । सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक दो बार मध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ पेट्री डिश धो लें । मध्यम एक अप करने के लिए जोड़ें 25 मिलीलीटर और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को ४७५ x g पर केंद्रापसारक
  3. महाप्राण कोशिकाओं और 1 मिलीलीटर में reसस्पैंड/प्रति तिल्ली लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis बफर. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन मध्यम a के 10 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर ४७५ x g में गोली को एक साफ ५० एमएल शंकु में एक ७० µm फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन को छानने के माध्यम से एक और मलबे को हटाने के 10 मिलीलीटर में स्थगित ।
  4. trypan नीला और एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना । 106 -१००6 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता के लिए पंजाब में कोशिकाओं reसस्पेंड/ के लिए ओवा२५७-२६४ विशिष्ट हत्या, 106 कोशिकाओं/एमएल और hgp10025-३३ विशिष्ट हत्या के लिए, १००6 कोशिकाओं पर reसस्पेंड/
    1. ४७५ x g पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शेष कोशिकाओं स्पिन महाप्राण supernatant और 15 मिलीलीटर ठंड में पुनर्निलंबित पंजाबियों कोशिकाओं को धोने के लिए । धो चरण एक बार फिर दोहराएं । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ४७५ x जी में कोशिकाओं स्पिन महाप्राण supernatant और चरण २.४ में निर्धारित अंतिम मात्रा के अनुसार ठंडे पंजाबियों में reसस्पैंड ।
    2. स्थानांतरण एकल सेल निलंबन एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और प्राप्तकर्ता C57/BL6 माउस में इंजेक्शन तक बर्फ पर रखने के लिए ।

3. ट्रांसजेनिक चूहों से Splenocytes का इंजेक्शन

  1. प्लेस प्राप्तकर्ता C57/BL6 माउस पृष्ठीय पक्ष के साथ एक निरोधक में । ७०% isopropyl शराब के साथ स्प्रे इंजेक्शन पूंछ बेस क्षेत्र । प्रशासन एकल सेल निलंबन के १०० µ l (खंड 2) नसों में पूंछ के साथ एक 27 जी सुई का उपयोग कर बेवल पक्ष का सामना करना पड़ रहा ।

4. Covax प्रशासन

नोट: यदि कोशिकाओं को दोपहर में इंजेक्ट कर रहे हैं, covax सेल इंजेक्शन के 18 ज के भीतर निंनलिखित सुबह प्रशासित किया जाना चाहिए ।

  1. 1-3% isoflurane के साथ एक स्पष्ट संज्ञाहरण बॉक्स में माउस प्लेस । चूहों पूरी तरह से anesthetized के बाद, संज्ञाहरण कक्ष में कई गुना से जुड़ी नाक शंकु के लिए चूहों हस्तांतरण. चूहों पृष्ठीय पक्ष के साथ फिर से नियंत्रित रखो ।
    नोट: Anesthetization एक संक्षिप्त पैर की अंगुली चुटकी द्वारा पुष्टि करने के लिए एक वापसी प्रतिक्रिया को सत्यापित किया जाता है नहीं है । संघीय कानून एक लाइसेंस पशुचिकित्सा के आदेश पर isoflurane उपयोग को प्रतिबंधित करता है ।
  2. ७०% isopropyl शराब के साथ स्प्रे इंजेक्शन पूंछ बेस क्षेत्र । १०० µ एल के पेप्टाइड समाधान (खंड 1 से) चमड़े के नीचे पूंछ आधार क्षेत्र में 4-5 mm मर्मज्ञ सिरिंज के साथ एक 27 जी सुई का उपयोग कर, सुई बेवल पक्ष का सामना करना पड़ ।
    नोट: चूहों पूंछ10के आधार पर उपचर्म इंजेक्शन के साथ एक पार्श्व में टीका लगाया जाता है ।
  3. इंजेक्शन १०० µ एल एंटी CD40 एंटीबॉडी (०.५ mg/एमएल स्टॉक) टीका इंजेक्शन साइट पर पार्श्व ।
  4. सावधानी से लागू imiquimod क्रीम ५० मिलीग्राम/ जब तक क्रीम नहीं दिखाई देती है और पूरी तरह से अवशोषित हो जाती है तब तक सतह पर imiquimod क्रीम रगड़ें.
  5. लोअर उदर क्षेत्र में १००,००० IU/एमएल rhIL-2 प्रोटीन intraperitoneally (आईएफसआई) के १०० µ एल इंजेक्षन । 5 मिनट के लिए चूहों का निरीक्षण के बाद वे पूरी तरह से संज्ञाहरण से उबरने ।
    नोट: प्रयोग 3 दिनों के लिए इस बिंदु पर रोका गया है ।

5. CFSE के साथ लेबलिंग के लिए लक्ष्य Splenocytes का अलगाव

नोट: तिल्ली से कोशिका अलगाव एक बाँझ तरीके से किया जाना चाहिए.

  1. Euthanize C57BL/6 चूहों को अनुमोदित सह2 asphyxiation विधि के अनुसार । निकालें प्लीहा (ओं) के रूप में कदम 2.1.1 । तिल्ली और धोने splenocytes चरणों में के रूप में समग्र-2.2.3 । लाइसे लाल रक्त कोशिकाओं के रूप में कदम २.३-2.3.2 ।
  2. किसी hemocytometer का उपयोग करके गणना के लिए कक्षों को निकालें और CFSE-लेबलिंग समाधान (चरण 7 में वर्णित) में 106 कक्षों/ ४७५ x g. महाप्राण supernatant पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शेष कोशिकाओं स्पिन ।

6. लक्ष्य Splenocytes की पेप्टाइड स्पंदन

नोट: पेप्टाइड स्पंदन एक बाँझ तरीके से किया जाना चाहिए ।

  1. पूर्ण मीडिया (RPMI १६४० मीडिया में 10% FBS, 1% l-glutamine (L-Gln), 1% पेनिसिलिन/streptomycin (Pen/Strep)) के साथ 106 कक्षों/ कोशिकाओं को 2 ट्यूबों (15 मिलीलीटर शंकुओं) में बांट लें । लेबल के रूप में प्रत्येक ट्यूब स्पंदित या स्पंदित ।
  2. स्पंदित लेबल ट्यूब के लिए पेप्टाइड जोड़ें । त्यात ओवा२५७-२६४ स्पंदने, add 1 µ g/मब व त्यात hgp10025-३३ स्पंदने, add 2 µ g/मब.
    नोट: स्पंदित कोशिकाओं सिर्फ पेप्टाइड के अलावा बिना स्पंदित कोशिकाओं के रूप में ही गर्मी से गुजरना ।
    1. 1 एच के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन + पेप्टाइड
  3. पूरा मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें (10% FBS के साथ RPMI १६४० मीडिया, 1% एल-glutamine (एल-Gln), 1% पेनिसिलिन/streptomycin (कलम/Strep)) दोनों स्पंदित और स्पंदित लक्ष्य कोशिकाओं को धोने के लिए प्रत्येक ट्यूब के लिए । ४७५ x g. महाप्राण supernatant पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शेष कोशिकाओं स्पिन ।

7. लेबलिंग लक्ष्य Splenocytes के लिए CFSE की तैयारी

  1. चरण ६.३ में कक्ष धोने के दौरान CFSE-लेबलिंग समाधान तैयार करें; स्पंदित कोशिकाओं CFSEहाय और CFSEloके रूप में स्पंदित के रूप में चिह्नित किया जाएगा । 106 कक्षों के लिए CFSE-लेबलिंग समाधान की 1 मिलीलीटर तैयार करें ।
    नोट: CFSE संवेदनशील प्रकाश है और हर समय प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए ।
    1. 2% FBS के साथ RPMI मीडिया १६४० में 5 µ m/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 1 उल/एमएल CFSE (5 मिमी स्टॉक समाधान) जोड़कर CFSEhi -लेबलिंग मीडिया तैयार करें ।
    2. 2% FBS के साथ ०.५ µ m/एमएल RPMI मीडिया १६४० के अंतिम एकाग्रता के लिए 1 उल/एमएल CFSE (०.५ mM स्टॉक सॉल्यूशन) जोड़कर CFSElo -लेबलिंग मीडिया तैयार करें ।

8. CFSE के साथ लक्ष्य Splenocytes का लेबल

नोट: CFSE लेबलिंग बाँझ तरीके से किया जाना चाहिए ।

  1. 106 कक्षों/एमएल CFSE-लेबलिंग मीडिया पर स्पंदित और स्पंदित लक्ष्य कक्ष (चरण ६.३ से) पुनर्निलंबित करें । तैयार CFSEहाय-लेबलिंग मीडिया और तैयार CFSEलो-लेबलिंग मीडिया के साथ अनपल्स्ड कोशिकाओं के साथ स्पंदित कोशिकाओं reसस्पेंड.
  2. मिश्रण कोशिकाओं और कोमल उलटा या घूमता द्वारा CFSE-लेबलिंग मीडिया । भंवर से मिश्रण नहीं है । गर्मी कोशिकाओं और CFSE-लेबलिंग मीडिया ३७ ° c के लिए 15 min. reरीमिक्स कोशिकाओं को हर 5 मिनट.
  3. प्रत्येक कोशिका निलंबन और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्पिन कोशिकाओं को ४७५ x g पर 10 मिलीलीटर पूरा मीडिया के जोड़ें
  4. महाप्राण supernatant और 10 मिलीलीटर ठंडे पंजाबियों में कोशिकाओं को स्थगित । 4 ° c पर 5 मिनट के लिए ४७५ x g पर सेल स्पिन
  5. चरण ८.४ दोहराएँ ।
  6. कोशिकाओं की गिनती और प्राप्तकर्ता चूहों में इंजेक्शन के लिए एक 1:1 अनुपात में, CFSEलो-लेबल वाले कोशिकाओं के साथ CFSEहाय-स्पंदित, लेबल पेप्टाइड. एक आधारभूत प्रवाह cytometry आकलन (धारा 11) के लिए उपयोग करने के लिए 1x 106 मिश्रित कक्षों का aliquot रखें ।
    नोट: इंजेक्शन के लिए अंतिम मात्रा माउस प्रति १०० µ एल है । अंतिम कक्ष गणना 10e6 कक्ष है । सिरिंज और सुई में मात्रा की हानि को ध्यान में रखा जाना चाहिए और ५०० µ पर अनुमानित किया जाना चाहिए l

9. लक्ष्य कोशिकाओं के इंजेक्शन

नोट: CFSE-लेबल से पहले और इंजेक्शन के दौरान जितना संभव हो प्रकाश से संरक्षित कोशिकाओं रखें ।

  1. जगह प्राप्तकर्ता C57BL/6 चूहों पृष्ठीय पक्ष के साथ एक निरोधक में । ७०% isopropyl शराब के साथ स्प्रे इंजेक्शन पूंछ बेस क्षेत्र । प्रशासन १०० µ एकल सेल निलंबन के एल बेवल पक्ष ऊपर का सामना करना पड़ के साथ पूंछ नस में ।

10. लक्ष्य कोशिकाओं का पुनः अलगाव

नोट: इस कदम के समय महत्वपूर्ण है और CTL cytotoxicity और उत्तेजना के लिए प्रतिजन की ताकत पर निर्भर है । एक ओवा२५७-२६४ स्पंदित लक्ष्य की हत्या के आकलन के लिए, कोशिकाओं इंजेक्शन के बाद 4-6 एच काटा जा करने की आवश्यकता है । चूंकि CFSE-लेबल वाले कक्ष हल्के संवेदनशील होते हैं, अंधेरे में प्रक्रिया प्लीहा होती है ।

  1. अनुमोदित सह2 asphyxiation विधि के अनुसार प्राप्तकर्ता C57BL/6 चूहों को Euthanize ।
  2. निकालें प्लीहा (ओं) के रूप में कदम 2.1.1 । तिल्ली और धोने splenocytes चरणों में के रूप में समग्र-2.2.3 । लाइसे लाल रक्त कोशिकाओं के रूप में कदम २.३-2.3.2 ।
  3. 1 मिलीलीटर प्रतिदीप्ति सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACs) बफ़र (1% BSA + पंजाब) में प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन के लिए कक्ष पुनर्निलंबित ।

11. गेटिंग तर्क प्रवाह Cytometry द्वारा CTL गतिविधि का निर्धारण करने के लिए

  1. मानक प्रवाह cytometry प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए CTL गतिविधि का मूल्यांकन करें । उत्तेजना11के लिए ४८८ एनएम लेजर के साथ एक प्रवाह cytometer पर FITC चैनल का उपयोग कर कोशिकाओं का अधिग्रहण.
    1. फॉरवर्ड कैटरिंग (FSC) बनाम साइड स्कैटर (SSC) पैरामीटर का उपयोग कर लाइव लिम्फोसाइटों पर गेट. कुल CFSE-पॉजिटिव आबादी के लिए लाइव लिम्फोसाइट गेट के भीतर उपगेट ।
      नोट: इंजेक्शन CFSE-लेबल वाले कक्षों को तिल्ली में मौजूद कुल लिम्फोसाइटों का एक छोटा सबसेट बनाना होगा. CSFE-सकारात्मक कोशिकाओं लॉग पैमाने पर दो अलग आबादी के रूप में प्रकट होना चाहिए ।
    2. स्पंदित (बायां पीक, CFSElo) और स्पंदित (दायां पीक, CFSEhi) जनसंख्या का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए हिस्टोग्राम स्वरूप का उपयोग करें । CFSEhi कक्षों की हानि antigen-विशिष्ट CTL गतिविधि को इंगित करती है ।

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Representative Results

CFSE-लेबल लक्ष्य कोशिकाओं के इंजेक्शन से पहले, 1:1 सेल मिश्रण एक प्रवाह cytometer पर चलाने के लिए दोनों CFSEhi और CFSElo लक्ष्य कोशिकाओं की आधारभूत आवृत्तियों का निर्धारण है । चित्र 1 एक गेटिंग रणनीति CFSE आबादी में परिवर्तन का पता लगाने के लिए पता चलता है, एक प्रारंभिक गेट FSC और एसएससी मापदंडों का उपयोग किया जाता है । कुल CFSE-सकारात्मक कोशिकाओं तो आवृत्ति में परिवर्तन का आकलन करने से पहले गेट, के रूप में इस आबादी अपेक्षाकृत छोटे है जब unलेबल्ड अंतर्जात splenocytes की तुलना में । CFSEहाय और CFSEलो आबादी के सापेक्ष आवृत्ति १००% पर कुल CFSE-सकारात्मक जनसंख्या की स्थापना द्वारा गणना की है । यह विश्लेषण हिस्टोग्राम या डॉट प्लॉट स्वरूप का उपयोग करके किया जा सकता है । इंजेक्शन से पहले CFSE आबादी के सापेक्ष आवृत्ति का एक उदाहरण चित्रा 1बीमें दिखाया गया है । यह अनुपात शायद ही कभी 1:1 ठीक हो जाएगा, लेकिन काफी करीब होना चाहिए । covax भड़काना की आवश्यकता चित्रा 1सी में दिखाया गया है जहां प्रतिजन स्पंदित की कोई हत्या, CFSEहाय लक्ष्य कोशिकाओं 24 एच पोस्ट इंजेक्शन में मनाया जाता है । चित्र 1 डी का प्रदर्शन प्रभावी प्रतिजन स्पंदित, CFSEहाय-के रूप में लक्ष्य कोशिकाओं लेबल के लिए इंजेक्शन से पहले मनाया गया था लगभग नहीं पाता है और अनुपात नाटकीय रूप से ५०% से 1% का पता लगाने के लिए स्थानांतरित कर दिया है । यह आंकड़ा भी कैनेटीक्स प्रतिजन स्पंदित, CFSEहाय-लेबल लक्ष्य सेल दोनों 6 एच और 24 एच पोस्ट इंजेक्शन में इस आबादी के नुकसान का आकलन करके हत्या से पता चलता है ।

Figure 1
चित्र 1: आधार रेखा पर लेबल किए गए कक्षों की तुलना और CFSE-लेबल किए गए लक्ष्य कक्षों का निम्न इंजेक्शन. (क) CTL समारोह के आकलन के लिए गेटिंग कार्यनीति दर्शाई गई है. संक्षेप में, लाइव लिम्फोसाइटों फॉरवर्ड स्कैटर (FSC) बनाम साइड स्कैटर (SSC) पैरामीटर का उपयोग कर gated हैं । कुल CSFE-सकारात्मक कोशिकाओं रहते सेल गेट के भीतर उपद्वार हैं । CFSEhi और CFSElo का अनुपात कुल CFSE-धनात्मक जनसंख्या के भीतर उनके संबंधित आवृत्ति पर आधारित है । (ख) निम्नलिखित CFSE लेबलिंग, लक्ष्य कोशिकाओं को मिश्रित कर रहे हैं 1:1 और प्रवाह cytometry द्वारा CFSEहाय और CFSEलो कोशिकाओं के अनुपात के लिए मूल्यांकन. संख्याएं हिस्टोग्राम (बाएं) और CFSE बनाम एसएससी डॉट प्लॉट (दाएं) स्वरूपों दोनों पर संबंधित चोटियों की आवृत्ति का संकेत है । (ग) यह covax आहार के साथ पूर्व टीकाकरण के बिना हत्या लक्ष्य कोशिकाओं की कमी को दर्शाता है । Splenocytes इंजेक्शन के बाद 24 एच काटा गया । (घ) यह प्रदर्शित करता है प्रतिजन-स्पंदित CFSEहाय लक्ष्य कोशिकाओं पर 6 एच (शीर्ष रेखांकन) और 24 एच (नीचे रेखांकन) पोस्ट इंजेक्शन । संख्याएं हिस्टोग्राम (बाएं) और CFSE बनाम एसएससी डॉट प्लॉट (दाएं) स्वरूप दोनों पर CFSE-लेबल की गई चोटियों की आवृत्ति दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हालांकि इस प्रोटोकॉल सीधा है, वहां कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि सावधानी से किया जाना चाहिए रहे हैं । covax भड़काने antigen-विशिष्ट टी सेल परीक्षण किया जा रहा के निंनलिखित इंजेक्शन स्पंदित लक्ष्यों के किसी भी हत्या देखने के लिए आवश्यक है । हालांकि यह संभव है कि पानी आधारित covax टीकाकरण एक तीव्र सूजन की स्थिति पैदा करता है, जीर्ण भड़काऊ चरण के लिए, कम रहते पानी आधारित निर्माण की जगह एक धीमी प्रतिजन जारी तेल आधारित दृष्टिकोण के साथ एक बेहतर उत्पादन हो सकता है परिणाम7,12।

इसके अलावा, CFSE-लेबलिंग का लक्ष्य कक्ष antigen स्पंदन के बाद एक आदर्श प्रवाह cytometry readout के लिए समान होना चाहिए । CFSE के लेबलिंग के साथ 5 µ एम और CFSE lo के साथ ०.५ µ मीटर के लिए इस प्रणाली में आदर्श हो पाया गया था आबादी है कि आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है में एक लॉग अंतर प्रदान करते हैं ।

इस प्रोटोकॉल का परीक्षण किया जा रहा विशिष्ट antigen सिस्टम के लिए संशोधित करने के लिए सरल है । सबसे पहले, covax के भाग के रूप में प्रशासित पेप्टाइड की एकाग्रता की पुष्टि की जानी चाहिए । यह उचित एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक सरल तरीका है टीका और रक्त में इंजेक्शन, प्रतिजन विशिष्ट टी कोशिकाओं के विस्तार को ट्रैक । इस स्थिति में, एक कमज़ोर प्रतिजन (hgp10025-33) के रूप में अधिक पेप्टाइड एक मजबूत प्रतिजन (ओवा२५७-२६४) के रूप में दो बार की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया सत्यापित सांद्रता उत्तेजना की ताकत के आधार पर अन्य एंटीजन परीक्षण के लिए एक उचित प्रारंभिक बिंदु होगा. संशोधन के एक बिंदु के लिए बस छुटकारा वंय-प्रकार के एक प्रतिजन CTL-समारोह के आकलन के लिए पेप्टाइड स्पंदित लक्ष्य के बाद ब्याज की एक antigen के साथ होगा । हालांकि, इस संशोधन सक्रियकरण और अंतर्जात प्रतिजन-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं के विस्तार पर भरोसा करते है और इसलिए लक्ष्य सेल स्थानांतरण के समय की संभावना को 7-14 दिनों प्रतिरक्षण के बाद होने की आवश्यकता होगी । इसके अलावा, antigen-विशिष्ट killing का स्तर बहुत कम हो सकता है के रूप में मनाया जब ट्रांसजेनिक टी कोशिकाओं को स्थानांतरित करने की तुलना में । इस संशोधन के साथ एक चेतावनी है कि लक्ष्य के लिए CTL प्रतिक्रिया का स्तर बहुत कम हो सकता है पता लगाया जाएगा ।

प्रतिजन की मात्रा टी के लिए आवश्यक के अलावा-सेल भड़काना, CFSE-लेबल लक्ष्य कोशिकाओं के पुनः अलगाव के समय एक दी परिकल्पना के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । टी सेल को संशोधनों का परीक्षण किया जा रहा है कि अंतर की हत्या क्षमताओं में परिणाम फिर से अलगाव के समय में समायोजन की आवश्यकता हो सकती है । एक टी सेल एक बढ़ाया हत्या समारोह के साथ लक्ष्य की जरूरत है बहुत तेजी से अपने जंगली प्रकार के समकक्ष से मूल्यांकन किया जाएगा । इस काइनेटिक प्रोफ़ाइल को ध्यान से इष्टतम timepoint निर्धारित करने के लिए परीक्षण परिकल्पना का पता लगाया जाना चाहिए । आम तौर पर, हम यह लक्ष्य कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद 4 और 24 एच के बीच भिन्न करने के लिए मिल गया है.

परख की एक सीमा है कि प्रभाव कोशिकाओं को लंबे रूप से एक समाप्त राज्य प्रेरित उत्तेजित नहीं किया गया है । इसलिए, CTL फ़ंक्शन हाल ही में सक्रिय करने के लिए सीमित है प्रभाव कक्ष । यह संभव है कि इस विधि एक स्मृति जनसंख्या या एक लंबे रूप से सक्रिय प्रतिजन-विशिष्ट टी सेल सबसेट है, जो भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए दिलचस्प होगा की हत्या की क्षमता के समारोह याद का आकलन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है ।

vivo में CTL फंक्शन का परीक्षण करने की यह विधि vivo killing में तेजी से पता लगाने के लिए अनुमति देता है कि एक में इन विट्रो सेटिंग की सीमाओं में से कुछ पर काबू । एक बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली जगह में है और covax विधि के माध्यम से हस्तांतरित टी कोशिकाओं की भड़काना पेप्टाइड प्रस्तुति और सह उत्तेजना पर निर्भर करता है अंतर्जात प्रतिजन द्वारा-कोशिकाओं को पेश । vivo हत्या परख में अंय के विपरीत, इस विधि एक संक्रमण या एक ट्यूमर लक्ष्य की उपस्थिति की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, एक ट्यूमर लक्ष्य के अलावा एक अतिरिक्त तुलनित्र प्रदान करेगा और इस विधि के भविष्य अनुप्रयोगों के लिए प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं और covax प्रशासन के इंजेक्शन से पहले परख करने के लिए जोड़ा जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम NIH रिसर्च (A1R03AI120027 (आरएन) और 1R21AI20012 (आरएन)), संस्थागत अनुसंधान अनुदान (आरएन), स्टार्ट-अप ग्रांट (आरएन), और एमडी एंडरसन सीआईसी सीड ग्रांट (आरएन) द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 to 12 week old female C57BL/6 mice  Charles River 027 C57 Black 6 mice
OT-1 6-12 week old female mice  Jackson Labs 003831
hgp10025–33  CPCScientific 834139 KVPRNQDWL
OVA 257–264  CPCScientific MISC-012 SIINFEKL
Imiquimod cream 5%  Fougera 51672-4145-6 Aldara Cream
CD40-specific mAb  BioXcell BE0016-2 clone FGK4.5
rhIL-2 protein  Hoffman LaRoche Inc 136 Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep  Kendall S-17474
PBS Life Technologies 10010-023 Phosphate Buffered Saline
FBS Life Technologies 26140-079 fetal bovine serum
RBC lysis buffer  Life Technologies A10492-01 red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
L-Glutamine  Life Technologies 25030081
Pen/Strep Life Technologies 15140122 penicillin/streptomycin
CFSE Life Technologies C34554 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  A4503
1.5 mL MCT graduated natural  Fisher 05-408-129 microcentrifuge tube
70% ethanol Fisher BP8201500 EtOH
Trypan blue solution, 0.4%   Life Technologies 15250-061
Hemocytometer Fisher 267110
27 gauge needle BD 305109
1 mL syringe BD 309659

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक १२९ Cytolytic समारोह सीडी+ टी कोशिकाओं vivo में परख पेप्टाइड टीकाकरण CFSE-लेबलिंग तीव्र प्रतिक्रिया
<em>Vivo में</em> एक टीकाकरण मॉडल का उपयोग कर प्रतिजन-विशिष्ट टी-सेल Cytolytic फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए परख
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Haymaker, C. L., Hailemichael, Y.,… More

Haymaker, C. L., Hailemichael, Y., Yang, Y., Nurieva, R. In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model. J. Vis. Exp. (129), e56255, doi:10.3791/56255 (2017).

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