Summary
El objetivo de este protocolo es permitir la detección de en vivo matando de una célula de la blanco en un modelo murino de específica de antígeno.
Abstract
Las metodologías actuales para la matanza de específica de antígeno son limitadas para uso in vitro o utilizadas en modelos de enfermedades infecciosas. Sin embargo, existe no un protocolo diseñado específicamente para medir el antígeno específico homicidio sin una infección. Este protocolo está diseñado y se describen métodos para superar estas limitaciones por lo que permite la detección de antígeno específico matando de una célula diana por CD8 células+ T en vivo. Esto se logra por la fusión de un modelo de vacunación con el objetivo marcado con CFSE tradicional matando a ensayo. Esta combinación permite al investigador evaluar el potencial CTL específica de antígeno directamente y rápidamente como el ensayo no es dependiente sobre el crecimiento del tumor o infección. Además, la lectura se basa en citometría de flujo y por lo tanto debe ser accesible a la mayoría de los investigadores. La principal limitación del estudio es identificar la línea de tiempo en vivo que sea apropiada a la hipótesis de ser probada. Variaciones en fuerza de antígeno y mutaciones en las células de T que pueden producir la función citolítica diferencial deben ser evaluados cuidadosamente para determinar el momento óptimo para la cosecha celular y la evaluación. La concentración adecuada de péptidos para la vacunación ha sido optimizada para hgp10025-33 y OVA257-264, pero además se necesitarían validación de otros péptidos que pueden ser más apropiados para un determinado estudio. En general, este protocolo permite una evaluación rápida de la función en vivo y puede ser adaptado a cualquier antígeno determinado.
Introduction
Existen múltiples protocolos para evaluar el citolíticos (CTL) potencial de un CD8+ o CD4+ T-cell. Esta evaluación puede hacerse fácilmente en vitro en condiciones controladas1,2,3. Además, modelos de enfermedades infecciosas, tales como LCMV, clásicamente han examinado la función CTL a través diferencialmente CFSE (-(and 6) 5-Carboxyfluorescein diacetato succinimidyl éster) etiquetado como células diana donde la CFSEhi-las células marcadas están pulsada con un péptido y CFSElo-destino etiquetado células quedan unpulsed. Las células son inyectadas en una proporción 1:1 y evaluó la pérdida de la CFSEHola-etiquetado objetivos pulsadas por citometría de flujo4. Vacuna y rechazo de modelos también han utilizado estrategias similares para la evaluación de en vivo de la matanza por ambos CD8+ y CD4+ T las células así como NK células5,6. Esto es un ensayo potente, pero requiere el uso de agentes infecciosos y que prime el sistema inmunológico antes de la inyección de destino.
Este protocolo, por el contrario, requiere una infección previa del huésped y en su lugar utiliza una estrategia de vacunación para cebar el sistema inmunológico antes de la inyección de destino. Esta vacuna se compone de una formulación a base de agua de vacuna peptídica que requiere la provisión de un inmunoestimulador cóctel llamado covax7, que consiste en un peaje-como el receptor 7 (TLR7) agonista (imiquimod crema), un anti-CD40 agonística anticuerpo y la interleucina-2 (IL-2) a la combinación sinérgica de los agentes inmunoestimulantes para la obtención de péptidos específicos cebado y respuesta inmune robusta. Como tal, este ensayo proporciona una lectura rápida de la función CTL como la vacuna se administra junto con las células para la evaluación de la función de sólo tres días antes de la inyección de las células diana. Además, el cebado covax es lo suficientemente fuerte como para que la capacidad de matanza de la célula de T específicas de antígeno preparada puede verse entre 4 y 24 h después de la inyección.
La limitación principal de este protocolo es identificar la línea de tiempo en vivo para la detección de la matanza de destino apropiado para el antígeno y la hipótesis ensayada. Cuidadosa evaluación debe realizarse, como variaciones en la fuerza de antígeno así como alteraciones genéticas siendo probado en las células T podría resultar en función diferencial de CTL que requiera una detección de diferentes tiempos de asesinato de destino. Además, si bien la concentración adecuada de péptido de vacunación ha sido optimizada para el antígeno de melanoma humano glicopéptido 100 (hgp10025-33) y ovoalbúmina257-264 (OVA257-264)8,9 , uso de otro modelo de antígeno que puede ser más apropiado para un determinado estudio requiere mayor validación. Debido a diferencias esperadas en la capacidad de los antígenos de un objetivo para estimular la función efectora CTL en combinación con el covax como coadyuvante, optimización de la frecuencia de dosis y concentración de dosis IL-2 puede ser esencial para lograr el objetivo deseado. En general, este protocolo permite una evaluación rápida de la función en vivo y puede ser adaptado a cualquier antígeno determinado.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center.
1. preparación de péptidos para la vacuna
- Disolver el péptido liofilizado con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la concentración adecuada y el vortex durante 30 s.
Nota: Para hgp10025–33, la concentración final es de 1 mg/mL y para OVA257–264, la concentración final es de 0,5 mg/mL. Reconstituir el péptido antes de la inyección. No guarde después de la reconstitución.
2. aislamiento de esplenocitos de ratón transgénico
Nota: Aislamiento de células desde el bazo debe realizarse de forma estéril.
-
Eutanasia el ratón transgénico de OT-1 utilizando el método de asfixia aprobado de CO2 y extirpar el bazo.
Nota: Ratón transgénico apropiado se utiliza en este paso específico para el péptido de elección.- Coloque el ratón sobre su lado derecho. Rocíe el lado izquierdo del ratón con 70% de etanol (EtOH). Tire de la piel con unas pinzas y cortar la piel con tijeras quirúrgicas; el bazo será visible dentro de la cavidad peritoneal. Con cuidado corte la cavidad peritoneal para acceder al bazo. Extirpar el bazo con unas pinzas.
-
Separar el bazo colocando un filtro μm 70 en una placa Petri con medio de 2 mL A (PBS con 1% de suero bovino fetal (FBS)) y rotura del bazo con el extremo de un émbolo.
- Recoger los esplenocitos de la placa de Petri y el lugar en un tubo cónico de 50 mL. Lave la placa de Petri con 5 mL de medio A dos veces a recoger todas las células. Añada medio un up a 25 mL y centrifugar las células durante 5 minutos a temperatura ambiente a 475 x g.
- Aspirar las células y resuspender en 1 mL / por tampón de lisis de glóbulos rojos (gr) de bazo. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos agregar 10 mL de medio A centrifugar a temperatura ambiente a x 475 g. Resuspender el precipitado en 10 mL de medio A y eliminar los desechos por la suspensión de células a través de un filtro de 70 μm en un limpio cónico de 50 mL de filtrado.
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Contar celdas con azul de tripán y un hemocitómetro. Resuspender las células en PBS a una concentración final de 106 - 1006 células/mL. Para OVA257–264 específico matar, suspender 106 células/ml y para hgp10025–33 específico matar, resuspender en 1006 células/mL.
- Vuelta las células restantes a temperatura ambiente durante 5 minutos a 475 x g. aspiración el sobrenadante y resuspender en 15 mL PBS frío para lavar las células. Repetir una vez más la etapa de lavado. Vuelta las células a temperatura ambiente durante 5 minutos a 475 x g. aspiración el sobrenadante y resuspender en PBS frío según volumen final determinado en el paso 2.4.
- Transferir la suspensión unicelular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y no en hielo hasta su inyección en el receptor del ratón C57/BL6.
3. inyección de esplenocitos de ratones transgénicos
- Coloque el ratón C57/BL6 destinatario en un limitador con el lado dorsal hacia arriba. Rocíe el área base de la cola de inyección con alcohol isopropílico al 70%. Administrar por vía intravenosa 100 μl de suspensión de célula (sección 2) en la vena de la cola utilizando una aguja de 27 G con el bisel hacia arriba.
4. Covax administración
Nota: Si las células se inyectan en la tarde, covax debe administrarse dentro de las 18 h de la inyección de células a la mañana siguiente.
- Coloque el ratón en una caja claro la anestesia con isoflurano 1-3%. Después de ratones son completamente anestesiados, transferir los ratones a los conos de nariz conectados al colector de la cámara de anestesia. Mantener los ratones restringidos con el lado dorsal hacia arriba.
Nota: Anestesia es confirmada por una pizca de breve del dedo del pie para comprobar que una respuesta de retirada no se produce. La ley federal restringe el uso de isoflurano del orden de un veterinario con licencia. - Rocíe el área base de la cola de inyección con alcohol isopropílico al 70%. Inyectar 100 μl de solución de péptidos (de la sección 1) por vía subcutánea con una aguja de 27 G con la jeringa penetra 4-5 mm en la región base de la cola, la aguja bisel hacia arriba.
Nota: Los ratones son vacunados en un costado con la inyección subcutánea en la base de la cola10. - Inyectar 100 lateral de μl anti-CD40 anticuerpo (valores de 0,5 mg/mL) para el sitio de la inyección de la vacuna.
- Aplique cuidadosamente el imiquimod crema 50 mg/ratón en los sitios de vacunación. Frote la crema de imiquimod sobre la superficie hasta que la crema ya no es visible y es absorbida completamente.
- Inyectar 100 μl de proteína de rhIL-2 de 100,000 UI/mL por vía intraperitoneal (i.p.) en la región abdominal inferior. Observar los ratones durante 5 minutos después de recuperarse totalmente de la anestesia.
Nota: El experimento se pausa en este punto durante 3 días.
5. aislamiento de esplenocitos de destino para el etiquetado con CFSE
Nota: Aislamiento de células desde el bazo debe realizarse de forma estéril.
- Eutanasia a los ratones C57BL/6 según el método de asfixia aprobado de CO2 . Retire el spleen(s) como en el paso 2.1.1. Desagregación del bazo y lavar esplenocitos como en los pasos 2.2.1 - 2.2.3. Lyse células de sangre rojas como en los pasos 2,3 - 2.3.2.
- Extraer células para contar utilizando un hemocitómetro y calcular para una concentración final de células a 106 células/mL en solución de etiquetado CFSE (descrito en el paso 7). Células restantes a temperatura ambiente durante 5 minutos a 475 x aspirar sobrenadante de g. de la vuelta.
6. péptido pulsación de esplenocitos de destino
Nota: Péptido pulsación debe realizarse de forma estéril.
- Resuspender las células en 106 células/mL en medios de información (medios RPMI 1640 con 10% FBS, 1% L-glutamina (L-Gln), 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep)). Las células se dividen en 2 tubos (etiquetadores de 15 mL). Etiquetar cada tubo de pulsado o unpulsed.
-
Añadir péptido al tubo etiquetado pulsada. Para OVA257–264 pulsación, añadir 1 μg/mL y hgp10025–33 pulsación, añadir 2 μg/mL.
Nota: Las células unpulsed se someten a la misma incubación como las células pulsadas sólo sin la adición del péptido.- Incube las células + péptido a 37 ° C durante 1 hora.
- Añadir 10 mL de medio completo (medios RPMI 1640 con 10% FBS, 1% L-glutamina (L-Gln), 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep)) a cada tubo para lavar tanto pulsada y unpulsed las células diana. Células restantes a temperatura ambiente durante 5 minutos a 475 x aspirar sobrenadante de g. de la vuelta.
7. preparación de la CFSE para el etiquetado de esplenocitos de destino
-
Preparar la solución de etiquetado CFSE durante la célula en paso 6.3; las células pulsadas serán marcadas como CFSEHola y el unpulsed como CFSElo. Preparar 1 mL de solución de etiquetado CFSE 106 células.
Nota: CFSE es sensible a la luz y debe protegerse de la luz en todo momento.- Preparar CFSEHola -etiquetado de los medios de comunicación mediante la adición de 1 uL/mL CFSE (solución stock de 5 mM) para una concentración final de 5 μm/mL en Medio RPMI 1640 con un 2% FBS.
- Preparar CFSElo -etiquetado de los medios de comunicación mediante la adición de 1 uL/mL CFSE (solución 0.5m m) para una concentración final de 0,5 media de μm/mL RPMI 1640 con un 2% FBS.
8. etiquetado de esplenocitos de destino con CFSE
Nota: CFSE etiquetado debe realizarse de forma estéril.
- Resuspender las células de la blanco pulsada y unpulsed (de paso 6.3) a 106 células/mL etiquetado CFSE medios de comunicación. Resuspender las células pulsadas con preparados CFSEHola-etiquetado de los medios de comunicación y las células unpulsed con preparados CFSElo-etiquetado de los medios de comunicación.
- Mezcle las células y medios etiquetado CFSE por inversión suave o remolinos. No mezclar con un vórtex. Incube las células y medios etiquetado CFSE a 37 ° C durante 15 minutos Remix las células cada 5 min.
- Añadir 10 mL de medio completo a cada células de suspensión y giro de celular a temperatura ambiente durante 5 min a x 475 g.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 10 mL de PBS frío. Girar las células a 4 ° C por 5 min a x 475 g.
- Repetir el punto 8.4.
- Contar las células y la mezcla de péptidos-pulsada, CFSEHola-etiquetado con unpulsed, CFSElo-etiqueta las células en una proporción de 1:1 para su inyección en ratones receptores. Mantener una alícuota de 1 x 106 mezclado las células a utilizar para una evaluación inicial de citometría de flujo (sección 11).
Nota: El volumen de inyección final es 100 μl por ratón. El recuento final de la célula es 10e6 células. Pérdida de volumen en la jeringa y la aguja debe ser tomado en cuenta y debe ser estimada en 500 μl.
9. inyección de las células diana
Nota: Mantenga las células marcado con CFSE protegidas de la luz antes y durante la inyección lo más posible.
- Coloque el receptoras ratones C57BL/6 en un limitador con el lado dorsal hacia arriba. Rocíe el área base de la cola de inyección con alcohol isopropílico al 70%. 100 μl de suspensión celular solo administrar por vía intravenosa en la vena de la cola con el bisel hacia arriba.
10. su aislamiento de las células diana
Nota: El momento de este paso es crítico y depende de la fuerza del antígeno para la estimulación y la citotoxicidad CTL. Para la evaluación de matar a un objetivo pulsado OVA257–264 , las células necesitan ser cosechado 4-6 h después de la inyección. Ya que células marcado con CFSE bazos sensibles, proceso luz en la oscuridad.
- Eutanasia el receptoras ratones C57BL/6 según el método de asfixia aprobado de CO2 .
- Retire el spleen(s) como en el paso 2.1.1. Desagregación del bazo y lavar esplenocitos como en los pasos 2.2.1 - 2.2.3. Lyse células de sangre rojas como en los pasos 2,3 - 2.3.2.
- Resuspender las células en células de fluorescencia activada 1 mL buffer (FACs) (1% BSA + PBS) de clasificación para la evaluación por citometría de flujo.
11. compuerta lógica para determinar la actividad CTL por citometría de flujo
-
Realizar evaluación de la actividad CTL utilizando un protocolo de citometría de flujo estándar. Adquirir las células mediante el canal FITC en un citómetro de flujo con láser 488 nm para la excitación11.
- Puerta en linfocitos vivo usando los parámetros de dispersión (SSC) lado de forward scatter (FSC) vs. Subgate dentro de la puerta en linfocitos de la población total de CFSE-positivo.
Nota: Las células inyectadas CFSE-labeled formarán un pequeño subconjunto de los linfocitos totales presentes en el bazo. Las células positivas de CSFE deben aparecer como dos poblaciones distintas en la escala log. - Utilice un formato de histograma para determinar el porcentaje de la unpulsed (izquierda pico, CFSElo) y pulsada (razón pico, CFSEHola) poblaciones. Pérdida de las células CFSEHola indica actividad CTL antígeno-específica.
- Puerta en linfocitos vivo usando los parámetros de dispersión (SSC) lado de forward scatter (FSC) vs. Subgate dentro de la puerta en linfocitos de la población total de CFSE-positivo.
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Representative Results
Antes de la inyección de las células diana marcada con CFSE, corre a la mezcla 1:1 células en un citómetro de flujo para determinar las frecuencias de línea de base del CFSEHola y CFSElo las células diana. Figura 1 A muestra la estrategia bloquea para detectar cambios en las poblaciones de la CFSE, una puerta inicial está hecha usando parámetros de FSC y SSC. Las células positivas de CFSE total entonces se subgated antes de evaluar cambios en la frecuencia, ya que esta población es relativamente pequeña en comparación con los esplenocitos endógena sin etiqueta. La frecuencia relativa de la CFSEHola CFSElo poblaciones y es el calculado mediante el establecimiento de la población total de CFSE-positivo al 100%. Este análisis puede hacerse utilizando un formato de trama de histograma o punto. En la figura 1Bse muestra un ejemplo de la frecuencia relativa de las poblaciones de CFSE antes de la inyección. Esta relación rara vez será exactamente 1:1 pero debe estar razonablemente cerca. La necesidad de cebado de la covax se muestra en la figura 1C donde ningún asesinato del antígeno pulsada, CFSEHola las células diana se observa en el post inyección de 24 h. Figura 1 D demuestra la muerte efectiva del antígeno pulsada, CFSEHola-etiquetado como células blanco como el pico que se observó antes de la inyección es casi desapercibido y la relación se cambia de puesto dramáticamente de 50% a 1% de detección. La figura también muestra la cinética de antígenos pulsada, CFSEHola-etiquetado matanza de la célula blanco mediante la evaluación de la pérdida de esta población en 24 h post inyección y 6 h.
Figura 1: Comparación de células marcadas al inicio y después de la inyección de las células diana marcada con CFSE. (A) se muestra la estrategia bloquea para la evaluación de la función CTL. Brevemente, energizados linfocitos son cerrados utilizando parámetros de forward scatter (FSC) vs lado scatter (SSC). Total células de CSFE-positivas son subgated dentro de la puerta de la célula viva. La relación de CFSEHola y CFSElo basa en su frecuencia respectiva dentro de la población total de CFSE-positivo. (B) siguientes CFSE etiquetado, células diana se mezclan 1:1 y evaluó la relación de CFSEHola y CFSElo las células mediante citometría de flujo. Los números indican la frecuencia de los picos correspondientes en un histograma (izquierda) y CFSE vs SSC punto trama formatos (derecha). (C) Esto demuestra la falta de células blanco matando sin vacunación previa con covax régimen. Esplenocitos fueron cosechada 24 h después de la inyección. (D) Esto demuestra la matanza de las antígeno-pulsada CFSEHola células diana a las 6 h (gráficos superior) y (gráficos inferiores) las 24 horas post inyección. Los números indican la frecuencia de los picos marcados con CFSE en un histograma (izquierda) y el formato (derecha) de CFSE vs SSC punto trama. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Si bien este protocolo es sencillo, hay algunos pasos críticos que deben realizarse con cuidado. El cebado covax después de la inyección de la célula de T específicas de antígeno sometido a prueba es necesario ver todo asesinato de objetivos pulsados. Aunque es posible que la vacunación a base de agua covax crea una condición inflamatoria aguda, para la fase inflamatoria crónica, cambiar la formulación a base de agua de breve duración con un enfoque de base de aceite de liberación lenta del antígeno puede producir un mejor resultado7,12.
Además, la CFSE-rotulación de las células diana antígeno necesidades pulsación uniforme para una lectura de citometría de flujo ideal. El etiquetado de la CFSEHola con 5 μm y el CFSElo con 0,5 μm fue encontrado para ser ideal en este sistema para proporcionar una diferencia de registro en las poblaciones que podían distinguirse fácilmente.
Este protocolo es fácil de modificar para el sistema de antígeno específico de la prueba. En primer lugar, se debe confirmar la concentración de péptido administrado como parte de la covax. Una manera simple de determinar esta concentración adecuada es vacunar y seguimiento de la expansión de las células T inyectadas, específica de antígeno en la sangre. En este caso, un antígeno débil (hgp10025-33) requiere dos veces ḿas péptido como un antígeno fuerte (OVA257–264). Las concentraciones validadas utilizadas en este protocolo sería un razonable punto de partida para otros antígenos basados en la fuerza del estímulo de prueba. Un punto de la modificación sería simplemente vacunar el ratón de tipo salvaje con un antígeno de interés seguida por péptido pulsada objetivos para evaluar la función de CTL. Sin embargo, esta modificación se basaría en la activación y expansión de la respuesta específica de antígeno endógeno y hasta el momento de la transferencia de la célula objetivo probablemente necesitaría ocurren entre 7 y 14 días después de la inmunización. Además, el nivel de antígeno específico homicidio puede ser reducido en comparación con que observa al transferir células T transgénicas. Un problema con esta modificación es que el nivel de respuesta CTL en el destino puede ser demasiado bajo para ser detectada.
Además de la cantidad de antígeno necesaria para el cebado del T-cell, el tiempo del re-aislamiento de las células blanco marcado con CFSE debe optimizarse para una determinada hipótesis. Modificaciones a la célula de T está probaron que resultado en diferencial matando capacidades puede requerir ajustes en el momento del nuevo aislamiento. Una célula de T con una función de la mayor matanza debe tener objetivos evaluados mucho más rápido que su contraparte de tipo salvaje. Este perfil cinético debería estudiarse cuidadosamente para determinar el punto óptimo para abordar la hipótesis probada. En general, hemos encontrado que varían entre 4 y 24 h después de la inyección de las células diana.
Una limitación del análisis es que las células efectoras no han sido estimuladas crónicamente para inducir un estado agotado. Por lo tanto, función CTL está restringida a células efectoras activadas recientemente. Es posible que este método podría modificarse para evaluar la función de memoria de una capacidad de población o matar la memoria de un subconjunto de crónicamente activa específica de antígeno la célula de T, que sería interesante para futuras aplicaciones.
Este método de prueba de función CTL en vivo permite la detección rápida de en vivo de la matanza supera algunas de las limitaciones de una en vitro . Un sistema inmune intacto y el oscurecimiento de las células T transferidos mediante el método covax se basa en la presentación de péptidos y la estimulación por las células presentadoras de antígeno endógenas. A diferencia de otros en vivo matando a ensayos, este método no requiere una infección o la presencia de un objetivo de tumor. Sin embargo, la adición de un objetivo de tumor proporcionaría un comparador adicional y se podría agregar para el ensayo antes de la inyección de las células T antígeno específicas y administración covax para futuras aplicaciones de este método.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por la investigación de NIH (A1R03AI120027 (RN) y 1R21AI20012 (RN)), beca de investigación institucional (RN), puesta en marcha conceder (RN), y semilla de MD Anderson CIC concede (RN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 to 12 week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12 week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
References
- Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
- Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
- He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
- Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
- Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
- Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).
