Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Published: November 28, 2017 doi: 10.3791/56255
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 2
1Department of Melanoma Medical Oncology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Immunology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Radiation Oncology, The Second Hospital of Jilin University
* These authors contributed equally

Summary

Bu iletişim kuralının amacı antijen spesifik bir fare modelinde bir hedef hücrenin öldürmek için hafiye-in vivo sağlamaktır.

Abstract

Antijen spesifik öldürmek için mevcut metodolojiler vitro kullanmak için sınırlı veya bulaşıcı hastalık modellerinde kullanılmaktadır. Ancak, değil özellikle enfeksiyon öldürmeden antijen spesifik ölçmek amacıyla bir protokol vardır. Bu iletişim kuralı tasarlanmıştır ve antijen spesifik tespiti için izin vererek bu sınırlamaları aşmak için yöntemler açıklanır hedef hücrenin CD8 tarafından öldürmek+ T hücreleri vivo içinde. Bu bir aşı modeli tahlil öldürmek bir geleneksel CFSE etiketli hedef ile birleştirerek gerçekleştirilir. Bu kombinasyon tahlil tümör büyüme veya enfeksiyon bağımlı olmadığı gibi antijen spesifik CTL potansiyel doğrudan ve hızlı bir şekilde değerlendirmek araştırmacı sağlar. Ayrıca, okuma Akış Sitometresi üzerinde temel alır ve bu yüzden çoğu araştırmacı için kolayca erişilebilir olması gerekir. Çalışmanın büyük sınırlama test edilen hipotez için uygun zaman çizelgesi vivo tanımlayan iş. Antijen gücü değişimler ve fark cytolytic işlevinde neden olabilir T hücreleri mutasyonların hücre hasat ve değerlendirme için en uygun zamanı belirlemek için dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi gerekir. Peptid aşılama için uygun konsantrasyonu hgp10025-33 ve OVA257-264için optimize edilmiştir, ama daha fazla doğrulama için belirli bir çalışma daha uygun olabilir diğer peptidler için gerekli olacaktır. Genel olarak, bu iletişim kuralı işlevi vivo içinde öldürme hızlı bir değerlendirme sağlar ve herhangi bir verilen antijen için adapte edilebilir.

Introduction

Birden çok iletişim kuralı bir CD8 cytolytic (CTL) potansiyelini değerlendirmek için mevcut+ veya CD4+ T hücre. Bu değerlendirme vitro kontrollü şartlar1,2,3altında kolayca yapılabilir. Buna ek olarak, bulaşıcı hastalık modelleri, LCMV gibi klasik CTL işlev hedef hücreleri etiketli differentially CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) aracılığıyla inceledik nerede CFSEMerhaba-etiketli hücreleri bir peptid ve CFSEloile geniş puls-etiketli hedef hücre are sol unpulsed. Hücreleri sonra bir 1:1 oranında enjekte ve kaybı CFSEMerhabaiçin değerlendirildi-darbeli hedefleri Akış Sitometresi4tarafından etiketli. Aşı ve ret modelleri de benzer stratejileri için kullanmış her iki CD8 tarafından öldürmek vivo içinde değerlendirilmesi+ ve CD4+ T hücreleri de5,6NK hücreleri. Bu güçlü bir tahlil ancak bağışıklık sistemi hedef enjeksiyon önce Başbakan enfeksiyöz ajanlar kullanımını gerektirir.

Bu iletişim kuralı, öte yandan, ana bilgisayarın önceki enfeksiyon gerektirir ve bunun yerine hedef enjeksiyon önce bağışıklık sistemi hazırlamak için bir aşı strateji kullanır. Bu aşı bir su bazlı bir immunostimulatory kokteyl covax7bir Toll benzeri reseptör 7 (TLR7) oluşan, adı verilen hükmü gerektiren peptid aşı formülasyon oluşur agonist (imiquimod krem), agonistik bir anti-CD40 antikor ve immunostimulatory maddeleri, yaşla peptid özgü astar ve güçlü bağışıklık yanıtı için sinerjik birleşime önde gelen interleukin-2 (IL-2). Bu nedenle, aşı sadece üç gün önce hedef hücrelerin enjeksiyon ile birlikte işlev değerlendirmesi için hücreleri işletilmektedir gibi bu tahlil CTL işlevinin bir hızlı okuma sağlar. Buna ek olarak, covax astar yeterince güçlü astarlanmalıdır antijen spesifik T hücre öldürme kapasitesi 4 ile 24 h sonra enjeksiyon arasında görülebilir.

Bu protokol büyük sınırlama antijen ve test edilen hipotez için uygundur hedef öldürme tespiti için zaman çizelgesi vivo tanımlayan iş. Dikkatli değerlendirme gerçekleştirilmelidir, varyasyonları antijen gücü hem de genetik değişiklikler olarak T-hücreleri test edilen hedef öldürme farklı zamanlama algılamaya gerektirecektir fark CTL işlevinde neden olabilir. Ayrıca, süre peptid uygun konsantrasyonu için aşı insan Melanom antijen glycopeptide 100 (hgp10025-33) için optimize edilmiş ve ovalbumin257-264 (OVA257-264)8,9 , belirli bir çalışma için daha uygun olabilir başka bir antijen model kullanımı daha fazla doğrulama gerektirir. CTL efektör fonksiyonu covax ile birlikte bir adjuvan olarak uyarmak için bir hedef antijenleri kapasite beklenen farklılıklar nedeniyle IL-2 doz konsantrasyon ve doz sıklığı duruma getirilmesi istenen hedefe ulaşmak için gerekli olabilir. Genel olarak, bu iletişim kuralı işlevi vivo içinde öldürme hızlı bir değerlendirme sağlar ve herhangi bir verilen antijen için adapte edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) University of Texas MD Anderson Kanser Merkezi tarafından onaylanmıştır.

1. aşı için peptid hazırlanması

  1. Fosfat tamponlu tuz (PBS) uygun konsantrasyon ve 30 için girdap ile lyophilized peptid dağıtılması s.
    Not: hgp10025-33için son konsantrasyonu 1 mg/mL ve OVA257-264için son konsantrasyonu 0.5 mg/mL. Peptid enjeksiyon önce yeniden oluşturma. Sulandırma sonra depolamayın.

2. Splenocytes transgenik fareden yalıtım

Not: Dalak hücre izolasyon steril bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.

  1. Onaylanmış CO2 boğulma yöntemini kullanarak OT-1 transgenik fare ötenazi ve dalak kaldırın.
    Not: Bu adımda seçim peptid için belirli uygun transgenik fare kullanılmaktadır.
    1. Fareyi sağ yan yattı. Sprey % 70 etanol (alkol) fareyle sol tarafında. Deri forseps kullanarak çekin ve Cerrahi makas kullanarak deriyi kesme; dalak peritoneal kavite içinde görünür. Yavaşça dalak erişmek için Periton boşluğuna kesmiş. Dalak forseps kullanarak kaldırın.
  2. Dalak bir petri kabına (PBS % 1 fetal sığır serum (FBS) ile) 2 mL orta A ile 70 µm filtrede yerleştirerek ve lavabo pompası sonu ile dalak smashing tarafından disaggregate.
    1. Splenocytes yeri bir 50 mL konik tüp ve petri kabına toplamak. Petri kabına orta iki kez tüm hücreleri toplamak için A 5 mL ile yıkayın. Orta bir up için 25 mL ekleyin ve hücreler için 475 x g de oda sıcaklığında 5 dk santrifüj kapasitesi.
  3. Hücreleri Aspire edin ve resuspend 1 ml / dalak kırmızı kan hücresi (RBC) lizis arabellek başı. Kuluçkaya 5 dakika süreyle oda sıcaklığında eklemek 10 mL orta A ve santrifüj 475 x g., oda sıcaklığında Pelet orta A 10 ml Resuspend ve hücre süspansiyon 70 µm filtre içine temiz bir 50 mL konik yoluyla filtreleme tarafından enkaz kaldırmak.
  4. Trypan mavi ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. PBS hücrelerde son konsantrasyonu 10 resuspend6 - 1006 hücre/mL. OVA257için-264 özel 106 hücre/mL öldürme, resuspend ve hgp100 için25-33 belirli 1006 hücre/mL öldürme, resuspend.
    1. 475 x g., 5 min için oda sıcaklığında kalan hücreleri süpernatant Aspire edin ve 15 mL soğuk PBS hücreleri yıkamayı resuspend spin. Yıkama adım bir kez daha yineleyin. Hücreleri 475 x g., 5 min için oda sıcaklığında süpernatant Aspire edin ve 2.4. adımda belirlenen son hacmine göre soğuk PBS resuspend spin.
    2. Tek hücre süspansiyon 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve alıcı C57/BL6 fare içine enjeksiyon kadar buz üzerinde tutun.

3. Splenocytes transgenik fareler üzerinden enjeksiyon

  1. Bir restrainer dorsal yüzü alıcı C57/BL6 fare yerleştirin. Enjeksiyon kuyruk taban alanı % 70 izopropil alkol ile sprey. Tek hücre süspansiyon (Bölüm 2), 100 µL intravenöz eğim yüzü yukarı bakacak şekilde 27 G iğne kullanarak kuyruk ven içine yönetmek.

4. Covax yönetim

Not: Eğer hücreler öğleden sonra enjekte edilir, covax ertesi sabah 18 h hücre enjeksiyon içinde yönetilmesi.

  1. Fare ile % 1-3 isoflurane açık anestezi kutusuna yerleştirin. Fareler tam anestezi sonra manifold anestezi odasında bağlı burun koni için fareler aktarın. Sırt yanında kadar ölçülü fareler tutun.
    Not: Anesthetization para çekme yanıt değil elde edildi doğrulamak için bir kısa ayak çimdik tarafından onaylanır. Federal yasa isoflurane Kullanım sırasına lisanslı bir veteriner kısıtlar.
  2. Enjeksiyon kuyruk taban alanı % 70 izopropil alkol ile sprey. Peptid çözümden (Bölüm 1) 100 µL subkutan enjekte içine kuyruk temel bölge, iğne eğim yüzü yukarı bakacak şekilde 4-5 mm nüfuz şırınga ile 27 G iğne kullanarak.
    Not: Fare kuyruğu10tabanında Subkutan Enjeksiyon ile bir kanat içinde aşı.
  3. 100 µL anti-CD40 antikor (0,5 mg/mL stok) lateral aşı enjeksiyon yeri için enjekte.
  4. Dikkatle imiquimod krem 50 mg/fare aşı sitelerde geçerlidir. Kadar krem artık görünür ve tamamen emilir yüzeyde imiquimod krem sür.
  5. İntraperitoneally 100 µL 100.000 IU/mL rhIL-2 protein enjekte (IP), alt karın bölgesi. Onlar tamamen anesteziden iyileştikten sonra fare 5 min için gözlemlemek.
    Not: Deney 3 gün boyunca bu noktada duraklatıldı.

5. CFSE ile etiketleme için hedef Splenocytes yalıtım

Not: Dalak hücre izolasyon steril bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.

  1. C57BL/6 fareler onaylı CO2 boğulma yöntemine göre ötenazi. Spleen(s) olduğu gibi adım 2.1.1 kaldırın. Dalak disaggregate ve splenocytes olduğu gibi adımları 2.2.1 - 2.2.3 yıkayın. Kırmızı kan hücreleri adımları 2.3 - 2.3.2 olduğu gibi koşullar.
  2. Bir hemasitometre kullanarak sayım için hücre kaldırma ve hücre 106 hücre/mL CFSE-etiketleme çözümü (7. adımda açıklanan), son bir konsantrasyon için hesaplayın. G. aspiratı süpernatant x 475, 5 min için oda sıcaklığında kalan hücreleri spin.

6. peptid hedef Splenocytes darbe

Not: Peptid darbe steril bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.

  1. Senaryo Özeti 106 hücre/mL tam medya resuspend (% 10 ile RPMI 1640 medya FBS, % 1'l-glutamin (L-Gln), % 1 penisilin/streptomisin (kalem/Strep)). 2 tüpler (15 mL conicals) içine hücreleri bölün. Her tüpün darbeli veya unpulsed olarak etiketleyin.
  2. Peptid etiketli tüp için Geniş puls ekleyin. OVA257-264 darbe için 1 µg/mL ekleyin ve darbe hgp10025-33 için 2 µg/mL ekleyin.
    Not: Unpulsed hücreleri aynı kuluçka peptid ek olmadan sadece pulsed hücreler olarak tabi.
    1. Kuluçkaya hücreleri + 37 ° c için 1 h peptid.
  3. 10 mL tam medya ekleyin (RPMI 1640 medya % 10 ile FBS, % 1'l-glutamin (L-Gln), % 1 penisilin/streptomisin (kalem/Strep)) yıkamak için her tüp için her ikisi de darbe ve unpulsed hedef hücreler. G. aspiratı süpernatant x 475, 5 min için oda sıcaklığında kalan hücreleri spin.

7. hedef Splenocytes etiketleme için hazırlanması CFSE

  1. 6.3. adımda yıkama hücre sırasında CFSE etiketleme çözüm hazırlamak; Darbeli hücreleri CFSEMerhaba ve unpulsed CFSEloetiketlenir. 1 mL CFSE-etiketleme çözeltisi 106 hücreler için hazırlayın.
    Not: CFSE ışığa duyarlı ve ışık her zaman korunmalıdır.
    1. CFSEMerhaba hazırlamak-etiketleme medya RPMI medya %1640 2 ile 1 uL/mL CFSE (5 mM stok çözelti) 5 µM/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyerek FBS.
    2. CFSElo hazırlamak-etiketleme medya 1 uL/mL CFSE (0,5 mM stok çözelti) 0.5 µM/mL RPMI medya %1640 2 ile son bir konsantrasyon için ekleyerek FBS.

8. hedef Splenocytes CFSE ile etiketlerine göre

Not: CFSE etiketleme steril bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.

  1. Darbeli ve unpulsed Hedef hücrelerden (adım 6.3) 106 hücre/mL medya CFSE etiketleme resuspend. Darbeli hücreleri ile hazırlanmış CFSEMerhabaresuspend-medya ve unpulsed hücreleri etiketleme hazırlanan CFSElo-etiketleme medya.
  2. Hücreleri ve CFSE etiketleme medya nazik inversiyon veya dönen karıştırın. Vortexing tarafından bir arada kullanmayın. Hücreleri kuluçkaya ve CFSE etiketleme medya 15 dk. 37 ° C'de hücreler her 5 dk Remix.
  3. Her hücre süspansiyon ve spin hücrelere 475 x g de 5 min için oda sıcaklığında 10 mL tam medya ekleyin.
  4. Süpernatant Aspire edin ve 10 mL soğuk PBS hücrelerde resuspend. 475 x g de 5 min için 4 ° C'de hücreler spin.
  5. 8.4 arasındaki adımları yineleyin.
  6. Hücreleri ve mix peptid Geniş puls, CFSEMerhabasaymak-unpulsed, CFSEloile etiketli-hücreleri alıcı fareler içine enjeksiyon için 1:1 oranında etiketli. 1 x 106 temel Akış Sitometresi değerlendirmesi (Bölüm 11) için kullanacağınız hücre karışık bir aliquot tutmak.
    Not: Son enjeksiyon için fare başına 100 µL birimdir. Son hücre sayısı 10e6 hücreleri olduğunu. Şırınga ve iğne hacim kaybı dikkate alınması gerekir ve 500 µL tahmin edilebilir.

9. enjeksiyon hedef hücre

Not: CFSE etiketli hücreleri ışık öncesinde ve mümkün olduğu kadar enjeksiyon sırasında korumalı tutun.

  1. Bir restrainer dorsal yüzü alıcı C57BL/6 farelerde yerleştirin. Enjeksiyon kuyruk taban alanı % 70 izopropil alkol ile sprey. Tek hücre süspansiyon, 100 µL kuyruk damar içine eğim yüzü yukarı bakacak şekilde intravenöz yönetmek.

10. yeniden yalıtım hedef hücre

Not: Bu adımı zamanlaması kritik ve CTL sitotoksisite ve uyarılması için antijen gücünü bağımlı değil. Bir OVA257-264 pulsed hedef öldürme değerlendirme için hücreleri enjeksiyon sonra hasat 4-6 h olmak istiyorum. CFSE etiketli hücreleri karanlıkta ışık duyarlı, süreç dalağı olduğundan.

  1. Alıcı C57BL/6 fareler onaylı CO2 boğulma yöntemine göre ötenazi.
  2. Spleen(s) olduğu gibi adım 2.1.1 kaldırın. Dalak disaggregate ve splenocytes olduğu gibi adımları 2.2.1 - 2.2.3 yıkayın. Kırmızı kan hücreleri adımları 2.3 - 2.3.2 olduğu gibi koşullar.
  3. Hücreleri (FACs) arabellek (%1 BSA + PBS) sıralama 1 mL Floresans aktif hücredeki değerlendirmesi için Akış Sitometresi tarafından resuspend.

11. gating mantığı tarafından Akış Sitometresi CTL etkinliğini belirlemek için

  1. Standart Akış Sitometresi protokolü kullanarak CTL etkinliğini değerlendirmesini gerçekleştirin. Hücrelerin uyarma11488 nm lazer ile bir Akış Sitometresi FITC kanal kullanarak elde.
    1. Canlı lenfositler ileri dağılım (FSC) vs yan dağılım (SSC) parametrelerini kullanarak kapıda. Toplam CFSE pozitif nüfus için canlı lenfosit kapısı içinde subgate.
      Not: Enjekte CFSE etiketli hücreleri dalak içinde mevcut toplam lenfositlerin küçük bir alt kadar yapacaktır. CSFE-pozitif hücreler günlük ölçekte iki ayrı nüfus olarak görünmesi gerekir.
    2. Unpulsed (sol üst noktası, CFSElo) ve darbeli (sağ üst noktası, CFSEMerhaba) yüzdesini belirlemek için bir çubuk grafik biçimi kullanın nüfus. CFSEMerhaba hücre kaybı antijen spesifik CTL aktiviteyi göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Önce enjeksiyon CFSE etiketli hedef hücre 1:1 cep karışımı CFSEMerhaba hem CFSElo hedef hücreleri temel frekansları belirlemek için bir Akış Sitometresi çalıştırılır. Resim 1 A gösterir gating strateji CFSE nüfus değişiklikleri algılamak için bir ilk kapısı FSC ve SSC parametreleri kullanılarak yapılır. Bu nüfus için etiketlenmemiş endojen splenocytes göre nispeten küçük olduğu gibi toplam CFSE pozitif hücreler sonra frekans değişiklikleri değerlendiriliyor önce subgated. CFSEMerhaba ve CFSElo nüfus göreli sıklığı hesaplanan toplam CFSE pozitif nüfusunun % 100 ayarlanmasıdır. Bu analizi yapılabilir bir çubuk grafik veya nokta çizim biçimini kullanarak. Enjeksiyon öncesi CFSE nüfusun göreli sıklığı örneği şekil 1' deBgösterilir. Bu oran nadiren tam olarak 1:1 olacak ama oldukça yakın olmalıdır. Covax astar gerekliliğini CFSEMerhaba hedef hücreleri 24 saat mesaj enjeksiyon gözlenen şekil 1' de nerede antijen öldürmek yok darbe,C gösterilir. Resim 1 D gösterir antijen etkili öldürülmesi darbe, CFSEMerhaba-hedef hücreler olarak enjeksiyon önce gözlendi zirve neredeyse fark edilmeden ve % 1 algılama oranı dramatik % 50 den başlayarak kaymıştır etiketli. Şekil Ayrıca antijen Kinetik darbe, CFSEMerhabagösterir-bu nüfus 6 h ve 24 h mesaj enjeksiyon kaybı değerlendirme tarafından hedef hücre öldürme etiketli.

Figure 1
Şekil 1: Temel ve enjeksiyon CFSE etiketli hedef hücre takip etiketli hücreleri karşılaştırılması. (A)CTL işlev değerlendirmesi gating strateji gösterilir. Kısaca, canlı lenfositler ileri dağılım (FSC) vs yan dağılım (SSC) parametrelerini kullanarak kapı. Toplam CSFE pozitif hücreler içinde canlı hücre kapısı subgated. CFSEMerhaba ve CFSElo oranı toplam CFSE pozitif nüfus içindeki ilgili onların sıklığını dayanır. (B) aşağıdaki etiketleme CFSE hedef hücreleri 1:1 karışık ve CFSEMerhaba ve CFSElo hücre oranı için Akış Sitometresi tarafından değerlendirildi. Sayıları (solda) bir çubuk grafik ve CFSE vs SSC nokta Arsa (sağda) biçimleri ilgili doruklarına frekans gösterir. (C) bu hedef hücreleri covax rejimi ile önceden aşı olmadan öldürmek eksikliği gösterir. Splenocytes hasat 24 saat sonra enjeksiyon vardı. (D) bu antijen Geniş puls CFSEMerhaba hedef hücreleri 6 h (üstte bulunan grafik) öldürülmesi gösterir ve 24 s (altta bulunan grafik) enjeksiyon sonrası. Sayıları bir çubuk grafik (solda) ve CFSE vs SSC nokta Arsa (sağda) biçimi CFSE etiketli doruklarına sıklığını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu iletişim kuralı basit olmakla birlikte, dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gereken birkaç önemli adımlar vardır. Enjeksiyon antijen spesifik T-hücre test edilen takip covax astar pulsed hedeflerinden herhangi bir öldürme görmek gereklidir. Kısa ömürlü su bazlı formülasyonu yavaş-antijen serbest yağ bazlı bir yaklaşımla yerine su bazlı covax aşı kronik enflamatuar faz için bir akut iltihabi durum oluşturur mümkün olsa daha iyi bir neden olabilir sonucu7,12.

Buna ek olarak, CFSE etiketleme antijen nabız gibi atan bir ideal Akış Sitometresi göstergesi için tek tip olması gereken aşağıdaki hedef hücre. CFSEMerhaba 5 mikron ile ve CFSElo 0.5 µM ile etiketleme ideal bir günlük fark kolayca ayırt edilebilir nüfus sağlamak için bu sistem içinde bulundu.

Test edilen spesifik antijen sistemi değiştirmek basit bir protokoldür. İlk olarak, covax bir parçası olarak yönetilen peptid konsantrasyonu onaylanması. Bu uygun konsantrasyonu belirlemek için basit bir yol aşılamak ve genişleme kan enjekte, antijen spesifik T hücrelerinin takip etmektir. Bu durumda, zayıf antijen (hgp10025-33) güçlü bir antijen (OVA257-264) iki kat daha fazla peptid gerektirir. Bu protokol için kullanılan doğrulanmış konsantrasyonları in dürtme gücüne dayalı diğer antijenleri test etmek için makul bir başlangıç noktası olur. Değişiklik bir nokta sadece vahşi tipi fare peptid tarafından takip ilgi bir antijen ile bağışıklık için CTL-işlev değerlendirmek için hedefler darbe olurdu. Ancak, bu değişiklik üstünde belgili tanımlık harekete geçirmek ve endojen antijen spesifik yanıt-e doğru genişlemesi güvenmek istiyorsunuz ve çok hedef hücre aktarımı zamanlaması büyük olasılıkla 7-14 gün sonra aşılama gerçekleşmesi gerekir. Buna ek olarak, antijen spesifik öldürme düzeyini büyük ölçüde göre için transgenik T hücreleri aktarırken gözlenen azalabilir. Bu değişiklik ile bir ihtar CTL yanıt-e doğru hedef düzeyini tespit edilmesini çok düşük olabilir olduğunu.

T-hücre astar için gerekli antijen miktarına ek olarak, CFSE etiketli hedef hücre yeniden yalıtım zamanlaması belirli bir hipotez için optimize edilmiş olması gerekir. T-hücre olmak için değişiklikleri test sonucunda diferansiyel içinde yetenekleri öldürmek yeniden tecrit zamanlaması ayarlar gerektirebilir. T-hücre ile bir gelişmiş öldürme görev hedefleri çok bağlamamak--dan onun vahşi tipi muadili değerlendirildi olması gerekmektedir. Bu kinetik profil dikkatle test edilmiş hipotez gidermek için en uygun timepoint belirlemek için keşfedilmeyi. Genel olarak, biz bu hedef hücre enjeksiyon sonra 4 ile 24 s arasında değişir bulduk.

Bir tahlil efektör hücrelerin kronik bitkin bir duruma ikna etmek için teşvik değil olduğunu kısıtlamasıdır. Bu nedenle, CTL işlevi son etkinleştirilen efektör hücrelere sınırlıdır. Bu yöntem hangi-cekti var olmak için gelecekteki uygulamalar ilginç bir kronik aktif antijen spesifik T hücre alt bir bellek nüfus veya öldürme yeteneğini geri çağırma işlevini değerlendirmek için değiştirilmiş olabilir mümkündür.

Bu öldürme vivo içinde hızlı algılama bazı sınırlamaları ayarlama bir vitro üstesinden gelir için CTL işlevi vivo içinde test bu yöntem sağlar. Sağlam bir bağışıklık sistemi yer ve peptid sunum ve endojen antijen sunan hücreler tarafından ortak stimülasyon astar covax yöntemi ile aktarılan T hücrelerinin dayanan. Deneyleri öldürmek diğer vivo içinde farklı olarak, bu yöntem bir enfeksiyon veya tümör hedefin varlığını gerektirir. Ancak, bir tümör hedef yanı sıra ek bir karşılaştırıcı sağlayacak ve antijen spesifik T hücreleri ve covax yönetim bu yöntemin gelecekteki uygulamalar için enjeksiyon önce tahlil için eklenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser NIH araştırma tarafından desteklenmektedir (A1R03AI120027 (RN) ve 1R21AI20012 (RN)), kurumsal araştırma hibe (RN), başlangıç (RN) vermek ve MD Anderson CIC tohum vermek (RN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 to 12 week old female C57BL/6 mice  Charles River 027 C57 Black 6 mice
OT-1 6-12 week old female mice  Jackson Labs 003831
hgp10025–33  CPCScientific 834139 KVPRNQDWL
OVA 257–264  CPCScientific MISC-012 SIINFEKL
Imiquimod cream 5%  Fougera 51672-4145-6 Aldara Cream
CD40-specific mAb  BioXcell BE0016-2 clone FGK4.5
rhIL-2 protein  Hoffman LaRoche Inc 136 Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep  Kendall S-17474
PBS Life Technologies 10010-023 Phosphate Buffered Saline
FBS Life Technologies 26140-079 fetal bovine serum
RBC lysis buffer  Life Technologies A10492-01 red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
L-Glutamine  Life Technologies 25030081
Pen/Strep Life Technologies 15140122 penicillin/streptomycin
CFSE Life Technologies C34554 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  A4503
1.5 mL MCT graduated natural  Fisher 05-408-129 microcentrifuge tube
70% ethanol Fisher BP8201500 EtOH
Trypan blue solution, 0.4%   Life Technologies 15250-061
Hemocytometer Fisher 267110
27 gauge needle BD 305109
1 mL syringe BD 309659

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
  2. Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
  3. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  4. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
  5. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
  6. Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
  7. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
  8. Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
  9. Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
  10. Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
  11. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).

Tags

İmmünoloji sayı: 129 Cytolytic işlevi CD8+ T hücreleri VIVO tahlil peptid aşı CFSE etiketleme akut yanıt
<em>Vivo</em> Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haymaker, C. L., Hailemichael, Y.,… More

Haymaker, C. L., Hailemichael, Y., Yang, Y., Nurieva, R. In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model. J. Vis. Exp. (129), e56255, doi:10.3791/56255 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter