Summary
En protokoll for studiet av desensitization og følsomhet utvinning av kreps fotoreseptorene som en funksjon av døgn er presentert.
Abstract
En metode for å studere desensitization og utvinning av kreps fotoreseptorene er presentert. Vi utførte intracellulære elektriske opptak av foto reseptoren celler i isolerte eyestalks ved hjelp av en usammenhengende konfigurasjon med én elektrode byttet spenning. Først med et barberblad lagde vi en åpning i rygg hornhinnen for å få tilgang til netthinnen. Deretter satte vi inn et glass elektrode gjennom åpningen, og penetrert en celle som rapportert av innspillingen av et negativt potensial. Membran potensialet ble klemt ved Foto reseptoren hvile potensial og en lys puls ble brukt for å aktivere strøm. Til slutt ble de to lys-Flash-protokollen ansatt for å måle dagens desensitization og utvinning. Den første lys-flash utløser, etter en lag periode, den Transduction joniske strøm, som etter å ha nådd en topp amplitude henfall mot en ufølsomme tilstand; den andre blitsen, brukt ved varierende tidsintervaller, vurderer tilstanden til den lys aktiverte konduktans. For å karakterisere lys-elicited strøm, tre parametre ble målt: 1) latency (tiden gått mellom lys blits levering og det øyeblikket hvor strømmen oppnår 10% av sin maksimale verdi); 2) topp strøm; og 3) desensitization tid konstant (eksponentiell tid konstant av gjeldende forfall fase). Alle parametere påvirkes av den første pulsen.
For å kvantifisere utvinningen fra desensitization, var forholdet P2/P1 ansatt versus tid mellom pulser. P1 er topp strømmen fremkalt av den første lys-puls, og P2 er topp strømmen fremkalt av den andre pulsen. Disse dataene ble montert til en sum av eksponentiell funksjoner. Til slutt ble disse målingene utført som funksjon av døgn.
Introduction
For å bli oppfattet som en visuell stimulans, lys når øynene må transduced til et elektrisk signal. Derfor, i alle visuelle organismer, utløser lys en Transduction ion-strøm, som igjen gir en endring i membranen potensialet i Foto reseptoren celler, den såkalte reseptor potensial. På grunn av dette avhenger lysfølsomheten i øyet hovedsakelig av tilstanden til lyset aktivert konduktans, som kan være enten tilgjengelig for å bli aktivert eller ufølsomme.
I kreps fotoreseptorene, utløser lys en langsom, forbigående, ioniske nåværende1. Ved belysning oppstår den Transduction strømmen etter et etterslep eller ventetid før den når sitt maksimum; deretter det henfall, som Transduction kanaler faller inn i en ufølsomme tilstand der de ikke svarer til ytterligere lys stimulans2. Det er, lys, i tillegg til å aktivere Transduction nåværende ansvarlig for visjonen, også induserer en forbigående reduksjon av følsomheten til Foto reseptoren celler. Desensitization kan representere en generell beskyttelsesmekanisme mot å bli en tilstrekkelig stimulans. Øyets følsomhet for lys gjenopprettes etter hvert som Transduction konduktans gjenoppretter fra desensitization.
Intracellulære innspilling er en nyttig teknikk for måling av elektrisk aktivitet i nervøs celler3,4,5,6,7,8. Selv om intracellulære innspillingen har blitt mindre hyppig med bruk av patch-Clamp teknikk9, er det fortsatt en praktisk tilnærming når cellene er enten vanskelig å isolere, eller presentere en geometri som gjør dannelsen av plasteret-klemme Giga-sel vanskelig (dvs.sel eller stramt-kontakter mellom patch elektroden og membraner med elektrisk motstand av rekkefølgen på 109Ohm). Eksempler på sistnevnte er sperm celler10 og foto reseptoren cellene her studert. I vår erfaring, Procambarus clarkii fotoreseptorene er vanskelig å isolere og holde i primær kultur; i tillegg er de tynne stenger som gjør Giga-segl formasjon vanskelig å oppnå. I intracellulære innspillinger er en skarp elektrode avansert til en celle som holdes på plass av det omgivende vevet. Elektroden er hakket av høyhastighets bytte kretsen til forsterkeren, slik at strømmen blir samplet mellom spennings pulser. Denne modusen er kjent som usammenhengende enkelt elektrode spennings klemme (dSEVC-modus)11. Den høye motstanden (liten åpning) av elektroden hindrer den diffusional utvekslingen mellom cellen og pipette-løsningene, noe som gir en minimal forstyrrelse av det intracellulære miljøet3. En potensiell ulempe med denne teknikken er at elektrode innsetting kan produsere en ikke-selektiv lekkasjestrøm; Derfor må det utvises forsiktighet for å unngå opptak fra celler der størrelsen på lekkasjestrømmen kan forstyrre de tiltenkte målingene4,12.
Heri, bruker vi isolerte kreps eyestalks å vurdere desensitization og gjenvinning av lys-aktivert ion konduktans ved å utføre intracellulære elektriske innspillinger av foto reseptoren celler under spenning klemme forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: eksperimentene overholder lovene om Dyrevern i Mexico.
1. eksperimentell installasjon
- Generelle tilkoblinger
- Koble forsterkeren til en egnet datamaskin gjennom en analog-til-digital omformer og bruk et oscilloskop for å overvåke eksperimentet (figur 1).
- Koble photostimulator til A/D-konvertert.
- Opptak kammer
- Plasser Innspillings kammeret oppå en anti-vibrasjons tabell og Finn den i et Faraday-bur.
Merk: Dette forhindrer mekanisk vibrasjon og elektrisk støy som kan påvirke opptaket. Vår Faraday buret var laget av formørket netting. En hjemmelaget, 2 mL, akryl opptaks kammer brukes (figur 2). - Forbered badet løsning for å holde preparatet i live13: 205 mm NaCl; 5 mM KCl; 2 mM MgSO4; 13 mM CaCl2; 5 mM Hepes-NaOH, pH 7,3.
Merk: løsningen inkluderer ikke druesukker eller bobler av 95% O2,5% co2 blanding fordi den eksperimentelle prosedyren er kort nok til å oppdage skader av elektrisk opptak (se trinn 4.2.3 for fullstendighet).
- Plasser Innspillings kammeret oppå en anti-vibrasjons tabell og Finn den i et Faraday-bur.
- Elektroder
- Bruk en klorid belagt sølvtråd elektrode som referanse elektroden
Merk: sølv klorid belegg er nødvendig for å tillate elektrode reaksjonen: AgCl (s) + e−↔ AG (s) + CL-. - Sand en sølv wire (tykkelse ~ 1 mm, lengde ~ 10 cm) med en fin karakter slipepapir for å rense overflaten.
- Skyll sølv wiren med destillert vann.
- Dypp den rene sølv wiren i en 4-6% natrium natriumhypokloritt oppløsning (NaClO) til den ser mørk ut (ca. 20 min.).
- Bruk tynne glass Pipetter fylt med en elektrolyttløsning (2,7 M KCl) som intracellulære elektrode.
- Trekk en kapillær slange i glass (innvendig diameter ≈ 1 mm) med en mikro-pipette avtrekker for å få en tynn tupp med en liten åpning (0,01-0,1 μm)14.
- Fyll det trekkes kapillær glasset med en 2,7 M KCl løsning. Fyll den først ved kapillaritet (Senk dråpe spissen inn i 2,7 M KCl-løsningen), og fyll deretter halvdelen av pipette med en fin injeksjonsnål. Trykk om nødvendig på elektrode pipette for å fjerne luftbobler.
- Koble elektroden til holderen. Koble holderen til forsterker headstage med forsterkeren. Plasser elektrode holde headstage med en stabil 3-D micromanipulator. Senk elektroden til bad løsning dekker spissen.
Merk: elektroden må ha en vertikal orientering
- Bruk en klorid belagt sølvtråd elektrode som referanse elektroden
- Velg Bridge-modus for forsterkeren (i modus-delen av forsterkeren, trykk på Bridge-knappen) og mål elektrode motstanden. Pass på at motstanden er ca 50 MΩ11.
Merk: denne elektrode størrelsen gjør det mulig med et elektrisk opptak av god kvalitet med begrenset skade på cellen. - Null mot strømmen og kompensere for kapasitiv transienter ved hjelp av holde posisjon knappen i delen spennings klemme på forsterkeren, og kapasitans nøytralisering-knappen i Microelectrode 1-delen av forsterkeren.
- Superfusion system
- Hell badekaret løsning (trinn 1.2.2) i en passende beholder (en 250 mL serum flaske) og koble den til en vanning slangesett (3,2 mm av indre diameter), og dermed koble opptaks kammeret. Bruk en tyngdekraft drevet superfusion system. Regulere strømningshastigheten til ~ 0,5 mL/s.
- Koble kammeret til en sugeinnretning. Regulere løsningen suge system på en slik måte at det totale volumet av opptaket kammeret ikke varierer. Bruk en vakuumpumpe for sug.
Merk: et konstant volum i opptaks kammeret er viktig for å holde bortkommen kapasiteter konstant gjennom hele eksperimentet.
2. biologisk materiale
Merk: Bruk voksen crayfishes P. clarkii (7-10 cm lang) i intermolt stadiet av utydelig sex.
- Døgn tid
- En måned før eksperimentene, opprettholde 100 crayfishes under en 12-h lys/12-h mørk syklus15 (hvitt lys, 2,4 kW/m2).
Merk: en måned er tilstrekkelig tid til å synkronisere kreps befolkningen. - Bestem døgn av kreps befolkningen ved å vurdere amplituden til electroretinograms av fem tilfeldig utvalgte dyr15.
Merk: 0 h døgn (CT 0) indikerer begynnelsen på en subjektiv dag, det vil si, tid der en organisme normalt er aktiv16,17,18,19 (Figur 3). Den kreps er en nattlige dyr, så under en 12-h lys/12-h mørk syklus, den er aktiv i den mørke fasen.
- En måned før eksperimentene, opprettholde 100 crayfishes under en 12-h lys/12-h mørk syklus15 (hvitt lys, 2,4 kW/m2).
- Eyestalk isolasjon prosedyre
- Ved ønsket døgn, bedøve en utvalgt kreps ved nedsenkning i vann fra springen ved 0-4 ° c, i 15 min.
- Ved hjelp av en fin saks, løsne eyestalk fra basen.
- Få tilgang til Retina ved hjelp av et barberblad for å lage en åpning (~ 1-mm2) i rygg hornhinnen.
- Plasser eyestalk i midten av opptaket kammer (hullet dekket med silikon) med tilgang åpning til netthinnen på toppen av kammeret.
- Hold eyestalk under konstant mørke i 20 min.
Merk: 20 min er tilstrekkelig tid for den Foto reseptoren cellen til å være helt mørk tilpasset.
3. Foto reseptoren impaling
- Sett microelectrode og eyestalk langsgående akse parallelt på en slik måte at microelectrode er sentrert for tilgang til netthinnen. Bruk et stereoskopisk mikroskop (10X) for å plassere enhetene i riktig konfigurasjon.
- Overvåk spennings forskjellen mellom referanse-og opptaks elektrodene ved å velge Bridge Mode11 av forsterkeren.
- Senk elektroden inn i badekaret og deretter plassere den rett over netthinnen.
- Beveg deg bort fra mikroskopet og plasser photostimulator lampen parallelt med eyestalk langsgående akse.
Merk: avstanden mellom lampe og superfusion kammer er ca. 15 cm. - Senk microelectrode langsomt til et plutselig spenningsfall oppdages.
Merk: et spenningsfall på rundt − 50 mV indikerer impalement av en sunn Foto reseptoren celle. - Lever en test lys-blits (hvitt lys, 7,2 kW/m2, 10 μs varighet) for å registrere Foto reseptoren ' s reseptor potensial.
Merk: Foto reseptoren reseptor potensiale er et depolariserende potensiale med 10-15 og 300 MS varighet (Figur 4).
4. elektrisk innspilling
- Sørg for at de Foto reseptoren cellene er helt tilpasset mørke forhold (se trinn 2,3).
- Lever en test-lys blits hvert 2 min. Automatiser tiden mellom Blink ved å velge en tilstrekkelig verdi (120 s) "tid mellom episodene" i datainnsamlingsprogram varen.
Merk: 2 min er nødvendig tid for å tillate den totale utvinningen av strømmene underliggende Foto reseptoren elektriske respons. - Overvåk potensialet for hvile membranen, samt amplituden og varigheten til reseptor potensialet. Anta at Foto reseptoren er helt tilpasset når membranen potensialet, amplitude, og varigheten av reseptoren potensialet forblir uendret. Eyestalks tidligere holdt under konstant mørke i 20 min (trinn 2,3) fullføre sin tilpasning i ca 5 min.
- Stopp stimulere cellen 2 min før innspillingen av lys-elicited strøm.
- Lever en test-lys blits hvert 2 min. Automatiser tiden mellom Blink ved å velge en tilstrekkelig verdi (120 s) "tid mellom episodene" i datainnsamlingsprogram varen.
- Gjeldende innspilling
- Klem spenningen ved den målte hvile membranen potensielle verdien av cellen ved å velge "Holding amplitude" i datainnhenting programvare (i bølgeform på analog output Channel delen).
- Velg dSEVC-modus for forsterkeren. I modus-delen av forsterkeren velger du SEVC-knappen og bytter spaken til Discont SEVC-posisjon.
- Still inn vekslings hastigheten til 500-1000 Hz (ved å bruke hastighetsjustering-knappen på forsterkeren), som bestemt av hastigheten til elektroden11.
- Lever en lys-blits, og observere fremkalt ion tilstrømningen.
Merk: Dette er lys-elicited eller Transduction strøm (figur 5). - Gå tilbake til Bridge-modus på forsterkeren og ta opp en reseptor potensiell ved å sende en lys blits (se avsnitt 3). Sørg for at den Foto reseptoren cellen er helt tilpasset mørke forhold. Mål reseptoren potensielle egenskaper (amplitude og varighet) og sammenligne med de første målingene. Anta at Impaled Foto reseptoren cellen er en sunn celle hvis de har de samme egenskapene.
Merk: etter eyestalk ablasjon, biologisk forberedelse er levedyktig i løpet av følgende 2 h.
- To puls protokoll: mål utvinningen fra desensitization med en to lys-blits protokoll.
Merk: de to lys-Flash-protokollen er lik standard to-puls spenning protokollen som brukes til å måle utvinningen fra deaktivering av spenning-gated kanaler20. Den første lys-blits forårsaker en midlertidig endring i følsomheten til den Foto reseptoren cellen og den andre blitsen evaluerer tilstanden til den lys aktiverte konduktans.- Lever et par lyspulser. Påfør den andre blitsen etter et ønsket tidsintervall (fra 300 MS til 2 min).
- Digitalisere strømmene ved 10 KHz prøvetaking med datainnhenting programvare og lagre data for off-line analyse11.
Merk: en tabell med konfigurasjonsverdiene for programvaren er inkludert som tilleggsmateriale.
5. data analyse
- Kinetics av lys-elicited gjeldende
- Mål tre gjeldende parametere: aktiverings ventetid L, tiden som er gått fra lys-blits levering til gjeldende oppnår 10% av maksimal amplitude (figur 5); Peak eller maksimal nåværende amplitude jegp; og desensitization tid konstant T. mål desensitization tidskonstant (Τ) ved å montere den gjeldende forfall fasen til:
der, A =-I (t = 0) er en positiv konstant (figur 5).
- Mål tre gjeldende parametere: aktiverings ventetid L, tiden som er gått fra lys-blits levering til gjeldende oppnår 10% av maksimal amplitude (figur 5); Peak eller maksimal nåværende amplitude jegp; og desensitization tid konstant T. mål desensitization tidskonstant (Τ) ved å montere den gjeldende forfall fasen til:
- Desensitization og utvinning
Merk: gjenoppretting fra desensitization ble vurdert som forholdet p2/p1, der p1 er den relevante parameteren (enten L, Ipeller T) av kontroll strømmen, og p2 er den tilsvarende parameteren for den andre teststrømmen.- Plot p2/p1 (enten L, Ipeller T) som en funksjon av tid mellom pulser.
- Avhengig av parameteren, må du tilpasse punktene for hvert plott til:
eller til:
- Bruk en passende statistisk test for å finne ut hvor mange eksplosive termer som kreves for å tilpasse de eksperimentelle dataene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Først oppnås en representativ reseptor potensialet av kreps Foto reseptoren celler (Figur 4). Etterpå ble en test lys-blits brukt for å utløse lys Transduction strøm (figur 5). Den kationiske Transduction nåværende1 aktiverer etter et lag, og nådde en maksimal og deretter langsomt faller inn i en absorberende ufølsomme tilstand som det langsomt gjenoppretter.
Det er rimelig å anta at den lange ventetid L (titalls millisekunder) av lys-elicited strøm avhenger av biokjemiske hendelser utløst av lys, som involverer G-protein trasé. Amplituden av peak strøm jegp avhenger av brøkdel av kanalene tilgjengelig for å bli åpnet, og den relative utbredelsen av dagens aktivisering og inaktive. Sistnevnte er vurdert av forfall tid konstant T.
På den annen side bør L utvinningen være relatert til frekvensen av utvinning av biokjemiske phototransduction Cascade; Jegp Recovery avhenger begge, på den iboende conformational endringer av proteiner ansvarlig for ion konduktans, og på frekvensen av utvinning av biokjemiske phototransduction Cascade. Sistnevnte kan også være relatert til utvinning av T. Videre, den parallelle varianten av L og T tyder på at en felles biokjemiske faktor (eller faktorer; for eksempelkan den fosforylering tilstanden til kanalen) påvirke begge parametrene1.
En to-Flash-protokoll (figur 6) ble brukt senere for å bestemme Kinetics fra desensitization (figur 7) på forskjellige tidspunkter i døgn syklusen (Figur 8).
Figur 1. Linjediagram for utstyrs oppsettet. Tilkoblinger mellom personlig datamaskin (PC) (A), grensesnitt(B), oscilloskop (C), spennings klemme forsterker (D), photostimulator (E) og Headstage/holderen/microelectrode systemet til utstyrs oppsettet (F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Recording kammer. (A) opptaks kammeret inne i et Faraday bur med dens superfusion-suge system. Det er også vist plasseringen av photostimulator, mikroskop, og micromanipulator-headstage-microelectrode system. (B) diagram av opptaks kammeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Elektroretinogrammet-amplitude (ERG). (A) kreps. (B) representative TOMTEN til ERG-amplituden til kreps fotoreseptorene (data ble tatt hver 20 min) som en funksjon av døgn. Eksistensen av en døgnrytme kan tydelig verdsettes. Merk at for hver syklus sammenfaller begynnelsen av aktiviteten med døgn 0. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Reseptor potensial. Representative reseptor potensial fremkalt av en lys blits (hvitt lys, 7,2 kW/m2, 10 μs varighet). Dette tallet har blitt modifisert fra Barriga-Montoya, C, et al. 2. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Transduction strøm. Representative Transduction strøm utløst av en lys blits (hvitt lys, 7,2 kW/m2, 10 μs varighet) påføres med spenningen holdes konstant på Foto reseptoren hvile potensial. Aktuell ventetid, topp amplitude og desensitization fase indikeres. Dette tallet har blitt modifisert fra Barriga-Montoya, C, et al. 2. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. To-impuls protokollen. Strømmer elicited av et par av lys blinker. Lys stimuli ble påført ved 0 MS og 700 MS (indikert med piler). Dette tallet er endret fra 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Utvinning fra desensitization. (A) Ip: peak nåværende utvinning, (B) L: latency utvinning, (C) T: desensitization tid konstant T Recovery. Eksperimenter ble utført ved 0 h CT. Dette tallet har blitt modifisert fra Barriga-Montoya, C, et al. 2. resultater uttrykkes som gjennomsnittlig ± standardavvik for antall eksperimenter (n = 11). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Utvinning fra desensitization som en funksjon av CT. (A) Ip utvinning, (B) L Recovery, (C) ґruntovymi utvinning. (D) vektet tids konstanter. Bifasisk prosesser er merket med en pil. Dette tallet har blitt modifisert fra Barriga-Montoya, C, et al. 2. resultater uttrykkes som gjennomsnittlig ± standardavvik for antall eksperimenter (n = 11). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggs tabell 1. Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kreps har vist seg å være en utmerket modell på grunn av sin evne til å overleve under ikke-naturlige forhold. Det er lett tilgang til in vivo -og in vitro -elektrofysiologisk analyser. I tillegg krepsdyr er en gunstig gruppe for nevrobiologiske forskning innen komparative chronobiology21.
I denne utredningen, studiet av desensitization og utvinning av lys aktivert Transduction av kreps Foto reseptoren celler vises ved hjelp av intracellulære innspillingen teknikken. Men vi tror at den samme teknikken kan tilpasses andre virvelløse visuelle systemer så lenge det er mulig å få tilgang til Foto reseptoren celler.
For å oppnå akseptable eksperimentelle resultater, er det viktig å vurdere noen kritiske trinn i protokollen, inkludert eliminere elektrisk støy ved jording alt utstyr, bygge en elektrode med et tilstrekkelig fint tips, og sikre at Foto reseptoren cellen er helt mørk-tilpasset før to-puls protokollen begynner.
Til tross for begrensningene for intracellulære opptak som skade av membran, er det mulig å gå videre og få detaljert informasjon om Biofysiske mekanismen underliggende kreps (eller et annet dyr) Foto reseptoren elektrisk signal. Som i andre virvelløse fotoreseptorene, i kreps fotoreseptorene, utløser lys en gradert depolarization, eller reseptor potensial, produsert ved aktivering av en kationiske konduktans. Den lys aktiverte konduktans begynner etter et etterslep eller ventetid, og etter å ha nådd sin maksimale amplitude, synker den langsomt etter en eksponentiell tid kurs, som kanalene inn en absorberende ufølsomme tilstand.
Den Kinetics av utvinning fra desensitization av lys-elicited ion konduktans av kreps ble innhentet ved hjelp av en to-lys Flash-protokollen (ligner på standard to-spenning puls protokoll som brukes til å studere utvinning fra deaktivering av spenning-gated kanaler)20. Interessant, og i motsetning til den velkjente tilfelle av spenning-gated kanaler, ikke bare topp amplitude, men også alle de gjeldende parametrene (Ip, L, T) endres etter første lys stimulans, utvinne med karakteristisk eksponentiell tid kurs til den opprinnelige, første blits verdier, som rapportert andre steder20. Denne variasjonen av alle parametrene som karakteriserer den nåværende indikerer deltakelse av andre budbringere i det visuelle Transduction systemet av kreps1,2,22,23,24.
I tillegg, og interessant, som Figur 8 viser, utvinning av L, jegp, og T avhenger av døgn tid eksperimenter er realisert. Videre studier er nødvendig for å bestemme molekyl grunnlaget for dette fenomenet. Selvfølgelig er det mulig å få lignende informasjon ved hjelp av en annen teknikk, for eksempel patch Clamp. Imidlertid kan det intracellulære miljøet bli sterkt forstyrret i andre teknikker, og dette kan være kritisk, hvis for eksempel interne elementer som proteiner, aminosyrer, nukleotider, blant mange andre, spille en relevant rolle i det elektriske signalet generasjon eller i samspillet med hormoner eller neuromodulatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av DGAPA-UNAM IN224616-RN224616 stipend. Forfatterne ønsker å takke fru Josefina Bolado, leder av Scientific Paper Translation Department, fra División de Investigación i Facultad de Medicina, UNAM, for redigering den engelskspråklige versjonen av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments, Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
- Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).
- Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).
- Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).
- Brette, R., Destexhe, A. Intracellular recording. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
- Cummins, D., Goldsmith, T. H. Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye. J. Comp. Physiol. 142 (2), 199-202 (1981).
- Eguchi, E. Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells. J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).
- Nosaki, H. Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii. Z. vergl. Physiologie. 64 (3), 318-323 (1969).
- Miller, C. S., Glantz, R. M. Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish. Vis Neurosci. 17 (3), 353-368 (2000).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. Sperm patch-clamp. Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).
- Finkel, A. Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation. Axon Instruments, Inc. , (1990).
- Single-channel recording. Sakmann, B. , Springer Science & Business Media. (2013).
- Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustacea. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34 (4), 428-432 (1936).
- Oesterle, A. pipette cookbook. , Sutter Instruments. Novato, CA. 97 (2008).
- Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74 (3), 711-714 (1983).
- Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks. Nat. Rev. Neurosci. 3 (8), 591-605 (2002).
- Pittendrigh, C. S. On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles. Circadian Clocks. Aschoff, J. , North Holland, Amsterdam. 277-297 (1965).
- Pittendrigh, C. S. Circadian systems: entrainment. Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms. Aschoff, J. , Plenum, New York. 94-124 (1981).
- Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. Overview of circadian rhythms. Alcohol Res. Health. 25 (2), 85-93 (2001).
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. 507, Sinauer. Sunderland, MA. (2001).
- Dircksen, H., Strauss, J. Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems. Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).
- Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish. FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).
- Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors. J Comp Physiol A. 183 (4), 411-417 (1998).
- Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors. Vis Neurosci. 13 (3), 539-547 (1996).
