Summary
Flimmerhåren utveckling är avgörande för korrekt organogenes. Det här protokollet beskriver en optimerad metod för att märka och visualisera cilierade celler i zebrafiskar.
Abstract
Under de senaste åren har zebrafiskar embryot blivit en populär modell att studera utvecklingsbiologi på grund av egenskaper som ex utero embryots utveckling och optisk transparens. I synnerhet blivit zebrafiskar embryot en viktig organism att studera ryggradsdjur njure organogenesen samt multiciliated cell (MCC) utveckling. För att visualisera MCCs i embryonala zebrafiskar njuren, vi har utvecklat ett kombinerat protokoll i hela-mount fluorescerande i situ hybridisering (FISH) och montera hela immunofluorescens (IF) som möjliggör hög upplösning imaging. Detta manuskript beskriver vår teknik för samtidig lokalisera RNA avskrifter och protein som ett verktyg för att bättre förstå regleringen av utvecklande program genom uttryck av olika härstamning faktorer.
Introduction
Under de senaste decennierna, har zebrafiskar (Danio rerio) vuxit fram som främsta modellorganism att studera utvecklingsbiologi. Embryona utvecklas utanför mor och är optiskt transparenta. Bildandet av vitala organ såsom öga, njure och framhjärnan uppstår också, snabbt, med strukturer som bildas av bara 24 h post befruktning (hpf). Ännu viktigare, är zebrafiskar genomet starkt bevarad med däggdjur1,2,3. Dessutom har Sebrafisken och däggdjur organ liknande anatomi och fysiologi. Den zebrafiskar embryonala njure, eller pronephros, visar värdet av modell systemet för att pröva geners funktion under tidig nephrogenesis och öde bestämning av bevarade epitelial cellpopulationer av vertebrate nefronet4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. likaså zebrafiskar embryot har blivit allt viktigare att undersöka Ontogeni av MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Som namnet antyder, är MCCs epitelceller som kännetecknas av en bunt av rörliga flimmerhår ligger på apikala ytan17. I zebrafiskar, MCCs fungera i vätskeflöde och är spridda i en ”melerad” som mode under mitten av varje nefronet av pronephros av 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. även om de bara har noterats i en handfull av mänskliga njurar sjukdom fall18,19,20,21, MCCs är utbredda i andra däggdjur vävnader såsom hjärnan och luftstrupen22,23,24, som utgör en mängd utmaningar för experimentell design. Eleganta studier i olika ryggradsdjur modeller inklusive zebrafisk har visat en bevarade väg av MCC öde, med skåran signalering utbildningsavsnitt som en hämmare av MCC utveckling12,17,25 ,26,27. Därför ger den zebrafiskar pronephros ett lättillgängligt modell för att studera de genetiska mekanismerna MCC utveckling i vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Både öppenhet och lätt genmanipulation av zebrafisk embryon har visat sig vara ovärderliga egenskaper när man studerar de genetiska och molekylära vägar som reglerar cell öde, vävnadstillväxt och utveckling av tidiga embryot1,2 ,3. Som sådan, traditionella tekniker för att visualisera protein och gen avskrifter, såsom i situ hybridisering och hela berget om, har tillämpats till och optimerad för den zebrafiskar16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Genom att kombinera populära protokoll för fisk och om, är det möjligt att märka och analysera MCCs i vivo16,28,37,38.
Protocol
Följande protokoll används zebrafiskar vuxna underhålls och vårdas av Center for zebrafiskar Research vid University of Notre Dame. Alla metoder för att arbeta med zebrafiskar vuxna och embryon godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén.
1. embryot fixering
- Samla zebrafiskar embryon med tidigare beskrivna metoder39,40. 24 hpf, tillsätt 500 µL av icke-specifika proteas blandning lösning (50 mg/mL) till E3 i ett embryo skålen Inkubera vid rumstemperatur (RT).
- När embryon börjar bryta ut av chorion, ta bort all vätska från embryo skålen.
- Tvätta embryona 2 - 3 gånger med färska E3 genom att tillsätta cirka 20 mL E3, försiktigt snurra på E3 i skålen och sedan dekantering vätskan till ett flytande avfall kärl.
- För att avliva embryona innan fastställande, tillsätt 2 mL 0,2% tricaine till E3.
- Överföra embryon i en 5 mL injektionsflaska av glas med hjälp av en plast Pasteur-pipett. Ta bort de flesta av tricaine/E3 lösningen använder pipetten efter embryon har fast längst ned i injektionsflaskan.
- Fixa 24 hpf embryon med 5 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) för 2-4 h på RT, utan agitation.
FÖRSIKTIGHET: PFA är giftigt och PFA lösningar ska hanteras under en kemisk huva medan forskaren bär ögonskydd, handskar och en labbrock. Beredning av PFA fixeringsvätskan från granulerad PFA pulvret bör utföras med enastående omsorg, eftersom den granulerad PFA tenderar att skingra genom statisk laddning.
Obs: Embryon kan fixa i 4% PFA övernattning vid 4 ° C. Förbered 4% PFA genom upphettning 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) koka upp under omrörning ständigt lösningen att helt upplösa den granulerad PFA. När lösningen har svalnat tillbaka ner till RT, 4% PFA är filter steriliseras genom passering genom ett 0,45 µm disponibla system för dammsugarfilter, då och aliquoted i 15 mL eller 50 mL portioner för lagring vid-20 ° C. - Ta bort 4% PFA och tvätta embryon två gånger med 1 X fosfatbuffrad saltlösning med 0,1% Tween-20 (PBST) på RT. Tvätta embryon en gång med 5 mL 100% metanol (MeOH) på RT. Tillsätt 5 mL av färska 100% MeOH att embryona och inkubera vid-20 ° C i minst 20 min.
Obs: Embryon kan lagras i 100% MeOH vid-20 ° C tills det för embryo beredning.
2. embryot förberedelse och hybridisering
- Rehydrera embryon genom tvätt en gång i 50% 5 mL MeOH i 1 x PBST för 5 min på RT. Fortsätt rehydrering tvätta embryon i 5 mL 30% MeOH i 1 x PBST för 5 min på RT. Tvätta embryon i 5 mL av 1 x PBST två gånger för 5 min varje på RT.
- Permeabilize embryon av inkubering i 5 mL av en lösning av 1:1,000 proteinas K (pK) (10 mg/mL) i 1 x PBST för 2 min på RT.
Obs: Äldre embryon kan inkuberas längre än 2 min i pK koncentrationen anges ovan, men en koncentration på 5 mg/mL och inkubation tid mindre än 2 min föreslås för embryon yngre än 24 hpf. - Ta bort pK lösningen och tvätta omedelbart i 5 mL 1 x PBST två gånger på RT. fixa embryon i 5 mL 4% PFA på RT i minst 20 min.
Obs: Embryon kan fixa i 4% PFA övernattning vid 4 ° C. - Ta bort PFA och tvätta två gånger i 5 mL av 1 x PBST på RT.
- Överföra embryon i 5 mL av 1 x PBST in platt botten mikrocentrifugrör placeras upprätt i en mikrocentrifug rack på RT att underlätta samspelet mellan varje embryo och efterföljande hybridisering lösningen.
- Tvätta embryona två gånger i 1,5 mL hybridisering lösning (Hyb +) på RT. Tillsätt 1,5 mL färsk Hyb + och inkubera embryon vid 70 ° C i en hybridisering ugn för 4-6 h.
- Ersätta den 1,5 mL Hyb + med en volym av sonden lösning (10 µL RNA sond/500 µL Hyb +) tillräckliga för att fullt ut täcka embryon.
Obs: Syntetisera antisense-RNA sonden med hjälp av tidigare beskrivna metoder39. - Hybridisera sonden övernattning i hybridisering ugnen vid 70 ° C med enskilda rören placeras upprätt i mikrocentrifug rack, utan att skaka.
3. hot tvättar och blockerar
Obs: Heta tvättar utförs genom att sätta en lämplig lösning på embryon och sedan ruvar i hybridisering ugnen på 70 ° C. För att hålla de tvätt-lösningarna vid 70 ° C, placera 50 mL rör varje lösning i hybridisering ugnen när sonden / Hyb + blandningen läggs.
- Ta bort sonden. Tvätta embryona två gånger vid 70 ° C i 1,5 mL 50% formamid/2 x saltlösning-natriumcitrat (SSC) buffert för 20-30 min varje.
Obs: Sonden kan lagras i Hyb + vid-20 ° C och används igen vid en senare tidpunkt. - Tvätta embryona en gång vid 70 ° C i 1,5 mL 2 x SSC för 15 min. Tvätta embryon två gånger vid 70 ° C i 1,5 mL 0,2 X SSC för 20-30 min varje. Ersätt 0,2 x SSC med 1,5 mL blockerande reagens och inkubera över natten vid 4 ° C.
Obs: Det är möjligt att Inkubera blockerande reagens på RT för 4 h istället för övernattning.
4. antikropp inkubation och maleinsyra buffert tvättar
Obs: Förvara embryon skyddas från omgivande ljus.
- Ersätta den blockerande reagensen med 0,2 mL anti-DIG-POD i blockerande reagens i ett förhållande av 1:1,000 och Inkubera under 3 h under folie eller annan ljus-blockerande skydd på RT.
Obs: Alternativt antikroppen kan Inkubera över natten vid 4 ° C. - Efter 3 h, tvätta embryon i 1,5 mL maleinsyra buffert 2 - 4 gånger för 10-15 min varje på RT. Inkubera embryona övernattning på 4 ° C i 1,5 mL färsk maleinsyra buffert.
Obs: Det är inte nödvändigt att ruva i maleinsyra buffert över natten, men gör så minskar sonden bakgrund.
5. probe identifiering och borttagning av peroxidas
Obs: Förvara embryon skyddas från omgivande ljus.
- Ta bort maleinsyra buffert och ersätta med 1,5 mL 1 x PBS. Tvätta embryon två gånger i 1,5 mL 1 x PBS för 5 min varje på RT. Inkubera embryon i 0,2 mL av Cy3 fluorescerande färgning lösning för 60 min på RT.
Obs: Inkubationstiden kan variera för olika sonder. - Tvätta embryona en gång med 1,5 mL den följande procent MeOH i 1 X PBS för 10 min vid RT: 30% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH och 100% MeOH.
- Inkubera embryon med 1,5 mL 1% H2O2 i MeOH i 30 min på RT. Wash embryon en gång med 1,5 mL MeOH följande lösningar i 1 x PBS för 10 min vid RT: 75% MeOH, 50% MeOH och 30% MeOH. Tvätt embryon två gånger för 5 min varje RT i 1,5 mL 1 x PBS.
Obs: Embryon kan förvaras i PBS över natten vid 4° C.
6. immunofluorescens
Obs: Förvara embryon skyddas från omgivande ljus.
- Tvätta embryona i 1,5 mL ddH2O 5 min på RT. Wash embryon i 1,5 mL före kylda aceton (förvaras vid-20 ° C) för 7 min på RT. Tvätta embryon en gång i 1,5 mL ddH2O 5 min på RT. Wash embryon en gång i 1,5 mL 1 x PBST med 1% DMSO (PBDT) för 5 min på RT.
- Inkubera embryon i 1,5 mL PBDT + 10% fetalt bovint serum (FBS) på en rocker på RT för 2 h.
- Ta bort PBDT + FBS och ersätta med 1,5 mL primära antikroppar, anti-acetylerade tubulin (producerat från mus) och anti-γ-tubulin (produceras från kanin), utspätt tillsammans till 1: 400 i PBDT + 1% FBS. Inkubera embryon över natten vid 4 ° C.
Obs: Inkubationstider kan variera beroende på den primär antikroppen. Provning av olika tidsintervall kan vara nödvändigt att optimera märkning.
7. sekundär antikropp
Obs: Förvara embryon skyddas från omgivande ljus.
- Ta bort överflödigt obunden antikropp från embryon, tvätta i 1,5 mL PBDT + 1% FBS + 0.1 M NaCl för 1 min på RT på en rocker.
- Tvätta embryona 5 gånger i 1,5 mL PBDT + 1% FBS + 0.1 M NaCl för 30 min varje på en rocker på RT. Tvätta embryon i 1,5 mL PBDT + 1% FBS för 30 min vid RT på en rocker.
- Inkubera embryona övernattning på 4 ° C i 200 µL av sekundära antikroppar, Alexa 488 get antimus IgG och Alexa 647 get anti-kanin IgG, utspädd tillsammans i PBDT på 1: 500.
8. DAPI färgning
Obs: Förvara embryon skyddas från omgivande ljus.
- Tvätta embryona snabbt på RT i 1,5 mL PBDT två gånger. Ersätt PBDT med 1,5 mL DAPI, utspädd 1:15000 i 1 X PBST och inkubera 15 min vid RT på en rocker.
- Tvätta embryona i 1,5 mL PDBT + 1% FBS + 0,1 M NaCl tre gånger på RT för 15-20 min varje. Lagra embryon i 1,5 mL PBDT vid 4 ° C tills de ska montera och bild.
9. montering och tänkbar för zebrafiskar Pronephros
- Lekmanna embryo i sidled på glasskiva i en liten volym, cirka 10 µL, PBDT.
- Kläm embryot bakom ögonen med ett par fina pincett ta bort huvudet och några av äggula bollen.
- Använd fina tången för att försiktigt skrapa bort återstående äggula bollen från embryo kroppen. Ta bort dissocierade äggula och extra vätska från bilden med en tunn vävnad.
- Lägg en droppe av montering media till återstående svansen av embryot och placera så att svansen är lagd sidled. Placera ett täckglas ovanpå svansen för att platta till provet och sedan placera en täckt bild rutan.
- Bild njure flimmerhår på 60 X förstoring på confocal Mikroskop med hjälp av följande kanaler: DAPI i blått (laser set på 408,0 nm), FITC i grönt (laser set på 488,0 nm), Cy3 dye-märkt i rött (laser set på 561,0 nm), och Alexa 680 i vitt (laser set på 637.0 nm).
Representative Results
Vildtyp zebrafiskar embryon fastställdes 24 hpf och omedelbart beredd som beskrivs ovan. Figur 1 illustrerar en experimentell arbetsflöde med valda illustrerade stadier. Arbetsflödet som beskrivs i steg 1-8 omfattar processer av provet upphandling, fixering och manipulation av fasta vävnaden att märka endogena avskrifter med antisense riboprober följt av immunofluorescens till etikett proteinernas sevärdheter. Steg 9 i arbetsflödet refererar till montering och imaging tekniker särskilt utformade för att optimera visualisering av zebrafisk embryonala stammen. I de ritningar som åtföljer steg 9, illustrera vi metoden för manipulation av positionering vävnaden på en glasskiva. I det här steget embryo huvud och äggula bollen tas bort, lämnar svansen sidled placeras mellan ett objektglas och täckglas. Borttagning av äggula bollen och huvudet föreslås för den bästa avbildning av MCC invånarebefolkningen i pronephros, som äggula bollen auto-fluorescerar och hindrar monteringen förlopp.
Representativa bilder erhålls med confocal Mikroskop anges i figur 2, som visar samma vildtyp embryo 60 X förstoring och en digital zoom på samma förstoring. De översta panelerna ge bilder av varje enskild kanal, medan de nedre två panelerna är sammansatta överdra av uppgifterna imaging. Den vita rutan (i den vänstra kolumn bilden) beskriver området som är i fokus för den digitala zoomen (den högra kolumn bilden). Markeras i den sista panelen i den digitala zoomen, kärnor var märkt i DAPI, och MCCs upptäcktes baserat på en antisense riboprobe som utformats för att känna igen odf3b, där antikroppar till γ-tubulin beteckna de basala organ och α-tubulin betecknar flimmerhåren. I den digitala zoomen av överlägget sammansatta anger den gul streckad cirkeln omkretsen av en MCC, som identifierades på grund av innehav av odf3b avskrifter, flera basala organ och cilier. Den intilliggande mono-cilierade cellen, märkt med en gul streckad cirkel, identifierades baserat på fenotypen av besitter en enda basal kropp och en enda cilie.
Figur 1: Schematisk av experimentella flödesschema. Detta flödesschema visar en experimentell arbetsflöde, åtföljas av illustrationer av kritiska stadier där snöflinga visar kalla inkubation, de tre böjda linjerna representerar värme och klockan representerar långa inkubationstider. Arbetsflödet kan utföras i minst 6 dagar (se dag nummer i övre högra hörnet av varje steg i processen), även om vissa åtgärder kan utföras över längre tidsperioder, som i protokollet antecknas. En detaljerad skildring av monteringen förlopp är utdragna, visar den slutliga monterade embryo svansen mellan objektglas och täckglas. En svart streckad ruta beskriver området som är avbildade på 60 X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa resultat för visualisera MCCs av den zebrafiskar pronephros. Maximala bildprojektioner en 24 hpf vildtyp zebrafiskar embryo på 60 X förstoring samt en digital zoom på de confocal på 60 X förstoring av samma embryo. De vita rutorna ange området fokuserade på för zoom. Enskilda fläckar av DAPI (kärnor), odf3b (MCCs), γ-tubulin (basal organ) och α-tubulin (cilier) är märkt och sedan slås ihop i de två nedre panelerna. I den digitala zoomen, vi tillhandahåller approximationer av cell platser enligt följande: en MCC beskrivs av den streckade gula cirkeln och den streckade gula cirkeln beskriver en mono-cilierade cell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det protokoll som anges ovan är optimerad för märkning MCCs i pronephros med odf3b avskrifter och α-tubulin i 24 hpf zebrafiskar embryon. För bästa resultat, är det rekommenderat att använda färska fasta och beredda embryon. Embryon som har fast och lagras i antingen MeOH eller Hyb + vid-20 ° C under längre tid än en vecka kan användas, men sannolikheten för oönskad bakgrund färgning ökar med den tid som embryona förvaras i lagring.
Felsökning av denna teknik och ändringar är nödvändiga för att skräddarsy denna metod för andra sviter av särskilda markörer, e.g. andra antisense riboprober och andra antikroppar. Många metoder för att justera parametrarna för steg i processen hela berget i situ hybridisering har tidigare dokumenterats av vår grupp och andra31,34,36,38, 39. Jämväl, varje protein antikropp kräver viss felsökning när det gäller färgning gånger och ungefärliga intervall av utspädningar och inkubationstider för varje primär antikropp uppskattas bäst av utvärdering av dokumenterade resultat28, 35. för embryon yngre än 24 hpf, pK behandling bör vara kortare än 2 min, där embryon som är äldre än 24 hpf bör behandlas med pK längre än 2 min. Även embryon som är äldre än 24 hpf bör vara blekt av pigment innan pK behandling.
Efter färgning med fluorescerande färglösningen, är det viktigt att ta bort alla återstående fläcken, antikroppar och peroxidaser genom att utföra serien metanol och väteperoxid tvättar. De PBS tvättar omedelbart efter är viktigt att ta bort överskjutande metanol från embryon. Viktigt, innan om antikropparna, har vi funnit att aceton och avjoniserat vatten tvättar göra embryona som är mindre benägna att följa varandra eller Centrifugera rören. I vår erfarenhet, antikroppar för specifika transkriptionsfaktorer och andra gener, men de kan fungera effektivt Western blotting, fungerar inte bra för om i zebrafiskar. Mycket och riklig proteiner, såsom α-tubulin och β-catenin, fungerar dock bra i zebrafiskar för om16,37.
Med fisk är det möjligt att visualisera RNA avskrifter av gener som ännu inte har specifika antikroppar i zebrafiskar. Genom att kombinera fisk med IF, vilket framgår av detta protokoll, kan samtidig lokalisering av RNA avskrifter och protein vara ses i vivo (figur 2). Flexibiliteten i protokollet möjliggör snabb felsökning för visualisering av olika RNA avskrifter och proteiner i många vävnader och tidpunkter. Kombination med de redan respekterade drag av zebrafisk embryon, ger detta protokoll av fisk + om ett annat verktyg för att utforska uttrycket av gener och proteiner viktiga utvecklings väg förordning.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av att bevilja R01DK100237 till R.A.W. och National Science Foundation Graduate Research Fellowship nej DGE-1313583 till A.N.M. Vi tackar också College av vetenskap sommaren Undergraduate Research Fellowship-programmet för stöd till M.U. Vi vill tacka centrum för zebrafiskar forskning på University of Notre Dame för deras hängivna vård av våra zebrafiskar. Vi vill också tacka Institutionen för biologiska vetenskaper samt medlemmarna i vårt labb för alla deras stöd och värdefulla insikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
| E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
| embryo dishes | VWR | 351029 | |
| 5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
| disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
| 10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
| 1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
| methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
| proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
| flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
| hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
| hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
| 20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
| blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
| maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
| anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
| Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
| molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
| acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
| monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
| anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
| odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
| NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
| Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
| glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
| glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
| confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
| rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study segmentation. Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- Chambers, B. E., Wingert, R. A. Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration. World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).
- Drummond, B. E., Wingert, R. A. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).
- Kramer-Zucker, A. G., Olale, F., Haycraft, C. J., Yoder, B. K., Schier, A. F., Drummond, I. A. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
- Liu, Y., Narendra, P., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134, 1111-1122 (2007).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genetics. 3, e18 (2007).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
- Wang, L., et al. miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish. Development. 140, 2755-2764 (2013).
- Marra, A. N., Wingert, R. A. Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development. Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).
- Marra, A. N., Li, Y., Wingert, R. A. Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development. Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).
- Duffy, J. L., Suzuki, Y. Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia. Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).
- Katz, S. M., Morgan, J. J. Cilia in the human kidney. Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).
- Hassan, M. O., Subramanyan, S. Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis. Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).
- Ong, A. C., Wagner, B. Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia. Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).
- Worthington, W. C., Cathcart, R. S. III Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain. Science. 139, 221-222 (1963).
- Cowan, M. J., Galdwin, M. T., Shelhamer, J. H. Disorders of ciliary motility. Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).
- Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).
- Stubbs, J. L., Vladar, E. K., Axlerod, J. D., Kitner, C. Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation. Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).
- Tan, F. E., et al. Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program. Development. 140, 4277-4286 (2013).
- Zhou, F., Narasimhan, V., Shboul, M., Chong, Y. L., Reversade, B., Roy, S. Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program. Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).
- Jowett, T. Analysis of Protein and gene expression. Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).
- Schulte-Merker, S. Chapter 2: Looking at Embryos. Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).
- Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (25), (2009).
- Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, (2011).
- Drummond, B. E., Li, Y., Marra, A. N., Cheng, C. N., Wingert, R. A. The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish. Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).
- Jaffe, K. M., Thiberge, S. Y., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Imaging cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).
- Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6, (2011).
- Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3. J Vis Exp. (82), e51060 (2013).
- Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish. Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).
- Julich, D., et al. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, (2014).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J Vis Exp. (89), e51604 (2014).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (93), e52063 (2014).
