Summary
Cilia विकास उचित organogenesis के लिए महत्वपूर्ण है । यह प्रोटोकॉल zebrafish के oleraceum कक्षों को लेबल करने और विज़ुअलाइज़ करने के लिए ऑप्टिमाइज़ की गई विधि का वर्णन करता है ।
Abstract
हाल के वर्षों में, zebrafish भ्रूण विकासात्मक इस तरह के पूर्व utero भ्रूण विकास और ऑप्टिकल पारदर्शिता के रूप में लक्षण के कारण जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय मॉडल के रूप में उभरा है । विशेष रूप से, zebrafish भ्रूण हड्डीवाला गुर्दे organogenesis के रूप में अच्छी तरह से multiciliated सेल (एमसीसी) के विकास के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण जीव बन गया है । भ्रूण zebrafish गुर्दे में एमसीसीएस कल्पना करने के लिए, हम पूरे के एक संयुक्त प्रोटोकॉल सीटू संकरण (मछली) और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस में माउंट फ्लोरोसेंट विकसित किया है (यदि) कि उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग सक्षम बनाता है । यह पांडुलिपि एक उपकरण के रूप में सह स्थानीयकरण आरएनए टेप और प्रोटीन के लिए हमारी तकनीक का वर्णन करने के लिए बेहतर विभिंन वंश कारकों की अभिव्यक्ति के माध्यम से विकास कार्यक्रमों के विनियमन को समझते हैं ।
Introduction
पिछले कई दशकों से, zebrafish (ढाणियो rerio) विकासात्मक जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक प्रमुख मॉडल जीव के रूप में उभरा है । भ्रूण मां के बाहर विकसित और ऑप्टिकली पारदर्शी हैं । इसके अलावा, नेत्र, गुर्दे, और forebrain के रूप में महत्वपूर्ण अंगों का गठन तेजी से होता है, सिर्फ 24 एच पोस्ट निषेचन (hpf) द्वारा गठित संरचनाओं के साथ । महत्वपूर्ण बात, zebrafish जीनोम अत्यधिक स्तनधारी1,2,3के साथ संरक्षित है । इसके अतिरिक्त, zebrafish और स्तनधारी अंगों समान शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान है । zebrafish भ्रूण गुर्दे, या pronephros, जल्दी nephrogenesis और भाग्य का निर्धारण के दौरान जीन समारोह की जांच के लिए मॉडल प्रणाली के मूल्य को दर्शाता है हड्डीवाला nephron4की उपकला कोशिका आबादी, 5 , ६ , 7 , 8 , 9 , 10. इसी तरह, zebrafish भ्रूण की ontogeny की जांच में तेजी से महत्वपूर्ण हो गया है एमसीसीएस11,12,13,14,15, 16 , 17.
उनके नाम का सुझाव के रूप में, एमसीसीएस शिखर सतह पर स्थित gram cilia के एक बंडल द्वारा विशेषता उपकला कोशिकाओं रहे हैं17. zebrafish में, द्रव प्रवाह में एमसीसीएस समारोह और एक "नमक में फैला रहे है और काली मिर्च" फैशन की तरह "pronephros के प्रत्येक nephron के बीच भर में 24 hpf 11,12,13,14 15 , 16 , 17. यद्यपि वे मानव गुर्दे की बीमारी के मामलों में केवल एक मुट्ठी में नोट किया गया है18,19,20,21, एमसीसीएस मस्तिष्क जैसे अन्य स्तनधारी ऊतकों में प्रचलित हैं और श्वासनली22,23,24, जो प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए चुनौतियों का एक मेजबान बन गया है । zebrafish सहित विभिंन हड्डीवाला मॉडलों में सुरुचिपूर्ण अध्ययनों से एमसीसी भाग्य का एक संरक्षित मार्ग का प्रदर्शन किया है, एमसीसी के विकास के एक अवरोधक के रूप में पायदान संकेत मार्ग के साथ12,17,25 ,26,27. इसलिए, zebrafish pronephros एक आसानी से सुलभ मॉडल vivo11,12,13,14, में एमसीसी विकास के आनुवंशिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए प्रदान करता है 15 , 16 , 17.
दोनों पारदर्शिता और zebrafish भ्रूण के आसान आनुवंशिक हेरफेर साबित कर दिया है अमूल्य लक्षण जब आनुवंशिक और आणविक रास्ते का अध्ययन है कि कोशिका भाग्य, ऊतक विकास को विनियमित, और जल्दी भ्रूण के विकास1,2 ,3. जैसे, पारंपरिक तकनीक के रूप में सीटू संकरण और पूरे माउंट में प्रोटीन और जीन टेप, कल्पना करने के लिए अगर, करने के लिए लागू किया गया है और zebrafish के लिए अनुकूलित16,28,29, 30,31,३२,३३,३४,३५,३६,३७,३८. मछली के लिए लोकप्रिय प्रोटोकॉल के संयोजन और अगर, यह लेबल और एमसीसीएस vivo16,28,३७,३८ मेंविश्लेषण करने के लिए संभव है ।
Protocol
निंनलिखित प्रोटोकॉल zebrafish वयस्कों का उपयोग करता है बनाए रखा और Notre डेम के विश्वविद्यालय में zebrafish अनुसंधान के लिए केंद्र द्वारा परवाह है । zebrafish वयस्कों और भ्रूण के साथ काम करने के लिए सभी तरीकों संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. भ्रूण निर्धारण
- ३९,४०पहले वर्णित विधियों का उपयोग कर zebrafish भ्रूण ले लीजिए । पर 24 hpf, जोड़ें ५०० µ एल के गैर विशिष्ट चिढ़ाने मिश्रण समाधान (५० mg/एमएल) E3 करने के लिए एक भ्रूण डिश में कमरे के तापमान पर मशीन (RT) ।
- एक बार भ्रूण चोरियों से बाहर तोड़ने शुरू, भ्रूण पकवान से सभी तरल हटा दें ।
- धो भ्रूण 2-3 बार ताजा e3 के साथ लगभग e3 के 20 मिलीलीटर जोड़ने के द्वारा, धीरे पकवान में e3 घूमता है, और फिर एक तरल अपशिष्ट संदूक में तरल पदार्थ की खिचड़ी भाषा ।
- फिक्सिंग से पहले भ्रूण को euthanize करने के लिए, E3 पर ०.२% tricaine के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
- एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर एक 5 मिलीलीटर कांच की शीशी में भ्रूण स्थानांतरण । पिपेट का उपयोग कर tricaine/E3 समाधान के अधिकांश निकालें बाद में भ्रूण को शीशी के नीचे तक बसा लिया ।
- आरटी में 2-4 h के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) के 5 मिलीलीटर के साथ 24 hpf भ्रूण को ठीक करें, आंदोलन के बिना ।
चेतावनी: पीएफए विषाक्त और पीएफए समाधान एक रासायनिक हुड के नीचे संभाला जाना चाहिए, जबकि शोधकर्ता आंख संरक्षण, दस्ताने पहने हुए है, और एक प्रयोगशाला कोट । दानेदार पीएफए के रूप में स्थिर आरोप के माध्यम से फैलाने के लिए जाता है के रूप में पीएफए निर्धारण की तैयारी, पीएफए पाउडर से असाधारण देखभाल के साथ किया जाना चाहिए ।
नोट: भ्रूण 4% पीएफए में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में ठीक कर सकते हैं । एक फोड़ा करने के लिए लगातार सरगर्मी पूरी तरह से दानेदार पीएफए को भंग करने के लिए एक उबाल के लिए 1x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) द्वारा 4% पीएफए तैयार करें । एक बार समाधान वापस शांत है RT करने के लिए नीचे, 4% पीएफए फिल्टर वैक्यूम निस्पंदन के लिए एक ०.४५ µm डिस्पोजेबल प्रणाली के माध्यम से यह गुजर द्वारा निष्फल है, तो और aliquoted में 15 मिलीलीटर या ५० मिलीलीटर भागों में-20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए । - 4% निकालें पीएफए और दो बार भ्रूण को धो 1x फॉस्फेट के साथ ०.१% के बीच-20 (RT पर PBST) के साथ खारा बफर । आर टी पर १००% मेथनॉल (MeOH) के 5 मिलीलीटर के साथ एक बार भ्रूण धो लें । कम से कम 20 मिनट के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर नए सिरे से १००% MeOH के 5 मिलीलीटर भ्रूण और मशीन के लिए जोड़ें ।
नोट: भ्रूण को १००% MeOH में-20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहित किया जा सकता है जब तक भ्रूण तैयारी के लिए तैयार ।
2. भ्रूण की तैयारी और संकरण
- आरटी में 5 मिनट के लिए 1x PBST में ५०% MeOH के 5 मिलीलीटर में एक बार धोने के द्वारा भ्रूण reहाइड्रेट । आरटी में 5 मिनट के लिए 1x PBST में 30% MeOH के 5 मिलीलीटर में भ्रूण धोने से निर्जलीकरण जारी रखें । 5 मिनट के लिए दो बार 1x PBST के 5 मिलीलीटर में भ्रूण धो भ.
- Permeabilize 1 के एक समाधान के 5 मिलीलीटर में उंहें मशीन द्वारा भ्रूण की एक: 1000 proteinase K (pK) (10 मिलीग्राम/एमएल) 1x PBST में 2 मिनट के लिए आरटी में ।
नोट: पुराने भ्रूण के ऊपर कहा पीके एकाग्रता में 2 मिनट से अधिक समय की गर्मी हो सकती है, लेकिन 5 मिलीग्राम/एमएल और समय से कम 2 मिनट की एकाग्रता 24 hpf से छोटे भ्रूण के लिए सुझाव दिया है । - pK समाधान निकालें और आरटी में दो बार 5 मिलीलीटर में तुरंत धो लें PBST में भ्रूण ठीक हो 4% पीएफए के आरटी पर 5 कम 20 मिनट के लिए ।
नोट: भ्रूण 4% पीएफए में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में ठीक कर सकते हैं । - पीएफए निकालें और RT पर 1x PBST के 5 मिलीलीटर में दो बार धो लें ।
- फ्लैट नीचे microcentrifuge ट्यूबों में 1x PBST के 5 मिलीलीटर में भ्रूण स्थानांतरण एक microcentrifuge रैक आरटी में सीधे रखा एक भ्रूण और बाद में संकरण समाधान के बीच बातचीत की सुविधा के लिए ।
- आर टी पर संकरण समाधान (Hyb +) के १.५ मिलीलीटर में दो बार भ्रूण धो लो ताजा Hyb + के १.५ मिलीलीटर जोड़ें + और 4-6 एच के लिए एक संकरण ओवन में ७० डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण की मशीन ।
- Hyb + की १.५ मिलीलीटर की जगह जांच समाधान की मात्रा के साथ (10 µ एल आरएनए जांच/500 µ l Hyb +) पूरी तरह से भ्रूण को कवर करने के लिए पर्याप्त ।
नोट: पहले वर्णित विधियों का उपयोग करके संश्लेषित antisense आरएनए जांच३९। - संकरण ७० ° c पर संकरण ओवन में रात भर जांच microcentrifuge रैक में सीधे तैनात व्यक्तिगत ट्यूबों के साथ, मिलाते हुए बिना ।
3. गर्म बहाकर और अवरुद्ध
नोट: गर्म धोया भ्रूण पर उचित समाधान डाल और फिर ७० डिग्री सेल्सियस पर संकरण ओवन में मशीन द्वारा प्रदर्शन कर रहे हैं । ७० डिग्री सेल्सियस पर धुलाई समाधान रखने के लिए, संकरण ओवन में प्रत्येक समाधान की जगह ५० मिलीलीटर ट्यूब जब जांच/Hyb + मिश्रण जोड़ा जाता है ।
- जांच को हटा दें । ७० ° c में दो बार भ्रूण धो ५०% formamide/2x खारा-सोडियम साइट्रेट (एसएससी) बफर 20-30 मिनट के लिए प्रत्येक के १.५ मिलीलीटर में ।
नोट: जांच Hyb + पर-20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहित किया जा सकता है और एक बाद की तारीख में फिर से इस्तेमाल किया । - 15 मिनट के लिए 2x एसएससी के १.५ मिलीलीटर में ७० डिग्री सेल्सियस पर एक बार भ्रूण धो दो बार ७० डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण धो 20-30 मिनट प्रत्येक के लिए 0.2 x एसएससी के १.५ मिलीलीटर में । बदलें 0.2 एक्स १.५ मिलीलीटर के साथ एसएससी अवरुद्ध और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
नोट: यह करने के लिए आरटी पर 4 घंटे के बजाय रात भर के एजेंट अवरुद्ध गर्मी संभव है ।
4. एंटीबॉडी गर्मी और नर एसिड बफर बहाकर
नोट: परिवेश प्रकाश से संरक्षित भ्रूण रखें ।
- विरोधी के ०.२ मिलीलीटर के साथ ब्लॉकिंग एजेंट बदलें-खुदाई-1 के अनुपात में एजेंट अवरुद्ध में फली: 1000 और पन्नी के तहत 3 एच के लिए मशीन या आर टी पर एक और प्रकाश अवरुद्ध कवर ।
नोट: वैकल्पिक रूप से, एंटीबॉडी 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी कर सकते हैं । - 3 एच के बाद, पुरुष एसिड बफर के १.५ मिलीलीटर 2-4 बार में प्रत्येक RT. में 4 ° c पर रात भर भ्रूण गर्मी ताजा नर एसिड बफर के १.५ मिलीलीटर में भ्रूण धो लो ।
नोट: यह आवश्यक नहीं है पुरुष एसिड बफर में रात भर गर्मी, लेकिन ऐसा करने से जांच पृष्ठभूमि घट जाती है ।
5. जांच का पता लगाने और Peroxidase को हटाने
नोट: परिवेश प्रकाश से संरक्षित भ्रूण रखें ।
- पुरुष एसिड बफर निकालें और 1x पंजाबियों की १.५ मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित । १.५ 1x पंजाब के 5 मिनट में आरटी में प्रत्येक के लिए दो बार भ्रूण धोने Cy3 फ्लोरोसेंट के लिए ०.२ एमएल में ६० मिनट के लिए आर सी में भ्रूण मशीन ।
नोट: मशीन समय अलग जांच के लिए भिंन हो सकते हैं । - आरटी में 10 मिनट के लिए 1x पंजाब में निंनलिखित प्रतिशत MeOH के १.५ मिलीलीटर के साथ एक बार भ्रूण धो: 30% MeOH, ५०% MeOH, ७५% MeOH और १००% MeOH ।
- 1% एच2ओ2 के १.५ मिलीलीटर के साथ MeOH में आरटी पर 30 मिनट के लिए भ्रूण मशीन । RT में 10 मिनट के लिए 1x पंजाब में निंनलिखित MeOH समाधान के १.५ मिलीलीटर के साथ एक बार भ्रूण धो: ७५% MeOH, ५०% MeOH, और 30% MeOH । 5 मिन के लिए दो बार भ्रूण धो 1x पंजाब के १.५ मिलीलीटर में प्रत्येक ।
नोट: भ्रूण 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात पंजाब में संग्रहित किया जा सकता है ।
6. इम्यूनोफ्लोरेसेंस
नोट: परिवेश प्रकाश से संरक्षित भ्रूण रखें ।
- RT में 5 मिनट के लिए ddH2O के १.५ मिलीलीटर में भ्रूण धो लें । पूर्व ठंडा एसीटोन के १.५ मिलीलीटर में भ्रूण धोने (आरटी पर 7 मिनट के लिए रखा-20 डिग्री सेल्सियस) में एक बार ddH2के १.५ मिलीलीटर में भ्रूण धो 5 आर टी में एक बार.. । भ्रूण को धो लें १.५ आरटी में 5 मिनट के लिए 1% DMSO (PBDT) के साथ 1x PBST की मिलीलीटर
- 2 एच के लिए आरटी में एक झूली कुरसी पर PBDT + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के १.५ मिलीलीटर में भ्रूण की मशीन ।
- निकालें PBDT + FBS और प्राथमिक एंटीबॉडी, विरोधी acetylated tubulin (माउस से उत्पादित) और विरोधी γ-tubulin के १.५ मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित (खरगोश से उत्पादित), PBDT में 1:400 में एक साथ पतला + 1% FBS । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर भ्रूण गर्मी ।
नोट: गर्मी के समय प्राथमिक एंटीबॉडी के आधार पर भिंन हो सकते हैं । अलग समय अंतराल के परीक्षण लेबलिंग का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
7. माध्यमिक एंटीबॉडी
नोट: परिवेश प्रकाश से संरक्षित भ्रूण रखें ।
- भ्रूण से अतिरिक्त असीम एंटीबॉडी को दूर करने के लिए, PBDT के १.५ मिलीलीटर में धो + 1% FBS + ०.१ एम NaCl 1 मिनट के लिए आरटी पर एक झूली कुरसी पर ।
- PBDT के १.५ मिलीलीटर में 5 बार भ्रूण धो + 1% FBS + ०.१ एम NaCl 30 मिनट के लिए आरटी में एक झूली कुरसी पर प्रत्येक के लिए PBDT के १.५ मिलीलीटर + 1% FBS में एक झूली कुरसी पर आरटी पर 30 मिनट के लिए ।
- माध्यमिक एंटीबॉडी के २०० µ एल में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात भ्रूण गर्मी, alexa ४८८ बकरी विरोधी माउस आईजीजी और alexa ६४७ बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी, PBDT में 1:500 पर एक साथ पतला ।
8. DAPI धुंधलाना
नोट: परिवेश प्रकाश से संरक्षित भ्रूण रखें ।
- PBDT के १.५ मिलीलीटर में आरटी में जल्दी भ्रूण धो दो बार । DAPI के १.५ मिलीलीटर के साथ PBDT बदलें, 1x PBST में 1:15000 पतला, और आर टी पर एक झूली कुरसी पर 15 मिनट की मशीन ।
- PDBT के १.५ मिलीलीटर में भ्रूण धो + 1% FBS + ०.१ एम NaCl 15-20 मिनट प्रत्येक के लिए आरटी पर तीन बार । 4 डिग्री सेल्सियस पर PBDT के १.५ मिलीलीटर में स्टोर भ्रूण माउंट और छवि के लिए तैयार है जब तक ।
9. Zebrafish Pronephros के लिए बढ़ते और इमेजिंग
- एक छोटी सी मात्रा में ग्लास स्लाइड पर भ्रूण पार्श्व करना, लगभग PBDT के 10 µ एल, ।
- सिर और जर्दी गेंद के कुछ दूर करने के लिए ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ आंखों के पीछे भ्रूण निचोड़ ।
- ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे भ्रूण शरीर से दूर शेष जर्दी गेंद परिमार्जन । एक पतली ऊतक के साथ स्लाइड से असंबद्ध की जर्दी और अतिरिक्त तरल निकालें ।
- भ्रूण और स्थिति की शेष पूंछ के लिए बढ़ते मीडिया की एक बूंद तो पूंछ बाद में रखी है जोड़ें । नमूना समतल करने के लिए पूंछ के शीर्ष पर एक coverslip प्लेस, तो एक कवर स्लाइड बॉक्स में जगह है ।
- एक फोकल माइक्रोस्कोप पर 60X आवर्धन पर छवि गुर्दे cilia निंनलिखित चैनलों का उपयोग: नीले रंग में DAPI (लेजर ४०८.० एनएम पर सेट), हरे रंग में FITC (लेजर ४८८.० एनएम पर सेट), Cy3 डाई-लाल रंग में लेबल (५६१.० एनएम पर लेजर सेट), और Alexa ६८० सफेद में (६३७.० एनएम पर सेट लेजर) ।
Representative Results
वन्य-प्रकार के zebrafish भ्रूण २४ hpf पर तय किए गए और तुरंत ऊपर बताए अनुसार तैयार किए गए. आरेख 1 चयनित सचित्र चरणों के साथ एक प्रायोगिक कार्यप्रवाह दर्शाया गया है । 1-8 चरणों में उल्लिखित कार्यप्रवाह नमूना खरीद, निर्धारण, और तय ऊतक के हेरफेर की प्रक्रिया शामिल है antisense riboprobes के साथ अंतर्जात टेप लेबल करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा लेबल प्रोटीन (ओं) के बाद ब्याज की । कार्यप्रवाह में चरण 9 बढ़ते और इमेजिंग तकनीक विशेष रूप से zebrafish भ्रूण ट्रंक के दृश्य का अनुकूलन करने के लिए डिज़ाइन करने के लिए संदर्भित करता है । चित्र है कि 9 कदम के साथ, हम स्थिति के लिए हेरफेर की विधि उदाहरण देकर स्पष्ट करना एक गिलास स्लाइड पर ऊतक । इस चरण में, भ्रूण सिर और जर्दी गेंद हटा रहे हैं, पूंछ छोड़ने के लिए बाद में एक गिलास स्लाइड और coverslip के बीच तैनात हैं । जर्दी गेंद और सिर को हटाने pronephros में निवासी एमसीसी आबादी का सबसे अच्छा इमेजिंग के लिए सुझाव दिया है, जर्दी गेंद ऑटो fluoresces और पहुंचा बढ़ते प्रक्रिया के रूप में ।
प्रतिनिधि छवियां एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त की चित्रा 2, जो 60X आवर्धन और एक ही आवर्धन पर एक डिजिटल ज़ूम में ही जंगली प्रकार के भ्रूण से पता चलता है में प्रदान की जाती हैं । शीर्ष पैनलों प्रत्येक व्यक्ति चैनल की छवियां प्रदान करते हैं, जबकि नीचे दो पैनलों इन इमेजिंग डेटा के समग्र ओवरले हैं । सफेद बॉक्स (बाएं कॉलम छवि में) क्षेत्र है कि डिजिटल ज़ूम (सही कॉलम छवि) का ध्यान है रूपरेखा । डिजिटल ज़ूम के अंतिम पैनल में हाइलाइट किया गया, नाभिक DAPI में लेबल थे, और एमसीसीएस एक antisense riboprobe को पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जहां एंटीबॉडी odf3b-γ को बेसल निकायों और tubulin-α अर्थ निरूपित tubulin के आधार पर पता लगाया गया । समग्र उपरिशाई के डिजिटल ज़ूम में, पीले रंग का धराशायी सर्कल एक एमसीसी की परिधि इंगित करता है, जो odf3b टेप के कब्जे की वजह से पहचान की गई थी, कई बेसल निकायों, और cilia । निकटवर्ती मोनो-oleraceum सेल, एक पीला बिंदीदार चक्र के साथ लेबल, एक एकल बेसल शरीर और एक एकल पपनी रखने के phenotype के आधार पर पहचान की थी.
चित्र 1: प्रायोगिक फ़्लोचार्ट का योजनाबद्ध. यह फ़्लोचार्ट एक प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह दिखाता है, जिसमें महत्वपूर्ण चरणों के रेखांकन के साथ, जिसमें हिमपात का एक खंड इंगित करता है शीत गर्मी, तीन घुमावदार लाइनें ऊष्मा का प्रतिनिधित्व करती हैं, और घड़ी लंबी मशीन समय का प्रतिनिधित्व करती है । कार्यप्रवाह 6 दिनों की एक ंयूनतम में किया जा सकता है (प्रक्रिया में प्रत्येक चरण के ऊपरी दाएँ कोने में दिन संख्या देखें), हालांकि कुछ कदम अब समय अवधियों पर किया जा सकता है, के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लेख किया । बढ़ते प्रक्रिया का एक विस्तृत चित्रण बाहर खींचा है, ग्लास स्लाइड और coverslip के बीच अंतिम घुड़सवार भ्रूण पूंछ का प्रदर्शन । एक काला धराशायी बॉक्स क्षेत्र है कि 60X आवर्धन पर imaged है रूपरेखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: zebrafish pronephros के एमसीसीएस visualizing के लिए प्रतिनिधि परिणाम. 60X आवर्धन पर एक 24 hpf वंय-प्रकार zebrafish भ्रूण के अधिकतम छवि अनुमानों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक ही भ्रूण के 60X इज़ाफ़ा पर फोकल पर एक डिजिटल ज़ूम । सफेद बक्से ज़ूम के लिए पर ध्यान केंद्रित क्षेत्र इंगित करते हैं । DAPI के व्यक्तिगत दाग (नाभिक), odf3b (एमसीसीएस), γ-tubulin (बेसल निकायों), और α-tubulin (cilia) लेबल और फिर नीचे दो पैनलों में एक साथ विलय कर रहे हैं । डिजिटल ज़ूम में, हम इस प्रकार के रूप में सेल स्थानों के सन्निकटन प्रदान करते हैं: एक एमसीसी डैश्ड येलो सर्कल द्वारा रेखांकित किया है, और बिंदीदार पीले सर्कल एक मोनो oleraceum सेल रूपरेखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
ऊपर विस्तृत प्रोटोकॉल odf3b टेप और α-tubulin में 24 hpf zebrafish भ्रूण के साथ pronephros में लेबल एमसीसीएस के लिए अनुकूलित है । सबसे अच्छा परिणाम के लिए, यह नए सिरे से तय की और तैयार भ्रूण का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है । भ्रूण है कि तय कर दिया गया है और या तो MeOH या Hyb में संग्रहित + पर-20 डिग्री सेल्सियस के लिए एक सप्ताह से अधिक इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन समय है कि भ्रूण भंडारण में रखा जाता है के साथ अवांछित पृष्ठभूमि धुंधला बढ़ की संभावना ।
संशोधनों और इस तकनीक के निवारण के लिए विशेष मार्करों के अंय suites के लिए इस विधि दर्जी आवश्यक हैं, अंय antisense riboprobes और अंय एंटीबॉडी उदा । सीटू संकरण में पूरे माउंट की प्रक्रिया में चरणों के मापदंडों को समायोजित करने के लिए कई विधियों पहले हमारे समूह और अन्य लोगों द्वारा दर्ज़ किया गया है31,३४,३६,३८, ३९. इसी तरह, प्रत्येक प्रोटीन एंटीबॉडी धुंधला समय के संदर्भ में कुछ समस्या निवारण की आवश्यकता होगी, और प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए कमजोर पड़ने और गर्मी के समय के अनुमानित पर्वतमाला सबसे अच्छा प्रलेखित परिणाम28के मूल्यांकन द्वारा अनुमानित हैं, ३५. 24 hpf से छोटे भ्रूण के लिए, पीके उपचार 2 मिनट से कम होना चाहिए, जहां 24 hpf से अधिक पुराने भ्रूण 2 मिनट से अधिक समय के लिए pk के साथ इलाज किया जाना चाहिए । इसके अलावा, 24 hpf से अधिक पुराने भ्रूण पीके उपचार से पहले वर्णक का प्रक्षालित किया जाना चाहिए ।
फ्लोरोसेंट धुंधला समाधान के साथ दाग के बाद, यह मेथनॉल और हाइड्रोजन पेरोक्साइड बहाकर की श्रृंखला के प्रदर्शन से किसी भी शेष दाग, एंटीबॉडी, और peroxidases को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है । पंजाबियों तुरंत पालन बहाकर भ्रूण से अतिरिक्त मेथनॉल को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । महत्वपूर्ण बात, अगर एंटीबॉडी के साथ आगे बढ़ने से पहले, हमने पाया है कि एसीटोन और जल बहाकर भ्रूण कम करने के लिए एक दूसरे का पालन करने की संभावना बना और/या केंद्रापसारक ट्यूबों । हमारे अनुभव में, विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों और अंय जीन के लिए एंटीबॉडी, हालांकि वे पश्चिमी दाग में कुशलता से काम कर सकते हैं, के लिए अच्छी तरह से काम नहीं करते अगर zebrafish में । हालांकि, अत्यधिक संरक्षण, और प्रचुर मात्रा में प्रोटीन, जैसे α-tubulin और β-catenin, के लिए zebrafish में अच्छी तरह से काम करते हैं, तो16,३७.
मछली के साथ, यह जीन है कि अभी तक zebrafish में विशिष्ट एंटीबॉडी नहीं है की आरएनए टेप कल्पना करने के लिए संभव है । के साथ मछली के संयोजन के द्वारा यदि, के रूप में इस प्रोटोकॉल द्वारा प्रदर्शन, आरएनए टेप के सह स्थानीयकरण और प्रोटीन vivo (चित्रा 2) में देखा जा सकता है । प्रोटोकॉल की लचीली प्रकृति विभिन्न आरएनए टेप और कई ऊतकों और समय अंक में प्रोटीन के दृश्य के लिए त्वरित समस्या निवारण सक्षम बनाता है. जब zebrafish भ्रूण के पहले से ही संमान के लक्षण के साथ संयुक्त, मछली के इस प्रोटोकॉल + यदि एक और उपकरण के लिए जीन और विकासात्मक मार्ग विनियमन के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन की अभिव्यक्ति का पता लगाने प्रदान करता है ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम के हिस्से में ग्रांट R01DK100237 द्वारा R.A.W. को सपोर्ट किया गया और नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप नं. डीजीई-१३१३५८३ को A.N.M. हम भी M.U. के लिए समर्थन के लिए विज्ञान ग्रीष्मकालीन स्नातक अनुसंधान फैलोशिप कार्यक्रम के कॉलेज को धंयवाद हम Notre डेम के विश्वविद्यालय में Zebrafish अनुसंधान के लिए हमारे Zebrafish के अपने समर्पित देखभाल के लिए केंद्र का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम भी जैविक विज्ञान विभाग के साथ ही उनके समर्थन और बहुमूल्य अंतर्दृष्टि के सभी के लिए हमारी प्रयोगशाला के सदस्यों को धंयवाद देना चाहूंगा ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
| E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
| embryo dishes | VWR | 351029 | |
| 5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
| disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
| 10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
| 1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
| methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
| proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
| flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
| hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
| hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
| 20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
| blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
| maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
| anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
| Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
| molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
| acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
| monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
| anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
| odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
| NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
| Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
| glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
| glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
| confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
| rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |
References
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