Summary
Incongruenties in menselijke leukocyten antigeen (HLA) sequenties tussen organ donor en ontvanger paren zijn de belangrijkste oorzaak van antilichaam-gemedieerde afwijzing in orgaantransplantatie. Hier presenteren we het gebruik van aangepaste antigeen arrays die zijn gebaseerd op individuele donoren HLA sequenties sonde anti-donor HLA alloantibodies orgel geadresseerden.
Abstract
In de orgaantransplantatie vertrouwen de functie en de levensduur van de prothese kritisch op het succes van de beheersing van de immunologische afwijzing reactiviteit tegen human leukocyte antigenen (HLA). Comptabiliteit richtsnoeren zijn gebaseerd op laboratoriumtests van anti-HLA immuniteit, die als een voorafbestaand presenteert of DOVO gegenereerd HLA-antilichamen die een grote transplantatie belemmering vormen. Huidige tests zijn gebouwd op een platform van de single-antigeen kralen (SAB) met behulp van een vaste set van ~ 100 voorgeselecteerde recombinante HLA antigenen sonde transplantatie sera. Er bestaan echter bij de mens een veel grotere verscheidenheid aan HLA-typen, met geen twee individuen dan identieke tweelingen die dezelfde combinatie van HLA-sequenties kunnen delen. Terwijl geavanceerde technologieën voor HLA-typering en directe het rangschikken nauwkeurig eventuele incongruenties in DNA-sequentie tussen een donor vangen kunnen en geadresseerde HLA, de SAB assay, wegens zijn beperkte verscheidenheid in volgorde de vertegenwoordiging, is niet nauwkeurig detecteren alloantibodies speciaal tegen de donor HLA incongruenties. We gestreefd naar de ontwikkeling van een aanvullende methode met behulp van een andere technologie te detecteren en karakteriseren van anti-donor HLA-antilichamen op een persoonlijke basis. De screening tool is een aangepaste peptide matrix van donor HLA-afgeleide reeksen voor indringende na transplantatie sera van de orgel-ontvanger het risico voor de antilichaam-gemedieerde afwijzing te beoordelen. Op één array voor een paar van de donor en ontvanger, zijn tot 600 unieke peptiden gemaakt op basis van de donor HLA proteïne sequenties, elke peptide uitvoering ten minste één niet-overeenkomende residu in een 15-amino acid reeks. In onze proefprojecten te vergelijken antigeen patronen voor pre- en post-transplantatie sera op deze arrays en konden we detecteren anti-HLA signalen met de resolutie die ook we konden voor het lokaliseren van de immuun epitopes betrokken. Deze gepersonaliseerde antigeen matrices met een hoge resolutie detectie van donor-specifieke HLA epitopes in orgaantransplantatie toestaan.
Introduction
Orgel-substitutietherapie die is routinematig uitgevoerd over de hele wereld heeft miljoenen levens gered. Solide orgaantransplantatie treedt op bij ongeveer 100 patiënten per miljoen mensen in de VS jaarlijks, terwijl een groter aantal nog op waitlists voor het ontvangen van donor-organen als gevolg van een ernstig tekort aan aanbod (op basis van informatie verstrekt door het orgaan Verkrijging en transplantatie netwerk - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Orgaantransplantatie is sterk gereguleerd om orgel afval verminderen en levens te redden, maar de wetenschappelijke instrumenten gebruikt om te informeren deze verordeningen zijn beperkt in effectiviteit. Bijvoorbeeld, de wetenschappelijke gemeenschap erkent volledig de zeer veelvormige Staten van HLA-moleculen en nauwkeurige genetische tests van DNA met behulp van hoge-resolutie te typen en op basis van volgorde te typen (SBT) zijn ontwikkeld in de afgelopen jaren1, 2. echter, methoden voor het testen van alloantibody nog niet hebben kunnen produceren de enorme verscheidenheid van individuele HLA sequenties als antigeen sondes. De standaardtest wordt tegenwoordig gebruikt een onveranderlijk panel van ~ 100 allèlique antigenen die bestaan uit voorkomende varianten van HLA, A, B, C, DQ, DP en DR sequenties in menselijke populaties3,,4,,5,6. Vaak van de werkelijke donor HLA sequenties zijn niet opgenomen in het test panel, dwingen haartransplantatie artsen en chirurgen afleiden van donor-specifieke reactiviteit op basis van gedeelde overeenkomsten tussen donor werkelijke sequenties en bijbehorende "standaarden" in de Test set7,8. Daarom is het soms wel uitdagend om een betrouwbare inschatting maken van afwijzing risicogebaseerde op antilichaam test resultaten9,10,11,12. Nieuwe persoonlijk aanpasbare tests voor alloantibodies zijn dus dringend noodzakelijke13,14.
De HLA-genen coderen de grote histocompatibility complex (MHC) receptoren die een belangrijke functie in immuunresponsen6 hebben. HLA-genen zitten bekend voor zitten de meest polymorfe genen van het menselijk genoom6. Als gevolg van de snelle vooruitgang in DNA sequencing strategieën voor de HLA-genen, nieuwe allèlique varianten (of gewoon allelen genoemd) worden ontdekt op een explosieve tarief15,16. Door maart 2017, 16,755 gevalideerde allelen had neergelegd bij de IMGT/HLA Database (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), van welke 12,351 waren van klasse I en 4,404 waren van klasse II groepen. In schril contrast, zijn alleen een beetje meer dan 100 verschillende allelen vertegenwoordigd in de standaard één-antigeen kralen (SAB) bepaling, die routinematig gebruikt is om alloantibodies detecteren in orgaantransplantatie. De SAB-methode is gebaseerd op een platform van de Luminex met behulp van stroom cytometry. Aangezien de bepaling maakt gebruik van een onveranderlijk set van antigenen, afgezien van kleine charges variabiliteiten in productie, kan de antiserum test worden krachtig gestandaardiseerd over personen en over laboratoria5. Deze test is echter niet in staat om vast te leggen van alle alloantibodies ontwikkeld specifiek tegen de donor allelen, met name wanneer de donor-sequenties afwezig zijn van de WRA instellen. Aangepaste productie van donorlanden antigenen op basis van echte reeksen weliswaar wenselijk zijn, blijven er technische uitdagingen in de stroomlijning van de nodige productie- en testprocedures.
We beschreven onlangs een alternatieve methode in een haalbaarheidsstudie van renale transplantatie onderwerpen17. De methode peptide-antigeen in een matrix-indeling gebruikt voor indringende pre en post transplantatie sera van afzonderlijke onderwerpen. Elke matrix was aangepaste gebouwd met behulp van de SPOT synthese methode18,19,20,21,22,23 dat peptide antigenen, elke 15 produceert aminozuren in lengte, volledig gebaseerd op de respectieve orgaandonor HLA allelen voor A, B, C, DQA1, DQB1 en DRB1. SPOT synthese is een cellulose membraan met behulp van standaard Fmoc-chemie22 geopereerd en kan produceren honderden aangepaste peptiden in parallel met een volledig geautomatiseerde robot systeem19,21. De membraan-array kan meerdere rondes van strippen en cycli reprobing weerstaan. In onze retrospectief onderzoek17, we veranderingen in de antigeen gedetecteerd met opgeslagen transplantatie antisera verzameld in een tijdreeks (dat wil zeggen, vóór en na de transplantatie). Hierin beschrijven we de technisch protocol voor de werkstroom met inbegrip van matrix ontwerp, productie, antiserum indringende en resultaat-analyse. De methode is bedoeld voor het opsporen van alloantibodies tegen specifieke lineaire epitopes op transplantatie donorlanden HLA-moleculen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Noordwestelijke Universiteit institutionele Review Board (IRB protocol #: STU00104680). Een totale workflow van het protocol wordt geïllustreerd in Figuur 1.
1. Bioinformatic analyse van Donor en ontvanger HLA-sequenties
- -sequenties van IMGT/HLA database ophalen 15.
- Verkrijgen HLA typering verslagen van zowel de orgaandonor en zijn/haar ontvanger.
Opmerking: Zorg ervoor dat goede procedures ter bescherming van de vertrouwelijke medische gegevens worden gebruikt. Meestal is een institutionele Review Board (IRB) goedkeuring van het protocol van de studie of de experimentele test vereist per institutionele IRB richtsnoeren. Mochten HLA verslagen van PCR-gebaseerde typen (van hoge of lage resolutie) of sequencing gebaseerde te typen (SBT), gaat u rechtstreeks naar stap 1.1.3. Als sequenties werden verkregen genomic/HLA sequencing, en ze zijn voltooid, deze sequenties rechtstreeks gebruik in plaats daarvan. Af en toe, wanneer slechts onvolledig te typen of rangschikkend resultaten beschikbaar zijn, gaat u als volgt de extra stap 1.1.2. toewijzen de " ontbrekende " allelen via de web-tool beschreven in stap 1.1.2. - Open de dubbelzinnige allel combinaties na web link - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html, en zoeken met behulp van het “ dubbelzinnig allel combinaties Search Tool ” functie voor het ophalen van de hypothetische allelen. Ga vervolgens verder naar stap 1.1.3. de naam allel.
- Opent het queryformulier van IMGT/HLA-allel na de webkoppeling - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html en input onderwerp ’ s-allel namen (elk individueel, zoals weergegeven in Figuur 2) in de “ zoeken voor ” vak. Klik op de “ zoeken naar allelen nu ” knop. HLA-allel namen standaard naamgeving systemen moeten gebruiken (dat wil zeggen, A *, A * 01, A * 01:01:01:01 en eventuele eerdere benamingen zoals A * 01010101).
- Zoek de bijpassende allel naam op het scherm weergegeven. Klik op de knop allel.
- Kopie de " eiwit sequentie ", en plak deze in een tekstdocument onder een kopregel van " > allel naam ". Effectief, het document van de tekst is in een FASTA (FAST-All) formaat van de allel naam en volgorde.
- Verkrijgen HLA typering verslagen van zowel de orgaandonor en zijn/haar ontvanger.
- Uitvoeren van gen-gebaseerde meerdere uitlijning van donor en ontvanger/patiënt allelen.
- Één gen (dat wil zeggen, DQB1 * 03:01:01:01) tegelijk, kopieer en plak alle vier allelen van de donor en patiënt FASTA sequences (twee van donor) en twee van de patiënt in een gecombineerde tekstdocument. Op dit punt, het is belangrijk om aan te duiden differentieel donor allel namen uit de namen van de patiënt-allel (opties omvatten differentiële gebruik van bovenste vs. lagere gevallen; of een onderscheidende voorvoegsel of achtervoegsel extensie per naam allel afzonderlijk markeren donor vs maken. patiënt allelen). De input volgorde van de reeksen is niet belangrijk, omdat na uitlijning de volgorde zal worden geschud volgens de niveaus van de gelijkenis tussen elk paar sequenties.
- Kopieer en plak de sequenties in FASTA opmaken (zoals te zien in Figuur 3) van bovenaf in het “ Voer uw input sequenties ” vak op de Cluster Omega-website: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
- Klik op " uw taak stuurt " met behulp van de standaard instellingen van parameters: zoals " PROTEINŔ en " Clustal w / getallen ". Uitlijning uitvoeren door te klikken op " indienen ". Een onderlinge afstemming van de vier reeksen wordt weergegeven op het scherm ( Figuur 4).
- Mark van donor-specifieke incongruenties.
Opmerking: Speciaal opgemerkt dat de allèlique sequenties die hier gegeven werden gebaseerd op de resultaten van de HLA-typering, niet sequencing. Daarom bestaat het risico dat de relevante reeks variatie in het bijzonder donor-ontvanger-paar kan worden gemist. Dit potentiële probleem zal worden verlicht als meer en meer transplantatie centra aannemen nauwkeurig met een hoge resolutie te typen en directe DNA sequencing.- Kopiëren en plak de tekst uitlijnen in een tekstdocument en maak een nieuw document. Als de indeling van het uitgelijnde bestand wordt verstoord, bevestigen de indeling door de tekenstijl en tekengrootte wijzigen: gebruik altijd " Courier New " lettertype in klein formaat past de rijen. Sla het document na de opmaak problemen zijn opgelost.
- Inspecteren handmatig de uitgelijnde sequenties te identificeren alle niet-overeenkomende residuen die uniek deel uitmaken van de donor. Elk van deze donor-specifieke residuen met behulp van een onderscheidende tekstkleur markeren.
- Onderstrepen converteert alle letters in de donor ' s sequenties die 14 residuen uit te breiden zowel up - en downstream van de gemarkeerde donor-specifieke incongruenties (berekend als 15 aminozuur peptide minus 1 residu van de mismatch).
- 15-mer peptide reeksen in een overlappende serie ontlenen.
Opmerking: De reden voor het kiezen van 15-mer peptiden was gebaseerd op de algemene kennis van typische epitopes wordt 4-9 aminozuren in lengte. Daarom, wanneer we toegepast een " bewegende venster " procedure met een stap grootte van 4 aminozuren ( Figuur 1), onze selectie met een lengte van 15 aminozuur liet een 15-4 = 11 aminozuur overlapping tussen alle naburige peptiden in een reeks. In theorie, deze 11 aminozuur overlapping is voldoende voor alle immuun epitopes van maximaal 9 aminozuren in lengte, zodat geen epitoop per ongeluk zullen " split " doormidden met slechts partiële sequenties op de array.- De onderstreepte sequenties gebruiken als sjablonen voor het afleiden van opeenvolgend korte 15 aminozuur sequenties in een reeks die door 4 residuen tussen elke twee onmiddellijk aangrenzende sequenties in de serie overlappen.
- Kopieer en plak deze 15 aminozuur sequenties in een spreadsheet ( Figuur 5) in een kolomindeling vergezeld van notatie kolommen waarin de overeenkomstige namen van de donor allelen. Een extra kolom te nemen aa residu posities wellicht nuttig.
- Herhaalt u de stappen van 1.1.3. naar 1.3. voor elke HLA-allel (bijvoorbeeld A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 en DP) van de donor en de ontvanger paar voor het afleiden van de 15 aa korte reeksen van de donor.
- Kopiëren en plakken van alle kolommen in een master spreadsheet maken een lang doorlopende kolom van alle rijen van de 15 aa van alle allelen van de donor. Noteer het totale aantal rijen (voor de peptide reeksen) in het document.
2. Ontwerp van aangepaste Array lay-out en productie
- genereren een werkblad van peptide sequenties met bijbehorende allel roepingen. De array bestaat uit 20 rijen en 30 kolommen en kunnen houden tot 30 x 20 = 600 plekken voor peptides. Afhankelijk van het totale aantal peptiden opgenomen stap 1.5 van één bepaalde donor, en op basis van onze ervaringen uit het verleden met twee voorbeelden die we in Liu et al. hadden geprobeerd. 17, de 600 plek matrix kan bevatten alle de sequenties die zijn gegenereerd uit ~ 2 aparte transplantatie gevallen.
- Rationeel plan de meest efficient manier om te passen de sets van peptiden binnen het formaat van de 600-spot van de matrix.
- Als meer dan één onderwerp in een hele reeks past, lege rijen invoegen na de eerste donor ' s sequenties aan het totale aantal rijen die kunnen worden gedeeld door 30 (het aantal plekken in een rij op de array).
- Direct na de laatste lege rij voor de eerste reeks van sequenties, plakken in de gehele kolom van de inhoud van de reeks van het tweede geval van transplantatie.
- Herhaal deze stappen totdat de matrix wordt gevuld en geen meer gevallen kunnen worden toegevoegd zonder te overschrijden de 600 plekken. Als hele lege rijen worden overgelaten aan de onderkant, vullen " verplaatsen " de lege rij worden geplaatst tussen de twee donor-sets. Deze brede ruimte tussen gevallen liet maakt knippen van het membraan na voltooiing van de synthese makkelijker - na stap 3.2. onder.
- Program van de peptide reeksen in het kader van matrix lay-out. Het programma van de SPOT-synthesizer neemt een tekstindeling van de sequences (één rij één peptide sequence), die rechtstreeks kan worden verkregen door het resulterende werkblad op te slaan vanaf stap 2.1.4 als een eenvoudige tekstdocument (zonder de extra kolom(men) voor allel namen, aa posities etc.).
- Run geautomatiseerde peptide matrix synthese via de SPOT-synthesizer. De hele operatie van de synthese wordt gedetailleerd beschreven in Kudithipudi et al. 21. Merk op dat Fmoc synthese van twee matrices ~ 4-5 duurt dagen.
3. Sonde en Reprobe Antisera uit een tijdreeks van een individuele transplantatie ontvanger.
Opmerking: de 600-spot membraan array heeft de afmetingen ~ 7 x 13 cm. Na synthese, kunnen de arrays worden opgeslagen op kamertemperatuur als droge membranen voor ten minste twee jaar als beschermd tegen direct licht. Vermijd buitensporige vouwen van het membraan te behouden zijn lange levensduur voor herhaald gebruik.
- De membraan-array met ethanol hydrateren en visualiseren van peptide vlekken gekleurd met Ponceau S.
- Het membraan hydrateren matrix uitvoering de peptiden na een stapsgewijze procedure in Li et al. geoptimaliseerd 24.
- onderdompelen van het membraan van de matrix in 20 mL 100% ethanol.
- Voeg toe 20 mL gedestilleerd water verdunnen van de oplossing van 50% ethanol en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten
- Omzetten in de onderdompeling oplossing 40 mL water 100% driemaal en incubeer 15 min telkens.
- Wassen in een goede werkende buffer, bijvoorbeeld TBST (Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1%), drie keer voor elke 5 min 20 mL.
- Ponceau S kleuring van de matrix te visualiseren van synthetische peptides
- Voeg 20 mL van de vooraf geformuleerde Ponceau S oplossing direct aan de gehydrateerd matrix en incubeer gedurende ~ 30 s met schudden.
- Run gedistilleerd water voortdurend over het membraan om de vlek achtergrond Ponceau S kleur. Tijdens het proces, peptide vlekken van rode kleur kunnen zichtbaar.
- Scheiden de gedeelten van de matrix voor elke donor zorgvuldig snijden tussen de secties van de matrix voor individuele gevallen. Mark van de richting van elk van de matrices.
- Het membraan hydrateren matrix uitvoering de peptiden na een stapsgewijze procedure in Li et al. geoptimaliseerd 24.
- Pre blok matrix.
- Blok het membraan in 20 mL 5% non-fat melk opgelost in buffer TBST. Deze oplossing op basis van melk zal verder de vlekken Ponceau S kleur. De melk buffer meerdere malen vervangen met het oog op de duidelijkste beelden van de peptide.
- Voor het bijhouden van doeleinden, neem een foto van het Ponceau S-beeld van de array gebruikmakend van een hand-held camera (voorbeeld in Figuur 6).
- Blijven blokkeren van het membraan in 5% non-fat melk bij 4 ° C's nachts of bij kamertemperatuur gedurende 2 uur met rockende.
- Incubate matrix met transplantatie antiserum.
Opmerking: Het moet worden opgemerkt dat een fenomeen dat bekend staat als prozone of de haak kan leiden tot van aanvulling-afhankelijke inmenging in serum antilichaam analyse. Om dit probleem te omzeilen, kan een optionele serum voorbehandelingsplatformen stap met EDTA of warmte inactivatie van serummonsters worden beschouwd.- Verwijderen blokkeerbuffer en het membraan met 20 mL van TBST wassen drie keer de volgende dag voor 5 min telkens.
- Voeg toe 20 µL van het ruwe serum van de ontvanger aan 20 mL 2,5% melk in buffer TBST en incubeer met het membraan gedurende 2-3 uur bij kamertemperatuur. Opmerking in deze eerste ronde van het sonderen, wordt aanbevolen dat de laatste na transplantatie serum (of waarschijnlijk meest gesensibiliseerde serum) in de tijdreeks ten eerste wordt gebruikt. Dit is gebaseerd op de veronderstelling dat eerdere modellen in de reeks, met name vanuit pre transplantatie tijdstippen, hebben minder verscheidenheid van alloantibodies die de neiging hebben om te ontwikkelen na verloop van tijd. Deze manier, elke mogelijkheid van signaal interferentie van " "Carry-over" " tussen het sonderen rondes kan duidelijk worden onderscheiden van echt ontwikkelde alloantibody reactiviteit als gevolg van de immuunrespons tegen de ent.
- De array gebruikmakend van 20 mL van TBST wassen en incubeer met secundair antilichaam.
- Het membraan driemaal voor 10 min telkens wassen.
- Incubate met geit anti-menselijke IgG-HRP (mierikswortelperoxidase) secundair antilichaam bij 1:10,000 verdunning in TBST buffer aangevuld met 1% melk voor een ander 2 h.
- Wassen en de vlek ontwikkelen.
- Het membraan driemaal met TBST gedurende 10 minuten telkens wassen.
- Uitvoeren Verbeterde Chemiluminescentie (ECL) met behulp van 5 mL luminol-oplossing vers gemengd met peroxide oplossing te ontwikkelen van het membraan (voor 1 min) 5 mL.
- Visualiseren ECL signalen met behulp van een geschikte imager (dat wil zeggen, ChemiDoc Imaging Systems of Azure C600).
- Scannen en kwantificeren van de vlek.
- De ontwikkelde afbeeldingen ( Figuur 7, onderste afbeelding) opslaan en uitvoeren van kwantificering van plek intensiteit.
4. Antiserum reactiviteit vergelijken over een klinische tijdreeks.
- De array strippen.
- Op dit punt, houden het membraan nat te allen tijde.
- Strook van het membraan door met 20 mL commerciële strippen buffer bij 37 ° C gedurende 20 minuten aan het broeden en daarna wassen het membraan met TBST driemaal voor elke 10 min. Herhaal vervolgens de blokkerende (stap 4.2) en indringende (stap 4.3) stappen met behulp van een verschillende serum van de patiënt op een ander tijdstip punt genomen.
- Blok ontdaan membraan.
Opmerking: Na de strippen, het membraan kan worden hergebruikt voor een andere ronde van het sonderen van een verschillende serum van de dezelfde patiënt in een tijdreeks.- Blokkeren het membraan met behulp van 5% melk buffer als voorheen (zie stap 3.2).
- Reprobe een ander antiserum uit de dezelfde tijd-serie (Herhaal stap van 3.3-3.6; voorbeeld in Figuur 7, bovenste afbeelding).
Opmerking: De gestripte array kan vervolgens worden gebruikt voor een ander serum specimen reprobe. Aangezien de peptiden zijn covalent geconjugeerd met de ondersteunende matrix van het membraan, we hebben laten zien dat de matrix kan worden hergebruikt voor maximaal 20 ronden van strippen en cycli reprobing zonder verlies van haar performance. - Langetermijnopslag van arrays.
- Winkel het membraan in TBS buffer aangevuld met 0,02% w/w natriumazide als conserveermiddel. Gebruik een verzegelde plastic zak voor langdurige opslag. Bij 4 ° C onder bescherming van direct licht, kan de natte membraan worden opgeslagen gedurende ten minste 2 jaar.
5. Data-acquisitie en analyse
- handmatig aantekeningen positieve antigeen peptiden.
- Zoek vlekken tonen positieve antilichaam signalen en elk van hun grid posities bepalen.
- Markeren de overeenkomstige rijen in het hoofdwerkblad voor de positieve peptides.
- Peptide reeksen vermeld in het hoofdwerkblad ( Figuur 7, bodemlijst) ophalen. Volgens het ontwerp beschreven in stap 1.4.1., naburige seriële vlekken delen aanzienlijk overlappende sequenties (15-4 = 11), daarom reactieve epitopes kunnen worden gedeeld door peptiden in een opeenvolgende reeks.
- Markeer elke positieve plekken die zich voordoen in successie.
- Bepalen van minimale epitoop lengte voor elke peptide in een reeks.
- Hoogtepunt een potentieel gedeelde epitoop sequenties op basis van overlappende segmenten van reactieve peptiden.
- Structureel model antigeen epitopes.
- Verkrijgen prototype HLA kristalstructuren van de Protein Data Bank vinden op de volgende de webkoppeling: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
- Het prototype HLA-structuur weergeven in Pymol (te downloaden vanaf www.pymol.org).
- Kaart " of model ontdekt anti-donor epitopes in de 3D-structuren van de prototype HLA-moleculen door te wijzen op de reactieve peptide reeksen ( Figuur 8). Klik op " Display ", vervolgens " achtergrond ", en selecteer " White ". De als afbeelding wilt opslaan, gaat u naar " bestand " en " afbeelding opslaan als " en selecteer de bestandsindeling " png ".
- Verslag van de resultaten en reactieve epitopes toewijzen aan de bijbehorende allelen.
- Vergelijk array resultaten aan de resultaten van de single-antigeen kralen (GAB), indien beschikbaar.
Opmerking: De SAB test met behulp van één allèlique antigenen meet antistof reactiviteit naar een vaste panel van HLA-eiwitten. Individuele peptiden die Toon antistof reactiviteit behoren tot bepaalde HLA-allelen waarmee, als ook opgenomen in het deelvenster SAB directe vergelijking tussen de matrix en de resultaten van de gewijzigde en aanvullende begroting. Onze vorige studie 17 toonde een hoog beschermingsniveau van de correlatie tussen de resultaten, wat erop wijst dat de peptide epitopes aanzienlijk tot de algemene reactiviteit van SAB. bijdragen Bovendien, onthullen de resultaten van de matrix ook aminozuur-niveaus van specificiteit.- Verkrijgen SAB voortvloeit uit een HLA-lab die vindt u informatie over de vraag of en welke donor allelen zijn reactieve na transplantatie sera van de patiënt. Resultaten uit stap 5.5. op basis van de matrix analyse bieden ook informatie over overeenkomstige donor allelen positief voor alloantibody reactiviteit.
- Vergelijken SAB en matrix resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de oorspronkelijke studie met behulp van de array screening methode17, ingeschreven we een totaal van 5 nier-transplantatie onderwerpen. Wij verkregen het HLA te typen van de resultaten van onze cohort en van hun respectieve donoren. Hun medische geschiedenis en allèlique antilichamen titers van SAB tests waren ook beschikbaar voor ons. In onze pilot-studie van deze 5 patiënten, wij twee verschillende methoden bedacht: een standaard serie bestaat uit een vaste panel van peptiden en gepersonaliseerde arrays die aangepaste waren gemaakt voor elk paar van donor en ontvanger. Terwijl de eerste methode hadden konden we de prestaties van het platform van de matrix in het bereiken van hoge niveaus van specificiteit in individuele transplantaties technisch te valideren, wordt de gepersonaliseerde protocol voor deze laatste methode beschreven in dit artikel en video bestemd voor uitgebreide screening van donor-specifieke antilichamen (DSA), die vaak met slechte graft resultaten5,25,26correleren.
De gepersonaliseerde arrays waren toegepast op twee van de vijf gevallen17, en voor het illustreren van de algemene workflow van de methode, hier richten we ons op een van deze twee patiënten (namelijk PTN #4). De belangrijkste technologie voor het maken van aangepaste peptide matrix omvat de SPOT synthesizer. Het is een volledig geautomatiseerde robot systeem dat maakt peptiden met behulp van Fmoc synthese rechtstreeks op een speciaal afgeleide cellulaire matrix op een membraan (Figuur 1). Wij misbruikt de flexibiliteit van de synthesizer te monteren van grote sets van peptiden afgeleid van individuele orgaandonoren HLA sequenties. Om voldoende dekking te voorkomen wanneer een continue epitope worden "gesplitst wordt" en antistof reactiviteit verliest, gevolgd wij een "walking" ontwerp van seriële peptides te hebben 15-4 = 11 residuen van overlap tussen de onmiddellijk aangrenzende peptides, zo dat de serie altijd voldoende voor de typische lengte van antilichaam epitopes wordt geschat op 4-9 aa in lengte (Figuur 1).
De sjabloon HLA sequenties werden direct gedownload uit de repository-database gehandhaafd op EMBL-EBI (de Europese Bioinformatica Instituut). Als voorbeeld, PTN #4 de donor is HLA-DQB1 * 03:01:01:01-allel was zocht (webpagina afbeelding in Figuur 2). In combinatie, downloadden wij afzonderlijk reeksen van de donor tweede HLA-DQB1-allel van * 02: 01:01, evenals die van PTN #4 zelf, HLA-DQB1 * 04:02 en * 05:01. Meerdere sequentie alignering werd vervolgens uitgevoerd met behulp van Clustal Omega webfunctionaliteit (Figuur 3). Het resulterende bestand uitlijning is (Figuur 4), verkregen uit die alle niet-overeenkomende aminozuurresidu's werden geïdentificeerd (donor residuen zijn gemarkeerd). Vervolgens hebben we gevierd sjabloon sequenties (onderstreept) van de donor die waren lang genoeg ter dekking van alle zijn niet-overeenkomende residuen. Gebaseerd op deze sjabloon sequenties en na een "walking" ontwerp zoals hierboven beschreven, drie series van peptiden elke 15 aa in lengte zijn afgeleid voor HLA-DQB1. Dit proces werd herhaald met de rest van de donor allelen van HLA-A, B, C, DQA1 en DRB1 (DRA1 en DP werden uitgesloten als gevolg van onbeschikbaarheid van de pertinente klinische record) in vergelijking met de overeenkomstige allelen van zijn ontvanger. Aan het einde, een totaal van 202 peptiden werden ingeroepen voor het maken van de array (Peptide reeksen in een werkblad in Figuur 5 en een illustratie van de matrix in Figuur 6) specifiek voor indringende PTN #4 's na transplantatie serum, en vergeleken de resultaten met die verkregen naar een latere reprobing van zijn pre transplantatie serum (Figuur 7). Uit de 202 peptides, een totaal van 10 toonde antilichaam signalen gekoppeld het specimen na transplantatie van die residuen van de donor-specifieke (mismatch van de ontvanger) E87, I306, W243 en K197 van HLA-B * 52:01, -B * 52:01, -C * 03:04 en -DQA1 * 05:01 leek te zijn betrokken bij het aanzetten tot antistof reactiviteit (residuen aangeduid in rode letters in Figuur 7).
Daarnaast is een van de belangrijkste voordelen van de methode van de matrix ten opzichte van de traditionele SAB test dat epitoop informatie gemakkelijk kan worden verkregen, zoals weergegeven in Figuur 7. We vergeleken de antilichaam-reactieve epitopes op HLA-DQA1 en -DQB1 van alle vijf patiënten (uit aparte matrix resultaten in Liu et al. 17) doordat ze allemaal gemodelleerd naar een co kristalstructuur van DQA1 en DQB1 heterodimer (Figuur 8). Bemoedigend is dat is een prominente segment van de structuur die bekend staat als het β1-onderdeel een "hotspot", die een veel hogere kans (3/5 in patiënten 2,3,5) worden gericht op de alloantibodies onder de transplantatie onderwerpen in de 5 case cohort had.
Figuur 1 . De algemene regeling van HLA gebaseerde antigeen matrix methode voor het opsporen van anti-donor HLA alloantibodies orgel geadresseerden. (Aangepast en gewijzigd van Liu et al. 17) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Gegevens opslagplaats website
Om op te halen van HLA sequenties, bezoek de volgende website: http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html
Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Meerdere proteïne sequenties uitlijning van donor vs. ontvangende HLA-DQB1 allelen Clustal Omega web gebaseerde hulpprogramma.
Kopiëren en plakken van sequenties van patiënt #4(PTN#4) DQB1 * 0201 en 03:01, en van de donor DQB1 * 04:02 en 05:01 in FASTA indeling in http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (ter illustratie, DQB1 * 05:01 van PTN #4 en DQB1 * 03:01 van de donor worden weergegeven in het invoervak) . Selecteer de optie "Clustal w / nummers" in "Stap 2" voor de outputformaat en uitlijning uitvoeren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Vergelijking vandonor vs. patiënt/ontvanger HLA DQB1 en selectie van sjabloon sequenties voor peptide synthese.
Van de donor sequenties zijn vet, met donor-specifieke incongruenties in rood lettertype en ook gemarkeerd met zwarte dozen. Sjabloon sequenties (onderstreept) voor het afleiden van peptiden bevatten deze donor-specifieke residuen. (Dit cijfer werd aangepast en gewijzigd van Liuet al. 17) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Een illustratief voorbeeld van het hoofdwerkblad in een werkblad van donor HLA peptiden.
Peptide positie op de matrix wordt aangegeven door rij vs. kolom coördinaten. Peptide reeksen worden gebruikt om synthese met behulp van robotic SPOT synthesizer program. Donor-specifieke residuen (mismatch van de geadresseerde overeenkomstige allelen) worden onderstreept en gemarkeerd in vet. De begin- en eindposities van de peptide overeenkomt met volledige lengte HLA-DQB1 sequenties zijn ook aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . Afbeelding van een matrix-sectie gekleurd met Ponceau S
Opmerking ongelijkheid in kleurintensiteit vanwege verschil in aminozuursamenstelling onder peptides, hoewel peptide concentraties onder plek overal hetzelfde zijn. (Het beeld is een illustratief voorbeeld, niet de ene dit eigenlijke onderzoek.) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 . Donor-specifieke HLA-A, B, C, DQ, DR matrix studie van niet-overeenkomende epitopes in PTN #4.
Seriële peptiden waren afgeleid van de sequenties van de donor ter dekking van de niet-overeenkomende residuen (een voorbeeld van DQB1 in Figuur 4). De matrix werd gebruikt om de sonde van het serum na transplantatie (lagere vlek: post-TX) en vervolgens de pre transplantatie serum (bovenste vlek: pre-TX) uit de dezelfde patiënt. De vier sets van sterke spots uit na transplantatie sonderen zijn gemarkeerd door rode lijnen (in de lagere vlek), terwijl twee middelgrote intensiteit plekken die werden alleen geassocieerd met vooraf transplantatie serum zijn gemarkeerd door blauwe lijnen (in de bovenste vlek). De onderste tabel de overeenkomstige peptide reeksen en hun reactiviteit aan het serum na transplantatie. Donor-specifieke (niet-overeenkomende) residuen E87, I306, W243 en K197 van hun respectieve allelen zijn in rode letters en peptiden tonen sterke antistof reactiviteit in vette lettertypen. Dit cijfer werd aangepast en gewijzigd van Liu et al. 17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8 . Structurele locaties van HLA-DQ epitopes.
Co kristalstructuur van HLA-DQ8 werd gebruikt als een sjabloon. De structuur bestond uit een DQA1 en een DQB1 subeenheden samen met een antigeen-peptide (A). Eiwit secundaire structuur van de α-helices en β-strengen worden weergegeven in het deelvenster (B). DQA1 en DQB1 peptiden die met een van de vijf serum reageerde werden gevestigd op de co kristalstructuur (in A en b: in blauw grijs weergegeven). Drie β-strengen, β1 β6 en β12 (donkerblauw in B), elk vertegenwoordigd door meerdere peptiden (korte rode lijnen overeenkomt met de lineaire aa standpunten van DQA1), reageerde met meerdere patiënten monsters (oorspronkelijke resultaten in Liu et al. 17). alle zes DQB1 peptiden (in een vet lettertype) reactieve aan antilichamen bij patiënten #2, #3, #5 bevinden zich aan het β1 "hotspot"-segment (in B: aangegeven door de rode pijl). Dit cijfer werd aangepast van Liu et al. 17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het ontwerp van de SPOT-matrix die hier beschreven is voor experimentele studie van alloantibody specificiteit in transplantatie tegen van de donor van een orgel HLA antigenen. In tegenstelling tot de bestaande SAB assay veel toegepast in de kliniek, heeft de antigeen matrix methode een groot voordeel in het flexibele ontwerp die geschikt is voor de ware HLA-sequenties van de afzonderlijke donor. Het nieuwe platform maakt gebruik van het potentieel van de snel oprukkende DNA sequencing technologie die binnenkort in staat zijn zal om te produceren nauwkeurige HLA allèlique reeks lezingen zonder dubbelzinnigheid16,27 en het potentieel van de aangewezen databanken voor repository sequenties HLA15 in de wereldbevolking. Onze huidige matrix-screening-protocol werd ontwikkeld op basis van het succes van verschillende pilotstudies van transplantatie sera. Hier moeten we benadrukken dat in dit stadium onze prototype-arrays zijn opgebouwd alleen voor gebruik in onderzoek, niet voor diagnostische toepassingen in de klinische praktijk.
Een andere opmerkelijke onderscheid tussen SAB en onze antigeen-array is dat de laatste een hogere resolutie heeft te onderscheiden van potentiële antigeen epitopes binnen de 15 aa segmenten van HLA sequenties, die kunnen waardevolle informatie om alloantigenicity18 bieden . Echter, in tegenstelling tot SAB die presenteert hele eiwit antigenen om te passen hun gevouwen structuren, bevat de antigeen-matrix alleen korte peptides, uitsluit die informatie over conformationele vouwen. Dus, de arrays kunnen niet de opsporing van antilichamen die alleen conformationele epitopes herkennen, die sommigen geloven dat een meerderheid van alle functionele epitopes relevante antilichaam gemedieerde afwijzing28,29vormen. Toch, in andere contexten, antilichaam acties tegen lineaire epitopes, zoals die in korte peptides, worden uitgebuit in virusantigeen reacties en in vaccin ontwerpen30,31. We zouden ook moeten opmerken dat in het beperkte aantal patiënten geteste monsters, de detectie gevoeligheid prestaties van onze matrix met SAB overschreden en de opsporing van donor-specifieke antistoffen eerder17 toegestaan tijdens de klinische voortgang van antilichaam-gemedieerde afwijzing. Dit is te wijten aan de hoge Molaire concentratie van lokale antigeen peptiden op de matrix ten opzichte van de SAB. Deze functie is bijzonder nuttig in gevallen wanneer SAB gedetecteerd geen reactiviteit terwijl klinische en pathologische bewijs van antilichaam-gemedieerde afwijzing duidelijk, was zoals wij eerder17 toonde. Het is echter belangrijk erop te wijzen dat deze gepersonaliseerde test meer tijd dan de standaardtest GAB kost. De matrix-test vereist het orgel van donor en (voorgestelde) geadresseerde HLA-sequenties te verkrijgen voordat het ontwerp van antigeen peptiden. Het duurt dan enkele dagen voor de productie van de array en nog eens 7-8 uur om antilichamen resultaten te verkrijgen. Dus, de lange procedure is niet geschikt voor overleden donor transplantatie, tenzij het hoofddoel van het antilichaam test voor het bepalen van de opkomst van donor-specifieke antilichamen na transplantatie, in plaats van voor de evaluatie vooraf transplantatie van bestaande antilichamen.
De matrix methode had een belangrijke verbetering van de bestaande SAB-test bij de opsporing van antigeen epitopes. Bovendien, we een poging gedaan te reactief epitopes in vijf transplantatie patiënten toewijzen aan een structuur van de sjabloon van HLA-DQ, waarin we nota genomen van ten minste één prominente "hotspot" epitoop in het β1-onderdeel dat vond plaats in drie van de vijf patiënten-17. Intrigerend, bevinden het β1-strengen van HLA-DQA1 en -DQB1 zich in de groef van de antigeen-presentatie concaaf (Figuur 8), een locatie bekend te zijn in het kader van de transplantatie afwijzing32antigene. Wij verwachten daarom dat de toekomstige verkenning van onze gepersonaliseerde antigeen matrix methode in uitgebreide transplantatie cohortstudies waardevolle inzichten op antigene hotspots in HLA-moleculen zal opleveren. Een catalogus van deze geïdentificeerde hotspots, als in combinatie met de zeer nauwkeurige DNA sequencing typering van HLA-genen tussen aspirant-donors en ontvangers, zal uiteindelijk helpen pre transplantatie besluiten via aanvaardbaar mismatch programma 's 33, bedoeld om meer effectief te voorkomen dat bepaalde incongruenties in de omgeving van geclassificeerd hotspots.
Kortom was onze oorspronkelijke studie17 in het verkennen van het persoonlijke ontwerp van een antigeen-matrix voor detectie van specifieke anti-HLA alloantibodies de eerste in zijn soort. De focus van de studie was over de haalbaarheid van matrix ontwerp en de implementatie, die als een prototype voor potentiële technologie van de toekomst diende. Onze pilot-studie niet alleen gegenereerd bemoedigende resultaten van klinische monsters, maar ook konden we schatten van de totale kosten en snelheid van de test. De productiekosten van een gepersonaliseerde array in onze huidige laboratorium instelling bedraagt minder dan 1.000 dollar, dat een eenmalige kosten is want de matrix kan vervolgens worden gebruikt in de tijd in maximaal 20 ronden van reprobing cycli zonder verlies van prestaties. Het is mogelijk dat aanvullende tests van het protocol van de matrix met een bredere cohort van transplantatie onderwerpen zal verder te stroomlijnen de methode die een dag worden in de klinische praktijk gebruikt kan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Drs. Shawn Li en Xing Li van Western University in Canada voor hun vriendelijke hulp met SPOT array productie. Wij zijn dankbaar aan de personeelsleden in de kern van de comptabiliteit, aan de uitgebreide transplantatie centrum van Noordwestelijke Universiteit voor de dienstverlening van de steekproef. Dit werk is deels ondersteund door de Auxiliary Board van de Northwestern Memorial Hospital, en door een faculteit opstarten Fonds geboden door Northwestern University aan J.J..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| Non-fat milk | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| Goat anti-human IgG–HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc gel imaging system | Bio Rad Laboratories | 1708265 |
References
- Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. , (2017).
- Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD--the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
- Tait, B. D. Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 21 (5), 573-577 (2009).
- Tait, B. D. Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients - Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay. Front Immunol. 7, 570 (2016).
- Gebel, H. M., Bray, R. A. HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great? Am J Transplant. 14 (9), 1964-1975 (2014).
- Horton, R., et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 5 (12), 889-899 (2004).
- Duquesnoy, R. J. HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm. Hum Immunol. 63 (5), 339-352 (2002).
- Duquesnoy, R. J., Marrari, M. HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies. Curr Opin Organ Transplant. 14 (4), 403-409 (2009).
- Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. Chronic allograft rejection: a fresh look. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 13-20 (2015).
- Rostaing, L. P., Malvezzi, P.
- Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant. 3 (12), 1488-1500 (2003).
- Haas, M. An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts. Curr Opin Organ Transplant. 19 (3), 315-322 (2014).
- Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem? Am J Transplant. 15 (4), 855-856 (2015).
- Tambur, A. R., Claas, F. H. HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about? Am J Transplant. 15 (5), 1148-1154 (2015).
- Robinson, J., et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).
- Gabriel, C., et al. HLA typing by next-generation sequencing - getting closer to reality. Tissue Antigens. 83 (2), 65-75 (2014).
- Liu, P., et al. A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays. Transplant Direct. 2 (11), (2016).
- Frank, R., Overwin, H. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays. J Vis Exp. (93), (2014).
- Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
- McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes. Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).
- Kaczmarek, I., et al. Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant. Exp Clin Transplant. 6 (3), 229-235 (2008).
- Claas, F. H. Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies. Curr Opin Organ Transplant. 15 (4), 462-466 (2010).
- Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods. Hum Immunol. 77 (4), 313-316 (2016).
- Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M.
- Duquesnoy, R. J. Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity. Curr Opin Organ Transplant. 19 (4), 428-435 (2014).
- Lavinder, J. J., et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2259-2264 (2014).
- Kloetzel, P. M.
- Filippone, E. J., Farber, J. L. The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies. J Immunol Res. 2016, 5197396 (2016).
- Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome. Transplantation. 78 (2), 190-193 (2004).
