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Biochemistry

Personalizzato Peptide matrici per il rilevamento di anticorpi HLA nei trapianti d'organo

doi: 10.3791/56278 Published: September 6, 2017

Summary

Mancate corrispondenze nelle sequenze (HLA) l'antigene umano del leucocita tra donatore di organi e destinatario coppie sono la principale causa di rigetto anticorpo-mediato nel trapianto dell'organo. Qui presentiamo l'uso di matrici di antigene personalizzati che si basano su sequenze di singoli donatori HLA per sondare gli alloanticorpi di anti-donatori HLA nei destinatari dell'organo.

Abstract

Nei trapianti d'organo, la funzione e la longevità dell'innesto criticamente si basano sul successo del controllo della reattività di rigetto immunologico contro gli antigeni umani del leucocita (HLA). Istocompatibilità linee guida sono basate su prove di laboratorio di immunità anti-HLA, che presenta sia come pre-esistente o de novo generato anticorpi HLA che costituiscono una barriera importante trapianto. Prove correnti sono costruiti su una piattaforma di singolo-antigene Perline (SAB) utilizzando un insieme fisso di ~ 100 antigeni ricombinanti preselezionati per sondare sieri di trapianto. Tuttavia, negli esseri umani esiste una maggiore varietà di tipi di HLA, con nessun due individui diversi da gemelli identici che possono condividere la stessa combinazione di sequenze di HLA. Mentre avanzate tecnologie per la tipizzazione HLA e sequenziamento diretto precisamente è in grado di catturare qualsiasi mancata corrispondenza nella sequenza di DNA tra un donatore e HLA del destinatario, il dosaggio di SAB, a causa della sua limitata varietà nella rappresentazione di sequenza, è in grado di rilevare con precisione gli alloanticorpi specificamente contro il donatore HLA mismatches. Abbiamo cercato di sviluppare un metodo complementare, utilizzando una tecnologia diversa per rilevare e caratterizzare gli anticorpi HLA anti-donatori su base personalizzata. Lo strumento di screening è una matrice su ordinazione del peptide donatore HLA-derivato di sequenze di per sondaggio post-trapianto sieri del destinatario dell'organo per valutare il rischio di rigetto anticorpo-mediato. Su un singolo array per una coppia donatore-ricevente, fino a 600 unici peptidi sono realizzati sulla base sequenze di proteine HLA del donatore, ogni peptide portando almeno un residuo non corrispondente in una sequenza 15-amino acida. Nei nostri esperimenti pilota per confrontare modelli di antigene per sieri pre- e post-trapianto su queste matrici, siamo stati in grado di rilevare i segnali anti-HLA con la risoluzione che ci ha permesso di individuare gli epitopi immuni coinvolti. Questi personalizzato antigene array permettono il rilevamento ad alta risoluzione degli epitopi HLA del donatore-specific nel trapianto dell'organo.

Introduction

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Terapia del rimontaggio dell'organo che ordinariamente viene condotta in tutto il mondo ha salvato milioni di vite. Trapianto di organo solido si verifica in circa 100 pazienti per milione di persone negli Stati Uniti ogni anno, mentre un numero maggiore sono ancora su liste d'attesa per ricevere i donatori di organi a causa di una grave carenza di approvvigionamento (secondo le informazioni fornite dall'organo Appalti e rete di trapianto - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Trapianto d'organo è altamente regolamentato al fine di ridurre gli sprechi di organo e salvare vite umane, ma gli strumenti scientifici utilizzati per informare questi regolamenti sono limitati in efficacia. Per esempio, la comunità scientifica riconosce pienamente gli Stati altamente polimorfici di molecole HLA e accurati test genetici del DNA mediante battitura a macchina ad alta risoluzione e basato su sequenze digitando (SBT) sono state sviluppate in anni recenti1, 2. Tuttavia, i metodi di collaudo alloanticorpo non sono ancora stati in grado di produrre la vasta gamma di singole sequenze HLA come sonde di antigene. Il test standard al giorno d'oggi utilizza un pannello invariabile di ~ 100 antigeni allelico che sono costituiti da comuni varianti di HLA, A, B, C, DQ, DP e DR sequenze in popolazioni umane3,4,5,6. Frequentemente, sequenze di HLA del donatore effettivo non sono inclusi nel pannello test, costringendo trapianto di medici e chirurghi di dedurre la reattività di donatore-specific sulla base di somiglianze condivise tra donatore effettive sequenze e corrispondenti "standard" nella test kit7,8. Di conseguenza, a volte è difficile fare una stima affidabile del rischio di rifiuto basato su anticorpo prova Risultati9,10,11,12. Di conseguenza, nuove personalmente test personalizzabili per gli alloanticorpi sono urgentemente necessari13,14.

I geni HLA codificano per i recettori (MHC) del complessi maggiore di istocompatibilità hanno una funzione chiave nella risposta immunitaria6. Geni HLA sono conosciuti per essere i più polimorfici geni del genoma umano6. A causa della rapidi progressi nel DNA sequencing strategie per i geni HLA, nuove varianti alleliche (o semplicemente indicati come alleli) vengono scoperti in un esplosivo tasso15,16. Entro il marzo 2017, 16.755 convalidati alleli erano stati depositati al Database IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), di cui 12.351 erano di classe I e 4.404 erano dei gruppi II classe. In netto contrasto, solo poco più di 100 alleli distinti sono rappresentati nel test standard single-antigene Perline (SAB), che è usato ordinariamente per rilevare gli alloanticorpi nel trapianto dell'organo. Il metodo di RFA è costruito su una piattaforma Luminex mediante citometria a flusso. Poiché il test utilizza un set di invariabile di antigeni, a parte minore variabilità di lotti in produzione, la prova di antisiero può essere standardizzata robustamente tra individui e tra laboratori5. Tuttavia, questo test è in grado di catturare tutti gli alloanticorpi sviluppati specificamente contro gli alleli dei donatori, in particolare quando le sequenze del donatore sono assenti dal SAB set. Anche se la produzione personalizzata di antigeni dei donatori basato su sequenze veri sono desiderabili, restano sfide tecniche in procedure di collaudo e di razionalizzare la produzione necessaria.

Recentemente abbiamo descritto una metodologia alternativa in uno studio di fattibilità del trapianto renale soggetti17. Il metodo utilizzato gli antigeni peptidici in un formato di matrice per il sondaggio pre- e post-trapianto sieri di soggetti individuali. Ogni matrice è stato personalizzato costruito utilizzando il punto sintesi metodo18,19,20,21,22,23 che produce antigeni peptidici, ogni 15 amminoacidi di lunghezza, interamente basato su alleli HLA del donatore dell'organo rispettivo di A, B, C, DQA1, DQB1 e DRB1. Sintesi SPOT sono operato su una membrana di cellulosa con standard Fmoc-chimica22 e possono produrre centinaia di peptidi personalizzati in parallelo con un sistema completamente automatizzato robot19,21. La matrice di membrana possa sopportare vari cicli di spogliatura e reprobing cicli. Nel nostro studio retrospettivo17, abbiamo rilevato i cambiamenti nei modelli di antigene con antisieri stored trapianto raccolti in una serie di tempo (cioè, prima e dopo il trapianto). Qui descriviamo il protocollo tecnico per il flusso di lavoro tra cui progettazione, produzione, analisi di sondare e risultato di antisiero. Il metodo è destinato per il rilevamento di alloanticorpi contro epitopi specifici lineari su molecole HLA dei donatori del trapianto.

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Protocol

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Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla Northwestern University Institutional Review Board (IRB protocollo #: STU00104680). Un flusso di lavoro complessivo del protocollo è illustrato nella Figura 1.

1. analisi bioinformatica di donatore e destinatario HLA sequenze

  1. recuperare sequenze dal database di IMGT/HLA 15.
    1. Il report tipizzazione HLA di ottenere sia il donatore dell'organo e il suo destinatario.
      Nota: Garantire procedure adeguate per proteggere cartelle cliniche riservate sono utilizzate. In genere, è necessaria per le linee guida istituzionali IRB un'approvazione Institutional Review Board (IRB) di protocollo di studio o di prova sperimentale. Se rapporti di HLA sono stati da PCR-basata digitando (di alta o bassa risoluzione) o basati su sequenziamento digitando (SBT), passare direttamente al punto 1.1.3. Se le sequenze sono state ottenute dal sequenziamento genomico/HLA e se sono completi, utilizzare queste sequenze direttamente invece. Occasionalmente, quando digitando solo incomplete o sequenziamento risultati sono disponibili, seguire il passaggio aggiuntivo 1.1.2. per assegnare il " mancante " alleli tramite lo strumento di web descritto al punto 1.1.2.
    2. Apri le combinazioni ambigue Allele seguendo web link - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html e la ricerca utilizzando il “ ambiguo strumento di ricerca di combinazioni di Allele ” funzione per recuperare gli alleli ipotetici. Quindi, passare al punto 1.1.3. per immettere il nome di allele.
    3. Aprire il modulo di Query IMGT/HLA Allele al seguente il link web - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html e l'oggetto input ’ nomi di allele s (ognuna individualmente, come mostrato nella Figura 2) nella “ ricerca per ” casella. Fare clic sul “ ricerca di alleli ora ” pulsante. Nomi di allele HLA devono utilizzare sistemi di denominazione standard (cioè, A *, A * 01, A * 01:01:01:01 e qualsiasi precedente delle denominazioni come A * 01010101).
    4. Trovare il nome di allele corrispondente sullo schermo. Fare clic sul pulsante allele.
    5. Copia il " sequenza della proteina " e incollarlo in un documento di testo sotto una riga di intestazione di " > nome di allele ". Efficacemente, il documento è in formato FASTA (FAST-All) del nome di allele e sequenza.
  2. Eseguire geniche multiple allineamenti degli alleli del donatore e del destinatario/paziente.
    1. Uno gene (cioè, DQB1 * 03:01:01:01) alla volta, copiare e incollare tutti i quattro alleli delle sequenze FASTA donatore e paziente (due dal donatore) e due dal paziente in un documento di testo combinato. A questo punto, è importante denotare differenzialmente nomi allele donatore da nomi paziente allele (opzioni includono l'uso differenziale di superiore vs minuscole; o creare un'estensione di prefisso o suffisso distintiva per ogni nome di allele per contrassegnare separatamente donatore vs. pazienti alleli). L'ordine di ingresso delle sequenze non è importante, perché seguendo l'ordine sarà mescolata secondo i livelli di somiglianza tra qualsiasi coppia di sequenze di allineamento.
    2. Copia e incolla le sequenze in FASTA formattare (come visto nella Figura 3) dall'alto nella “ immettere le sequenze di input ” casella sito Web Cluster Omega: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
    3. Fare clic su " inviare il lavoro alla " utilizzando le impostazioni standard dei parametri: come " PROTEINŔ e " Clustal w / numeri ". Eseguire l'allineamento cliccando su " invia ". Un allineamento delle sequenze di quattro viene visualizzato sullo schermo ( Figura 4).
  3. Mark donatore-specific disadattamento.
    Nota: Si dovrebbe essere appositamente notato che le sequenze alleliche date qui erano basate sui risultati della tipizzazione HLA, non sequenziali. Di conseguenza, c'è un rischio che può essere mancata variazione di sequenza rilevante nella coppia donatore-destinatario particolare. Questo potenziale problema sarà mitigato come più e più centri trapianto adottano precise digitando ad alta risoluzione e DNA sequenziamento diretto.
    1. Copia e incolla il testo di allineamento in un documento di testo e creare un nuovo documento. Se il formato del file allineato è disturbato, correggere il formato modificando stile e dimensione: utilizzare sempre " Courier New " carattere in tipo di piccole dimensioni per adattare le righe. Salva il documento dopo i problemi di formattazione sono risolti.
    2. Controllare manualmente le sequenze allineate per identificare tutti i residui non corrispondenti che appartengono unicamente al donatore. Contrassegnare ciascuna di questi residui di donatore-specific utilizzando un colore di carattere distintivo.
    3. Sottolineare tutte le lettere nel donatore ' s sequenze che estendere 14 residui entrambi up - e a valle del disadattamento di donatore-specific contrassegnato (calcolato come 15 dell'amminoacido del peptide meno 1 residuo della mancata corrispondenza).
  4. Derivare sequenze peptidiche 15-mer una serie sovrapposte.
    Nota: La ragione per la scelta di peptidi 15-mer era basata sulla conoscenza generale degli epitopi tipici essendo 4-9 amminoacidi di lunghezza. Di conseguenza, quando abbiamo applicato un " finestra mobile " procedura con un passo di 4 aminoacidi ( Figura 1), la nostra selezione di una lunghezza di 15 aminoacidi lasciato un 15-4 = 11 aminoacido sovrapposizione tra qualsiasi peptidi vicini in una serie. In teoria, questa sovrapposizione di 11 dell'amminoacido è sufficiente a coprire tutti gli epitopi immuni di fino a 9 amminoacidi di lunghezza, affinché nessun epitopo sia inavvertitamente " dividere " a metà con solo sequenze parziali sulla matrice.
    1. Utilizzare le sequenze sottolineate come modelli per derivare in sequenza breve 15 sequenze di aminoacidi in una serie che si sovrappongono di 4 residui tra qualsiasi due sequenze immediatamente adiacenti della serie.
    2. Copia e incolla questi 15 sequenze dell'amminoacido in un foglio di calcolo ( Figura 5) in un formato di colonna accompagnati da colonne di notazione che includono i nomi corrispondenti degli alleli dei donatori. Un'ulteriore colonna per includere posizioni aa residuo può essere utile.
  5. Ripetere i passaggi da 1.1.3. 1.3. per ogni allele HLA (cioè, A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 e DP) del donatore e la coppia di destinatario per derivare le 15 sequenze aa breve del donatore.
  6. Copia e incollare tutte le colonne in un foglio di lavoro master per creare una colonna lunga e continua di tutte le sequenze aa 15 da tutti gli alleli del donatore. Annotare il numero totale di righe del documento (per le sequenze peptidiche).

2. Progettazione del Layout di matrice Custom e produzione

chiamate
  1. genera un foglio di calcolo di sequenze peptidiche con allele corrispondente. La matrice ha 20 righe e 30 colonne e può contenere fino a 20 x 30 = 600 punti per i peptidi. A seconda del numero totale dei peptidi registrato nel passaggio 1.5 da un donatore particolare e basato la nostra esperienza passata con due esempi che avevamo provato a Liu et al. 17, 600 posto matrice può contenere tutte le sequenze generate da ~ 2 casi di trapianto separati.
    1. Piano razionale e di piùfficace modo per montare i set dei peptidi all'interno del formato 600-punto della matrice.
    2. Se più di un soggetto può andare bene in una matrice di intera, inserire righe vuote dopo il primo donatore ' sequenze di s in base al numero totale di righe che può essere diviso per 30 (il numero di punti in una riga sulla matrice).
    3. Subito dopo l'ultima riga vuota per il primo set di sequenze, incollare l'intera colonna di contenuto della sequenza dal secondo caso di trapianto.
    4. Ripetere questi passaggi fino a quando la matrice viene riempita e non più casi possono essere aggiunti senza superare i 600 punti. Se intere righe vuote vengono lasciate per riempire nella parte inferiore, " spostare " la riga vuota per essere posizionato tra i set di due donatori. Questo ampio spazio lasciato tra i casi rende il taglio della membrana dopo il completamento della sintesi più facile - seguendo passo 3.2. qui di seguito.
  2. Programmare le sequenze peptidiche nel contesto del layout di matrice. Il programma del sintetizzatore SPOT richiede un formato di testo delle sequenze (sequenza di un peptide di una riga), che può essere ottenuto direttamente tramite il salvataggio del foglio di calcolo risultante dal passo 2.1.4 come un documento di testo semplice (senza le colonne supplementari per i nomi di allele, aa posizioni ecc.).
  3. Esecuzione automatizzata del peptide matrice sintesi via il sintetizzatore SPOT. L'intera operazione di sintesi è dettagliata in Marica et al. 21. Si noti che Fmoc sintesi di due matrici richiede ~ 4-5 giorni.

3. Sonda e antisieri Reprobe da una serie temporale di un individuo destinatario del trapianto.

Nota: la matrice della membrana 600-spot ha le dimensioni ~ 7 cm x 13 cm. Dopo la sintesi, le matrici possono essere conservate a temperatura come membrane asciutte per almeno due anni, quando al riparo da luce diretta. Evitare di piegare eccessivo della membrana per preservare la longevità per uso ripetuto.

  1. Reidratare la matrice di membrana con etanolo e Visualizza imperfezioni del peptide macchiati con Ponceau S. Matrice
    1. reidratare la membrana che trasportano i peptidi seguendo una procedura graduale ottimizzata in Li et al. 24.
      1. immergere la membrana di matrice in 20 mL di etanolo al 100%.
      2. Aggiungere 20 mL di acqua distillata acqua per diluire la soluzione di etanolo al 50% e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
      3. Modificare la soluzione di immersione in 40 mL di acqua 100% tre volte e incubare per 15 minuti ogni volta.
      4. Lavare in un buffer di lavoro corretto, ad esempio, 20 mL di TBST (soluzione fisiologica tamponata con 0,1%), tre volte per 5 minuti ciascuno.
    2. Ponceau S colorazione della matrice per visualizzare i peptidi sintetici
      1. aggiungere 20 mL della soluzione di Ponceau S pre-formulato direttamente alla matrice idratata ed incubare per 30 ~ s con agitazione.
      2. Run distillata acqua continuamente sopra la membrana a-macchia Ponceau S colore di sfondo. Durante il processo, peptide macchie di colore rosso possono diventano visibili.
      3. Separare le porzioni della matrice per ciascun donatore tagliando con attenzione tra le sezioni della matrice per i singoli casi. Contrassegnare l'orientamento di ciascun array.
  2. Matrice pre-block.
    1. Blocco la membrana in 20 mL di 5% senza grassi del latte dissolto nel buffer di TBST. Questa soluzione basata su latte ulteriormente de-macchierà Ponceau S colore. Sostituire il buffer di latte più volte al fine di ottenere immagini più chiare di peptide.
    2. Per scopi di record-keeping, scattare una foto dell'immagine Ponceau S della matrice utilizzando una macchina a mano (esempio in Figura 6).
    3. Continuare il blocco della membrana in 5% senza grassi del latte a 4 ° C durante la notte o a temperatura ambiente per 2 h con dondolo.
  3. Matrice incubare con trapianto antisiero.
    Nota: Dovrebbe essere notato che un fenomeno noto come prozona o l'effetto del gancio può derivare da interferenze di complemento-dipendente nelle analisi degli anticorpi del siero. Per aggirare questo problema, può essere considerato un passo di pretrattamento del siero opzionale con EDTA o calore inattivazione dei campioni del siero.
    1. Rimuovere il tampone bloccante e lavare la membrana con 20 mL di TBST tre volte il giorno successivo per 5 minuti ogni volta.
    2. Aggiungere 20 µ l del siero grezzo del destinatario a 20 mL del 2,5% del latte nel buffer di TBST e incubare la membrana per 2-3 h a temperatura ambiente. Si noti che in questo giro iniziale del sondaggio, è consigliabile che l'ultimo post-trapianto siero (o probabilmente più sensibilizzato siero) nelle serie temporali in primo luogo viene utilizzato. Questo si basa sul presupposto che gli esemplari precedenti della serie, in particolare dai punti di tempo pre-trapianto, hanno meno varietà di alloanticorpi che tendono a sviluppare nel tempo. In questo modo, qualsiasi possibilità di interferenze di segnale da " riporto " tra turni di sondaggio può essere chiaramente distinto dalla reattività di alloanticorpo veramente sviluppato dovuto le risposte immunitarie contro l'innesto.
  4. Lavare la matrice utilizzando 20 mL di TBST e incubare con l'anticorpo secondario.
    1. Lavare la membrana tre volte per 10 minuti ogni volta.
    2. Incubazione con anticorpo secondario di capra anti-umano IgG-HRP (perossidasi di rafano) alla diluizione di 1: 10.000 nel buffer TBST completati con 1% di latte per un altro 2 h.
  5. Wash e sviluppare il blot.
    1. Lavare la membrana tre volte con TBST per 10 minuti ogni volta.
    2. Eseguire enhanced chemiluminescenza (ECL) uso 5 mL di soluzione di luminol fresco mescolato con 5 mL di soluzione di perossido per sviluppare la membrana (per 1 min).
    3. ECL visualizzare segnali utilizzando un imager adatto (cioè, ChemiDoc Imaging Systems o Azure C600).
  6. Analizzare e quantificare il blot.
    1. Salvare le immagini sviluppate ( Figura 7, immagine in basso) ed eseguire la quantificazione dell'intensità spot.

4. Confronta antisiero reattività in tutta una serie di tempo clinica.

  1. Striscia matrice.
    1. a questo punto, tenere la membrana bagnato a tutte le ore.
    2. Striscia la membrana incubando con 20 mL di tampone commerciale stripping a 37 ° C per 20 min e poi lavare la membrana con TBST tre volte per 10 minuti ciascuno. Quindi ripetere il blocco (passo 4.2) e sondaggio (punto 4.3) utilizzando un diverso siero del paziente preso in un punto diverso tempo.
  2. Blocco spogliato membrana.
    Nota: Dopo stripping, la membrana può essere riutilizzata per un altro giro di sondaggio di un siero diverso dallo stesso paziente in una serie temporale.
    1. Bloccare la membrana utilizzando 5% latte buffer come prima (Vedi punto 3.2).
  3. Reprobe un antisiero diverso dalla stessa serie di tempo (ripetere i passaggi da 3,3-3,6; esempio indicato in Figura 7, immagine in alto).
    Nota: La matrice spogliata quindi può essere utilizzata per reprobe un altro campione di siero. Poiché i peptidi sono coniugati covalentemente alla matrice di supporto della membrana, abbiamo mostrato che la matrice può essere riutilizzata per fino a 20 giri di stripping e reprobing cicli senza perdere la sua performance.
  4. Stoccaggio a lungo termine di matrici.
    1. Store la membrana in tampone TBS completati con 0,02% w/w sodio azide come conservante. Utilizzare un sacchetto di plastica per l'archiviazione a lungo termine. A 4 ° C sotto protezione dalla luce diretta, la membrana bagnata può essere conservata per almeno 2 anni.

5. Acquisizione dati e analisi

  1. Annotare manualmente i peptidi dell'antigene positivo.
    1. Individuare macchie mostrando segnali di anticorpo positivo e determinare ciascuna delle loro posizioni in griglia.
    2. Evidenziare le righe corrispondenti nel foglio di lavoro master per i peptidi positivi.
  2. Recuperare sequenze peptidiche elencati nel foglio di lavoro master ( Figura 7, elenco inferiore). Secondo il principio di progettazione descritto al punto 1.4.1., vicine macchie seriale condividono sequenze significativamente sovrapposti (15-4 = 11), pertanto gli epitopi reattivi possono essere condivise dai peptidi in una serie consecutiva.
    1. Evidenziare eventuali punti positivi che si verificano in successione.
  3. Determinare epitopo minima lunghezza per ogni peptide in una serie.
    1. Evidenziare eventuali sequenze di epitopo potenzialmente condivisa basate sulla sovrapposizione di segmenti di peptidi reattive.
  4. Modello strutturalmente antigene epitopi.
    1. Ottenere strutture cristalline di prototipo HLA da Protein Data Bank trovato al seguente link web: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
    2. Visualizzare il prototipo struttura HLA in Pymol (download da www.pymol.org).
    3. Mappa " o modello scoperto gli epitopi anti-donatori per le strutture 3D delle molecole HLA prototipo mettendo in evidenza le sequenze peptidiche reattiva ( Figura 8). Fare clic su " Display ", poi " sfondo " e selezionare " bianco ". Per salvare l'immagine, vai a " File " e " Salva immagine con nome " e selezionare il formato di file " png ".
  5. Riportare risultati e assegnare gli epitopi reattivi per gli alleli corrispondenti.
  6. Confronto matrice risultati ai risultati della singolo-antigene Perline (SAB), se disponibile.
    Nota: Il test SAB utilizzando antigeni allelico singoli misura la reattività dell'anticorpo verso un pannello fisso delle proteine HLA. Singoli peptidi che mostrano reattività dell'anticorpo appartengono a determinati alleli HLA che, se anche incluso nel pannello SAB, consentono un confronto diretto tra la matrice e i risultati SAB. Il nostro studio precedente 17 ha mostrato un alto livello di correlazione tra i risultati, suggerendo che gli epitopi peptidici contribuiscano in modo significativo la reattività complessiva del Sab. Inoltre, i risultati di matrice anche rivelano i livelli dell'aminoacido di specificità.
    1. Ottenere SAB risultati da un laboratorio HLA che fornisce informazioni su se e quali alleli del donatore sono reattivi a post-trapianto sieri del paziente. Risultati dal passaggio 5.5. Basato su una matrice analisi forniscono anche informazioni su corrispondenti alleli donatore positivi a reattività alloanticorpo.
    2. Risultati confrontare SAB e array.

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Representative Results

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Nello studio originale utilizzando la matrice di proiezione metodo17, abbiamo iscritto un totale di 5 soggetti di trapianto di rene. Abbiamo ottenuto i risultati del nostro gruppo e dei loro rispettivi donatori di tipizzazione di HLA. Loro storia medica e allelica anticorpali da SAB prove erano anche disponibili a noi. Nel nostro studio pilota di questi 5 pazienti, abbiamo messo a punto due diverse metodologie: una matrice standard composta da un pannello fisso di peptidi e matrici personalizzate che sono state personalizzate realizzati per ogni coppia di donatore e ricevente. Mentre il primo metodo aveva permesso di convalidare tecnicamente le prestazioni della piattaforma matrice nel raggiungimento di elevati livelli di specificità nei trapianti individuali, il protocollo personalizzato per quest'ultimo metodo è descritto in questo articolo e video destinati per la selezione completa di donatore-specific anticorpi (DSA), che spesso correlano con innesto poveri risultati5,25,26.

Le matrici personalizzate sono state applicate a due dei cinque casi17, e per illustrare il flusso di lavoro complessivo del metodo, qui ci concentriamo su uno di questi due pazienti (vale a dire PTN n. 4). La tecnologia chiave per rendere la matrice su ordinazione del peptide coinvolge il sintetizzatore SPOT. È un sistema completamente automatizzato e robotizzato che rende peptidi usando la sintesi Fmoc direttamente su una matrice cellulare appositamente derivata su una membrana (Figura 1). Abbiamo sfruttato la flessibilità del sintetizzatore per assemblare grandi insiemi di peptidi derivati da sequenze di singoli donatori HLA. Al fine di avere sufficiente copertura per evitare una situazione quando un epitopo continuo è essere "split" e perde la reattività dell'anticorpo, abbiamo seguito un design "a piedi" di peptidi seriale per avere 15-4 = 11 residui di sovrapposizione tra qualsiasi peptidi immediatamente adiacenti, così che la serie è sempre sufficiente a coprire la lunghezza tipica di anticorpo epitopi stimata in 4-9 aa in lunghezza (Figura 1).

Le sequenze HLA di modello sono state scaricate direttamente dal database del repository mantenuto a EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute). Ad esempio, donatore di PTN n. 4 di HLA-DQB1 * 03:01:01:01 allele era cercato (illustrazione di pagina Web nella Figura 2). Insieme, abbiamo scaricato separatamente sequenze per l'allele HLA-DQB1 seconda del donatore di * 02: 01:01, come pure quelli di PTN #4 stesso, HLA-DQB1 * 04:02 e * 05:01. Allineamento multiplo di sequenza è stata quindi eseguita utilizzando funzioni web di Clustal Omega (Figura 3). Il risultante file di allineamento è stato ottenuto (Figura 4), da cui sono stati identificati tutti i residui dell'amminoacido non corrispondenti (residui del donatore sono evidenziati). Successivamente, abbiamo segnato sequenze di modello (sottolineati) del donatore che erano sufficientemente lungo per coprire tutti i suoi residui non corrispondenti. Basato su queste sequenze di modello e seguendo un design "a piedi", come descritto sopra, tre serie di peptidi ogni 15 aa di lunghezza sono stati derivati per HLA-DQB1. Questo processo è stato ripetuto al resto degli alleli del donatore di HLA-A, B, C, DQA1 e DRB1 (DRA1 e DP sono stati esclusi a causa dell'indisponibilità del record clinici pertinenti) rispetto ai corrispondenti alleli del suo destinatario. Alla fine, un totale di 202 peptidi sono stati arruolati per rendere la matrice (sequenze peptidiche in un foglio di lavoro nella Figura 5 e un'illustrazione di matrice nella Figura 6) specificamente per il sondaggio del siero di alberino-trapianto di PTN n. 4 e confrontato i risultati con quelli ottenuti da una successiva reprobing del suo siero pre-trapianto (Figura 7). Fuori i 202 peptidi, un totale di 10 anticorpo ha mostrato segnali associati con l'esemplare di alberino-trapianta di quali residui di donatore-specific (mal adattato dal destinatario) E87, I306, W243 e K197 di HLA-B * 52:01, -B * 52:01, - C * 03:04 e - DQA1 * 05:01 sembrava essere coinvolto nell'incitamento alla reattività dell'anticorpo (residui indicati in lettere rosse nella Figura 7).

Inoltre, uno dei vantaggi chiavi del metodo matrice rispetto ai tradizionali test SAB è che epitopo informazioni possono essere facilmente ottenuti, come illustrato nella Figura 7. Abbiamo confrontato l'anticorpo-reattiva epitopi HLA-DQA1 e - DQB1 da tutti e cinque i pazienti (dai risultati di matrice separata in Liu et al. 17) facendoli tutti modellati a una struttura di co-cristallo di heterodimer DQA1 e DQB1 (Figura 8). Incoraggiante, un segmento importante della struttura conosciuta come lo strand di β1 è un "hotspot" che ha avuto una probabilità molto più alta (3/5 in pazienti 2, 3,5) destinatari di alloanticorpi tra i soggetti di trapianto nella coorte caso 5.

Figure 1
Figura 1 . Lo schema generale del metodo di matrice dell'antigene HLA-basato per rilevare gli alloanticorpi anti-donatori HLA nei destinatari dell'organo. (Adattato e modificato da Liu et al. 17) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Sito Web di repository di dati
Per recuperare le sequenze di HLA, visitare il seguente sito Web: http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html
Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Nella figura 3. Proteina più sequenze di allineamento del donatore vs destinatari alleli HLA-DQB1 utilizzando tool web-based Clustal Omega.
Copiare e incollare le sequenze del DQB1 di paziente n. 4(PTN#4) * 0201 e 03:01 e del DQB1 donatore * 04:02 e 05:01 in formato FASTA in http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (per l'illustrazione, DQB1 * 05:01 di PTN #4 e DQB1 * 03:01 del donatore vengono visualizzati nella casella di input) . Selezionare l'opzione "Clustal w / numeri" in "Fase 2" per il formato di output ed eseguire l'allineamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . Confronto didonatore vs paziente/destinatario HLA DQB1 e selezione di sequenze di modello per la sintesi del peptide.
Sequenze del donatore sono in grassetto, con donatore-specific mismatch in carattere di colore rosso e anche evidenziato con scatole nere. Sequenze di modello (sottolineati) per la derivazione di peptidi contengano questi residui di donatore-specific. (Questa figura è stata adattata e modificata da Liuet al. 17) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 . Un esempio chiarificatore del foglio di lavoro master in un foglio di calcolo di peptidi HLA donatore.
Posizione di peptide sulla matrice è indicata da riga vs colonna coordinate. Sequenze peptidiche utilizzate per la programmazione di sintesi utilizzando robot SPOT sintetizzatore. I residui di donatore-specific (mal adattati da alleli corrispondenti del destinatario) sono evidenziati in grassetto e sottolineati. Sono anche indicate le posizioni di inizio e di fine del peptide corrispondenti a sequenze di lunghezza completa HLA-DQB1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 . Immagine di una sezione di matrice macchiato con Ponceau S
Nota disparità nell'intensità di colore a causa della differenza nella composizione aminoacidica tra peptidi, mentre le concentrazioni nel peptide tra tutte le zone di spot sono gli stessi. (L'immagine è un esempio chiarificatore, non quello da questo studio effettivo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 . Specifiche del donatore HLA-A, B, C, DQ, DR studio di matrice degli epitopi non corrispondenti a PTN n. 4.
Seriale peptidi sono stati derivati da sequenze del donatore a coprire non corrispondenti residui (un esempio di DQB1 nella Figura 4). La matrice è stata utilizzata per sondare il siero post-trapianto (macchia bassa: post-TX) e successivamente il siero pre-trapianto (macchia superiore: pre-TX) dallo stesso paziente. I quattro gruppi di macchie forte dal sondaggio post-trapianto sono contrassegnati da linee rosse (nella macchia bassa), mentre due punti di media intensità che erano associate solo con pre-trapianto di siero sono contrassegnati da strisce blu (nella macchia superiore). La tabella in basso mostra le sequenze peptidiche corrispondenti e la loro reattività al siero del post-trapianto. Residui (non corrispondenti) di donatore-specific E87, I306, W243 e K197 dei loro rispettivi alleli sono in lettere rosse e peptidi mostrando la reattività dell'anticorpo forte sono i caratteri in grassetto. Questa figura è stata adattata e modificata da Liu et al. 17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8 . Posizioni strutturali degli epitopi di HLA-DQ.
Struttura di co-cristallo di HLA-DQ8 è stata usata come modello. La struttura era costituita da un DQA1 e una subunità DQB1 insieme ad un peptide di antigene (A). Strutture secondarie della proteina del α-eliche e β-fili sono mostrate nel pannello (B). DQA1 e DQB1 peptidi che hanno reagito con uno dei cinque siero erano situati sulla struttura co-cristallo ( a e b: ombreggiata in blu). Tre β-fili, β1, β6 e β12 (blu scuro in B), ciascuno rappresentato da più peptidi (brevi linee rosse corrispondenti alle posizioni aa lineare di DQA1), ha reagito con i campioni dei pazienti multipli (risultati originali in Liu et al. 17). tutti i sei DQB1 peptidi (in grassetto) reattivi agli anticorpi in pazienti #2, #3, #5 si trovano al segmento "hotspot" β1 (in B: indicato dalla freccia rossa). Questa figura è stata adattata da Liu et al. 17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Il design della matrice SPOT descritto qui è per lo studio sperimentale della specificità alloanticorpo nel trapianto contro gli antigeni HLA del donatore di organi. In contrasto con il dosaggio SAB esistente ampiamente utilizzato in clinica, il metodo di matrice di antigene ha un grande vantaggio nel suo design flessibile che può ospitare le vere sequenze HLA del donatore individuale. La nuova piattaforma sfrutta le potenzialità della tecnologia di sequenziamento del DNA rapido avanzamento che sarà presto in grado di produrre letture accurate di sequenza allelica HLA senza ambiguità16,27 e le potenzialità dei database designati per repository HLA sequenze15 nella popolazione globale. Il nostro protocollo di matrice-screening attuale è stato sviluppato basato sul successo di diversi studi pilota del trapianto di sera. Qui dobbiamo sottolineare che in questa fase, il nostro array di prototipo sono costruiti solo per scopi di ricerca, non per applicazioni diagnostiche nella pratica clinica.

Un'altra differenza di rilievo tra SAB e nostro array di antigene è che quest'ultimo ha una risoluzione maggiore per distinguere potenziali epitopi dell'antigene all'interno dei 15 segmenti aa delle sequenze HLA, che potrebbero fornire informazioni preziose su alloantigenicity18 . Tuttavia, a differenza della SAB che presenta antigeni della proteina intera per adeguare le loro strutture piegate, la matrice di antigene solo incorpora brevi peptidi, che esclude informazioni conformazionali pieghevole. Di conseguenza, le matrici non rileva gli anticorpi che riconoscono solo gli epitopi conformazionali, che alcuni credono costituiscono una maggioranza di tutti gli epitopi funzionali rilevanti al rigetto anticorpo mediato28,29. Ancora, in altri contesti, azioni di anticorpo contro epitopi lineari, ad esempio quelli in brevi peptidi, sono sfruttate nelle risposte antigene virale e nel vaccino design30,31. Dobbiamo anche notare che, nel numero limitato di campioni di pazienti testati, le prestazioni di sensibilità di rilevamento del nostro array ha superato quello del SAB e ha permesso l'individuazione di anticorpi specifici per donatore prima17 durante la progressione clinica della rigetto anticorpo-mediato. Ciò è dovuto all'elevata concentrazione molare di peptidi locali antigene sulla matrice rispetto al sab Questa funzionalità è particolarmente utile nei casi quando SAB non rilevato nessuna reattività durante prove cliniche e patologiche di rigetto anticorpo-mediata erano apparente, come abbiamo indicato precedentemente17. Tuttavia, è importante sottolineare che questo test personalizzato è più laborioso rispetto al test standard di Sarlo. Il test di matrice richiede l'ottenimento dell'organo sequenze HLA del donatore e del destinatario (proposto) prima di iniziare la progettazione di peptidi di antigene. Poi ci vogliono diversi giorni per produrre la matrice e un altro 7-8 ore per ottenere risultati di anticorpo. Pertanto, la lunga procedura non è adatta per il trapianto donatore deceduto, a meno che lo scopo principale del test anticorpo sia per determinare la comparsa di anticorpi specifici per donatore dopo trapianto, piuttosto che per la valutazione pre-trapianto di anticorpi esistenti.

Il metodo di matrice ha avuto un miglioramento importante della prova di SAB esistente di rilevazione dell'antigene epitopi. Inoltre, abbiamo fatto un tentativo di mappare epitopi reattivi in cinque pazienti sottoposti a trapianto a una struttura di modello di HLA-DQ, in cui abbiamo notato almeno una prominente "hotspot" epitopo nel suo filone di β1 che si sono verificati in tre su cinque pazienti17. Intrigante, i filamenti di β1 dell'HLA-DQA1 e - DQB1 sono situati presso il groove del controbattitore presentazione dell'antigene (Figura 8), una posizione conosciuta per essere antigenica nel contesto del trapianto rifiuto32. Pertanto, prevediamo che la futura esplorazione del nostro metodo di matrice personalizzata antigene nel trapianto di estesi studi di coorte produrrà preziose informazioni sugli hotspot antigenico in molecole HLA. Un catalogo di questi hotspot identificati, quando considerato in congiunzione con altamente esatto DNA sequenziamento tipizzazione dei geni HLA tra potenziali donatori e riceventi, assisterà alla fine le decisioni pre-trapianta attraverso programmi di mancata corrispondenza accettabile 33, intese ad evitare più efficacemente alcune incongruenze nelle vicinanze agli hotspot catalogati.

In sintesi, il nostro studio originale17 a esplorare la progettazione personalizzata di una matrice di antigene per il rilevamento di anticorpi specifici anti-HLA era il primo del suo genere. Obiettivo dello studio era sulla fattibilità di matrice design e implementazione, che ha servito come un prototipo per la tecnologia del futuro potenziale. Il nostro studio pilota non solo generato risultati da campioni clinici incoraggianti, ma anche ci ha permesso di stimare il costo complessivo e la velocità del test. Il costo di produzione di una matrice personalizzata in nostro attuale ambiente di laboratorio è sotto $1.000 USD, che è un costo una tantum, in quanto la matrice quindi può essere utilizzata nel corso del tempo in fino a 20 giri di reprobing cicli senza perdita di prestazioni. È possibile che ulteriori test del protocollo matrice con un gruppo più ampio di trapianto oggetti snellirà ulteriormente il metodo che potrebbe un giorno essere utilizzato nella pratica clinica.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Ringraziamo la d. ssa Shawn Li e Li Xing della Western University in Canada per la loro assistenza gentile con SPOT produzione di matrice. Siamo grati ai membri del personale presso il nucleo di istocompatibilità e presso la completa Transplant Center della Northwestern University per la fornitura di servizi di esempio. Questo lavoro è stato parzialmente supportato da ausiliari Board di Northwestern Memorial Hospital e da un fondo di avvio facoltà forniti dalla Northwestern University di J.J..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptide array INTAVIS Bioanalytical Instruments
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
Non-fat milk Bio Rad Laboratories 1706404
TBST Santa Cruz Biotechnology 10711454001
Goat anti-human IgG–HRP  ThermoFisher Scientific A18811
Clarity Western ECL Substrate Bio Rad Laboratories 1705061
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientifics 21059
ChemiDoc gel imaging system Bio Rad Laboratories 1708265 

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Personalizzato Peptide matrici per il rilevamento di anticorpi HLA nei trapianti d'organo
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Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).More

Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).

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