Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Personlig peptid matriser för detektion av HLA alloantikroppar vid organtransplantation

doi: 10.3791/56278 Published: September 6, 2017

Summary

Avvikelser i humant leukocyt antigen (HLA) sekvenser mellan organdonator och mottagarens par är den största orsaken för antikroppsmedierad avstötning vid organtransplantation. Här presenterar vi användningen av anpassade antigen matriser som baseras på individuella givarnas HLA sekvenser sond mot givaren HLA alloantikroppar i organ mottagaren.

Abstract

Vid organtransplantation beroende funktion och livslängd av graften kritiskt av framgången för kontroll av immunologisk avstötning reaktivitet mot humant leukocyt antigen (HLA). Histocompatibility riktlinjerna baseras på laboratorietester av anti-HLA immunitet, som presenterar antingen som befintlig eller de novo genereras HLA antikroppar som utgör en större transplantation barriär. Nuvarande tester är byggda på en singel-antigen pärlor (SAB) plattform med en fast uppsättning ~ 100 förvalda rekombinant HLA antigener sond transplantation sera. Hos människor finns det dock en mycket större mängd HLA-typer, med inga två individer än identiska tvillingar som kan dela samma kombination av HLA sekvenser. Även avancerad teknik för HLA-typning och sekvensering kan just fånga eventuella skillnader i DNA-sekvensen mellan en givarens och mottagarens HLA, SAB analysen, på grund av dess begränsade utbud i sekvens representation, är inte exakt upptäcka alloantikroppar mot just de givaren felmatchade HLA. Vi försökt att utveckla en kompletterande metod som använder en annan teknik att upptäcka och karaktärisera anti givare HLA antikroppar på personlig grund. Verktyget screening är en anpassad peptid rad givare HLA-derived sekvenser för avsökning efter transplantation sera hos organ mottagaren att bedöma risken för antikroppsmedierad avstötning. På en matris för en givare-mottagare par, görs upp till 600 unika peptider baserat på givarens HLA proteinsekvenser, varje peptid som medför minst en omaka rester i en 15-amino acid sekvens. I vår pilot experiment att jämföra antigen mönster för före och efter transplantation sera på dessa matriser, kunde vi upptäcka anti-HLA signaler med den resolution som också tillät oss att lokalisera den immun epitoper som är inblandade. Dessa personliga antigen matriser tillåter högupplösta detektering av givare-specifika HLA epitoper vid organtransplantation.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Orgel substitutionsterapi som utförs rutinmässigt över hela världen har räddat miljontals liv. Solida organtransplantationer sker i cirka 100 patienter per miljon invånare i USA årligen, medan ett större antal är fortfarande på väntelistor ta emot donerade organ på grund av svår brist (enligt uppgifter från orgeln Upphandling och Transplantation nätverk - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Organtransplantation är hårt reglerad för att minska orgel avfall och rädda liv, men de vetenskapliga verktyg som används för att informera dessa förordningar är begränsade i effektivitet. Exempelvis det vetenskapliga samfundet erkänner fullt starkt polymorfa påstår av HLA-molekyler och exakt genetiska tester av DNA använder högupplösta maskinskrivning och sekvens-baserade skriva (SBT) har utvecklats på senare år1, 2. dock alloantikropp testmetoder har ännu inte kunnat producera en stor mängd enskilda HLA sekvenser som antigen sonder. Standardtestet numera använder en oföränderlig panel ~ 100 alleliska antigener som består av vanliga varianter av HLA, A, B, C, DQ, DP och DR sekvenser i mänskliga populationer3,4,5,6. Faktiska givarens HLA sekvenser ingår ofta inte testet på panelen tvingar transplantation läkare och kirurger för att härleda givare-specifika reaktivitet baserat på delade likheter mellan donatorns faktiska sekvenser och motsvarande ”standarder” i den testa set7,8. Följaktligen är det ibland svårt att göra en tillförlitlig uppskattning av avvisande riskbaserad antikropp test resultat9,10,11,12. Nya personligen anpassningsbara tester för alloantikroppar är därför brådskande13,14.

De HLA-generna kodar de stora histocompatibility komplexa (MHC)-receptorer som har en nyckelfunktion i immunsvar6. HLA-gener är kända för att vara de mest polymorfa generna av det mänskliga genom6. På grund av de snabba framstegen inom DNA sekvensering strategier för HLA generna, nya alleliska varianter (eller helt enkelt kallas alleler) upptäcks på en explosiv hastighet15,16. Av mars 2017, 16,755 validerade alleler hade deponerats i IMGT/HLA-databasen (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), av vilka 12 351 var av klass jag och 4.404 var av klass II grupper. I skarp kontrast representeras bara lite över 100 olika alleler i standard single-antigen pärlor (SAB) analysen, som rutinmässigt används för att upptäcka alloantikroppar vid organtransplantation. SAB metoden bygger på en Luminex plattform med hjälp av flödescytometri. Eftersom analysen använder en oföränderlig uppsättning antigener, bortsett från smärre tillverkningssatserna variabilitet i produktionen, kan testet antiserum vara standardiserade kraftfullt mellan individer och mellan laboratorier5. Detta test är dock inte att fånga alla alloantikroppar utvecklat specifikt mot de givaren allelerna, särskilt när givaren sekvenser är frånvarande från SAB set. Även egen produktion av givarnas antigener baserad på sann sekvenser är önskvärt, återstår det tekniska utmaningar i effektivisering nödvändiga produktionen och testförfaranden.

Vi har nyligen beskrivit en alternativ metod i en genomförbarhetsstudie av njurtransplanterade patienter17. Metoden används peptid antigener i formatet array för avsökning före och efter transplantation sera hos enskilda försökspersoner. Varje matris var specialbyggda använder fläck syntes metod18,19,20,21,22,23 som producerar peptid antigener, varje 15 aminosyror i längd, helt baserad på respektive organ givarens HLA-alleler av A, B, C, DQA1, DQB1 och DRB1. SPOT syntes drivs på ett cellulosa membran med standard Fmoc-kemi22 och kan producera hundratals anpassade peptider parallellt med en helautomatisk robotsystem19,21. Arrayen membranet tål flera rundor av strippar och reprobing cykler. I vår retrospektiv studie17upptäckte vi ändringar i antigen mönster med lagrade transplantation antisera samlas i en tidsserie (dvs. före och efter transplantation). Häri beskriver vi det tekniska protokollet för arbetsflödet inklusive array design, tillverkning, antiserum sondering och resultatet analys. Metoden är avsedd för påvisande av alloantikroppar mot specifika linjär epitoper på transplantation givarnas HLA-molekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den nordvästra universitetet institutionella Review Board (IRB protokoll #: STU00104680). En övergripande arbetsflödet i protokollet illustreras i figur 1.

1. bioinformatiska analyser av givare och mottagare HLA sekvenser

  1. Hämta sekvenser från IMGT/HLA databas 15.
    1. Få HLA skriva rapporter både organdonator och dennes mottagaren och.
      Obs: Se till att lämpliga förfaranden för att skydda sekretessbelagda patientjournaler utnyttjas. Vanligtvis krävs en institutionell granskning Board (IRB) godkännande av studieprotokollet eller experimentell test per institutionella IRB riktlinjer. Om HLA rapporter från PCR-baserade typning (av antingen hög eller låg upplösning) eller sekvensering-baserade skriva (SBT), går direkt till steg 1.1.3. Om sekvenser erhölls från genomisk/HLA sekvensering, och om de är kompletta, använda dessa sekvenser direkt istället. Ibland, när endast ofullständiga att skriva eller sekvensering resultaten är tillgängliga, Följ ytterligare steg 1.1.2. tilldela den " saknas " alleler via webbverktyget som beskrivs i steg 1.1.2.
    2. Öppna den tvetydiga allel kombinationer efter webb länk - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html, och söka med hjälp av den “ tvetydig allel kombinationer sökverktyg ” funktion för att hämta de hypotetiska allelerna. Fortsätt sedan till steg 1.1.3. Ange namnet allel.
    3. Öppna formuläret IMGT/HLA allel fråga på följande webblänken - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html och ingående ämne ’ s allelen namn (varje individuellt, såsom visas i figur 2) in i den “ Sök för ” rutan. Klicka på den “ Sök för alleler nu ” knappen. HLA allel namn bör använda standard namngivning system (dvs. A *, A * 01, A * 01:01:01:01 och eventuella tidigare beteckningar som A * 01010101).
    4. Hitta matchande allel namn visas på skärmen. Klicka på knappen allel.
    5. Kopia den " proteinsekvens ", och klistra in den i ett textdokument under en huvudrad av " > allel namn ". Effektivt, textdokumentet är i ett format som FASTA (FAST-All) av allel namn och sekvens.
  2. Utföra gen-baserade flera anpassningar av givaren och mottagaren/patienten alleler.
    1. En gen (dvs DQB1 * 03:01:01:01) i taget, kopiera och klistra in alla fyra alleler av givare och patienten FASTA sekvenser (två från givare) och två från patienten i en kombinerad textdokument. Vid denna punkt, är det viktigt att differentially beteckna givare allel namn från patientens allel namn (alternativ inkluderar differentiell användning av övre jämfört med lägre fall; eller skapa en särskiljande prefix eller suffix förlängning till varje allel-namn för att markera separat givare vs. patienten alleler). Den ingående ordningen av sekvenser är inte viktigt eftersom efter justering ordern kommer att blandas med grad av likhet mellan två sekvenser.
    2. Kopiera och klistra in sekvenser i FASTA format (som ses i figur 3) från ovan till den “ ange din ingående sekvenser ” låda på klustret Omega webbplats: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
    3. Klicka på " skicka ditt jobb " med standard inställningar av parametrar: såsom " PROTEINŔ och " Clustal w / nummer ". Utför justering genom att klicka på " skicka ". En anpassning av de fyra sekvenserna visas på skärmen ( figur 4).
  3. Mark givare-specifika missmatchningar.
    Obs: Speciellt noteras bör att de alleliska sekvenser som ges här baserades på resultaten av HLA-typning, inte sekvensering. Därför finns det en risk att relevanta sekvens variation i viss givare-mottagare paret kan missas. Detta potentiella problem dämpas som mer och mer transplantationscentra anta korrekt högupplösta maskinskrivning och direkta DNA-sekvensering.
    1. Kopiera och klistra in textens justering i ett textdokument och skapa ett nytt dokument. Om formatet för den anpassade filen är störd, åtgärda formatet genom att ändra teckenstil och teckenstorlek: Använd alltid " Courier New " teckensnittet i små typstorlek att passa raderna. Spara dokumentet efter formatering frågor löses.
    2. Inspektera manuellt justerade sekvenser för att identifiera alla inkompatibla rester som unikt tillhör givaren. Markera var och en av dessa givare-specifika rester med en särskiljande teckenfärg.
    3. Understryka alla bokstäver i givaren ' s sekvenser som förlänga 14 rester både upp - och nedströms de markerade givare-specifika oförenligheter (beräknat som 15 aminosyra peptid minus 1 rester av en felmatchning).
  4. Härleda 15-mer peptid sekvenser i en överlappande serie.
    Obs: Anledningen till att välja 15-mer peptider baserades på allmän kunskap om typiska epitoper är 4-9 aminosyror i längd. Därför, när vi tillämpat en " rörliga fönster " förfarande med steg 4 aminosyror ( figur 1), vårt urval av en 15 aminosyra längd lämnade en 15-4 = 11 aminosyra överlappning mellan någon närliggande peptider i en serie. I teorin detta 11 aminosyra överlappningen är tillräckliga för att täcka alla immun epitoper av upp till 9 aminosyror i längd, så att ingen epitop oavsiktligt " dela " i halv med endast partiella sekvenser på matrisen.
    1. Använda den understrukna sekvenser så mallar att sekventiellt härleda kort 15 amino syra ordnar i en serie som överlappar av 4 resthalter mellan vilka två omedelbart intilliggande sekvenser i serien.
    2. Kopiera och klistra in dessa 15 amino syra ordnar i ett kalkylblad ( figur 5) i ett kolumnformat åtföljs av notation kolumner som innehåller motsvarande namnen på de givaren allelerna. Ytterligare en kolumn att inkludera aa rester positioner kan vara användbar.
  5. Upprepa stegen från 1.1.3. till 1.3. för varje HLA allel (dvs. A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 och DP) av givaren och mottagaren paret att härleda de 15 aa korta sekvenserna givarens.
  6. Kopiera och klistra in alla kolumner i en master kalkylblad för att skapa en lång kontinuerlig kolumn av alla 15 aa sekvenser från alla allelerna av givaren. Skriv ner det totala antalet rader (för peptid sekvenser) i dokumentet.

2. Design av anpassad Array Layout och produktion

  1. generera ett kalkylblad av peptid sekvenser med motsvarande allel kallelser. Matrisen har 20 rader och 30 kolumner och kan rymma upp till 20 x 30 = 600 ställen för peptider. Beroende på det totala antalet peptider som registrerats i steg 1,5 från en viss givare, och baserat våra tidigare erfarenheter med två exempel som vi hade försökt i Liu et al. 17, 600 spot matrisen rymmer alla de sekvenser som genereras från ~ 2 separata transplantation fall.
    1. Rationellt planera mest efficient sätt för att passa uppsättningarna av peptider i formatet 600-spot matrisens.
    2. Om mer än ett ämne kan passa in i en hel rad, infoga tomma rader efter den första givaren ' s sekvenser att matcha det totala antalet rader som kan delas av 30 (antalet ställen i rad på matrisen).
    3. Omedelbart efter den sista tomma raden för den första uppsättningen av sekvenser, klistra in i den hela kolumnen i sekvens innehållet från transplantation understödjafallet.
    4. Upprepa dessa steg tills matrisen är fylld och inga fler fall kan läggas utan att överskrida 600 fläckarna. Om hela tomma rader finns kvar för att fylla på botten, " flytta " den tomma raden ska placeras mellan de två givare. Denna brett utrymme kvar mellan fall gör kapning av membranet efter slutförandet av syntesen lättare - efter steg 3,2. nedanför.
  2. Programmera peptid sekvenser i samband med array layout. Programmet för SPOT syntet tar ett textformat av sekvenser (en rad en peptid sekvens), som direkt kan erhållas genom att spara det resulterande kalkylbladet från steg 2.1.4 som enkel textdokument (utan extra kolumnerna för allel namn, aa positioner etc.).
  3. Kör automatiserade peptid matris syntesen via SPOT syntet. Hela driften av syntesen är detaljerad i vårt tycke et al. 21. Observera att Fmoc syntes av två matriser tar ~ 4-5 dagar.

3. Sond och Reprobe antiserum på tidsserien individens transplantation mottagare.

Obs: 600-spot membran matrisen har den mått ~ 7 cm x 13 cm. Efter syntes, kan arrayer förvaras vid rumstemperatur som torra membran för minst två år vid skyddad från direkt ljus. Undvika överdriven vikning av membranet att bevara dess livslängd för upprepad användning.

  1. Rehydrera arrayen membran med etanol och visualisera peptid ställen fläckade Ponceau S.
    1. Rehydrera membranet array bär de peptider som efter ett stegvis förfarande optimerad i Li et al. 24.
      1. fördjupa array membranet i 20 mL 100% etanol.
      2. Tillsätt 20 mL destillerat vatten till späd lösningen på 50% etanol och odla i rumstemperatur i 15 min.
      3. Ändra nedsänkning lösningen till 40 mL 100% vatten tre gånger och inkubera 15 min varje gång.
      4. Tvätta i en korrekt fungerande buffert, exempelvis 20 mL av TBST (Tris-buffrad koksaltlösning med 0,1%), tre gånger för 5 min varje.
    2. Ponceau S färgning av matrisen att visualisera syntetiska peptider
      1. Tillsätt 20 mL av villkorets Ponceau S lösning direkt till arrayen hydrerad och inkubera i ~ 30 s med skakning.
      2. Kör destillerat vatten kontinuerligt över membranet att de färga bakgrunden Ponceau S färg. Under processen, peptid fläckar av röd färg kan bli synliga.
      3. Separat portionr av matrisen för varje givare genom att noggrant skära mellan delarna i matrisen för enskilda fall. Markera varje matris orientering.
  2. Före block array.
    1. Block membranet i 20 mL 5% fettfri mjölk upplöst i TBST buffert. Denna mjölk-baserad lösning ytterligare färgar de Ponceau S färg. Ersätta mjölk bufferten flera gånger för att uppnå de tydligaste peptid bilderna.
    2. För registerföring ändamål, ta ett foto av Ponceau S bilden av matrisen med hjälp av en handhållen kamera (exempel i figur 6).
    3. Fortsätta blockering av membranet i 5% fettfri mjölk vid 4 ° C över natten eller i rumstemperatur i 2 h med vaggande.
  3. Inkubera array med transplantation antiserum.
    Obs: Bör det noteras att ett fenomen känt som prozoneffekt eller krok effekten kan resultera från komplementberoende inblandning i serum antikroppar analys. För att kringgå problemet, kan ett tillval serum förbehandling steg övervägas med antingen EDTA eller värme inaktivering av serumprov.
    1. Ta bort blockerande buffert och tvätta membranet med 20 mL av TBST tre gånger nästa dag för 5 min varje gång.
    2. Tillsätt 20 µL av rå serum hos mottagaren att 20 mL 2,5% mjölk i TBST buffert och inkubera med membranet för 2-3 h i rumstemperatur. Observera att i denna första omgång av sondering, det rekommenderas att den sista efter transplantation serum (eller sannolikt mest sensibiliserade serum) i tidsserien används först. Detta är baserat på antagandet att tidigare exemplar i serien, särskilt från före transplantationen tidpunkter, har mindre mängd alloantikroppar som tenderar att utvecklas över tiden. Detta sätt, någon möjlighet att signalstörning från " överföring " mellan sondera rundor kan särskiljas från verkligen utvecklade alloantikropp reaktivitet på grund av immunsvar mot transplantatet.
  4. Tvätta arrayen med 20 mL TBST och inkubera med sekundär antikropp.
    1. Tvätta membranet tre gånger för 10 min varje gång.
    2. Inkubera med get-anti-humant IgG-HRP (pepparrotsperoxidas) sekundär antikropp på 1:10,000 utspädning i TBST buffert kompletteras med 1% mjölk för en annan 2 h.
  5. Tvätt och utveckla blot.
    1. Tvätta membranet tre gånger med TBST i 10 min varje gång.
    2. Utför enhanced chemiluminescence (ECL) med 5 mL urin lösning nymalen blandas med 5 mL peroxid lösning att utveckla membranet (för 1 min).
    3. Visualisera ECL signaler med hjälp av en lämplig imager (dvs. ChemiDoc Imaging system eller Azure C600).
  6. Scan och kvantifiera blot.
    1. Spara utvecklade bilderna ( figur 7, nedre bild) och utföra kvantifiering av spot intensitet.

4. Jämföra Antiserum reaktivitet i kliniska tidsserien.

  1. Strip matrisen.
    1. Vid denna punkt, hålla membranet våt vid alla tidpunkter.
    2. Remsa membranet genom inkubation med 20 mL kommersiella stripp buffert vid 37 ° C i 20 min och tvätta sedan membranet med TBST tre gånger för varje 10 min. Upprepa sedan den blockerande (steg 4,2) och sondering (steg 4,3) steg med hjälp av en olika serum från patienten tagit vid en annan tidpunkt.
  2. Block strippad membran.
    Obs: Efter strippar, membranet kan återanvändas för ytterligare en runda av sondering av en olika serum från samma patient i en tidsserie.
    1. Blockera membranet med 5% mjölk buffert som tidigare (se punkt 3.2).
  3. Reprobe ett annat antiserum från samma tidsserie (Upprepa steg från 3,3-3,6; exempel i figur 7, övre bilden).
    Obs: Avskalade matrisen kan sedan användas för att reprobe en annan serum prov. Eftersom Peptiderna är kovalent konjugerad till stödjande matrix av membranet, visade vi att matrisen kan återanvändas i upp till 20 rundor av strippar och reprobing cykler utan att förlora dess perfofara.
  4. Långtidsförvaring av arrayer.
    1. Store membranet i TBS buffert kompletteras med 0,02% w/w natriumazid som konserveringsmedel. Använda en förseglad plastpåse för långsiktig lagring. Vid 4 ° C i skydd från direkt ljus, våt membranet kan lagras i minst 2 år.

5. Datainsamling och analys

  1. manuellt kommentera positiv antigen peptider.
    1. Lokalisera ställen visar positiva antikroppar signaler och avgöra var och en av deras rutnät ståndpunkter.
    2. Markera motsvarande rader i huvudkalkylbladet för positiva peptiderna.
  2. Hämta peptid sekvenser som anges i huvudkalkylbladet ( figur 7, nedre listan). Enligt Designprincipen som beskrivs i steg 1.4.1., angränsande seriell ställen dela betydligt överlappande sekvenser (15-4 = 11), därför reaktiva epitoper kan delas av peptider i en sammanhängande serie.
    1. Belysa några positiva fläckar uppstår i följd.
  3. Bestämma minsta epitop längd för varje peptid i en serie.
    1. Höjdpunkt alla potentiellt delade epitop sekvenser baserat på överlappande segment av reaktiva peptider.
  4. Strukturellt modell antigen epitoper.
    1. Få prototyp HLA kristallen strukturerar från Protein databanken finns på följande webblänken: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
    2. Visa prototypen HLA struktur i Pymol (Ladda ner från www.pymol.org).
    3. Karta " eller modell upptäckte anti givare epitoper till 3D-strukturer av prototyp HLA molekylerna genom att belysa de reaktiva peptid sekvenserna ( figur 8). Klicka på " Display ", sedan " bakgrund ", och välj " vit ". Om du vill spara bilden, gå till " fil " och " Spara bilden som " och Välj filformat " png ".
  5. Rapportera resultaten och tilldela de motsvarande allelerna reaktiva epitoper.
  6. Jämför array singel-antigen pärlor (SAB) resultat, om tillgängligt.
    Obs: SAB testet använder enda alleliska antigener mäter antikroppar reaktivitet mot en fast panel av HLA-proteiner. Enskilda peptider som visar antikropp reaktivitet hör till vissa HLA-alleler som, om också ingår i panelen SAB tillåter direkt jämförelse mellan matrisen och SAB resultaten. Vår tidigare studie 17 visade en hög korrelation mellan resultaten, vilket tyder på att de peptid epitoper avsevärt bidra till övergripande Reaktiviteten hos SAB. Dessutom avslöja array resultaten också aminosyra-nivåer av specificitet.
    1. Erhåll SAB resulterar från ett HLA-labb som ger information om huruvida och vilken givare alleler är reaktiva till efter transplantation sera hos patienten. Resultat från steg 5,5. baserat på matrisen analys ger också information om motsvarande givare alleler positiva alloantikropp reaktivitet.
    2. Jämför SAB och array resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I den ursprungliga studien med array screening metod17inskrivna vi totalt 5 njur transplantation försökspersoner. Vi fick den HLA att skriva resultaten av våra kohort och deras respektive givare. Deras medicinska historia och alleliska antikroppsnivåerna var från SAB tester var också tillgänglig för oss. I vår pilotstudie av dessa 5 patienter, utarbetade vi två olika metoder: en standard utbud består av en fast panel av peptider och personlig matriser som var anpassade gjort för varje tabellpar som givare och mottagare. Medan den första metoden hade tillåtit oss att tekniskt validera utförandet av array plattformen för att uppnå hög specificitet i enskilda transplantationer, beskrivs personlig protokollet för denna sistnämnda metod i denna artikel och video avsedd för omfattande screening av givare-specifika antikroppar (DSA), som ofta korrelerar med dålig transplantat utfall5,25,26.

De personliga arrayer tillämpades på två av de fem fall17, och för att illustrera det totala arbetsflödet för metoden, fokuserar här vi på en av dessa två patienter (nämligen PTN #4). Den viktigaste tekniken för att göra anpassade peptid array innebär plats syntet. Det är en helt automatiserad robotsystem som gör peptider med Fmoc syntes direkt på en speciellt härledda cellulära matris på ett membran (figur 1). Vi utnyttjat flexibiliteten i syntet att montera stora uppsättningar av peptider som härrör från enskilda organdonatorer HLA sekvenser. För att ha tillräcklig täckning för att undvika en situation när en kontinuerlig epitop är att vara ”split” och förlorar antikropp reaktivitet, vi följde en ”walking” design av seriell peptider har 15-4 = 11 rester av överlappning mellan någon omedelbart angränsande peptider, så att serien alltid tillräcklig för att täcka typiska längden av antikropp epitoper uppskattas till 4-9 aa i längd (figur 1).

Den mall HLA sekvenser hämtades direkt från databasen databasen upprätthålls på EMBL-EBI (den europeiska Bioinformatics Institute). Som ett exempel, PTN nr 4: s givare är HLA-DQB1 * 03:01:01:01 allel var sökte (webbsida illustrationen i figur 2). Tillsammans, vi separat hämtat sekvenser för givarens andra HLA-DQB1 allel av * 02: 01:01, samt de av PTN #4 själv, HLA-DQB1 * 04:02 och * 05:01. Flera följd anpassningen utfördes sedan med hjälp av Clustal Omega webbfunktioner (figur 3). Den resulterande justering filen erhölls (figur 4), från vilket alla inkompatibla aminosyra rester identifierades (givarens rester är markerad). Nästa, vi markerade mallen sekvenser (understruken) av givaren som var tillräckligt lång för att täcka alla hans inkompatibla rester. Baserat på dessa mall sekvenser och följa en ”walking” design som beskrivits ovan, tre serier av peptider varje 15 aa i längd härleddes för HLA-DQB1. Denna process upprepades till resten av givarens alleles av HLA-A, B, C, DQA1 och DRB1 (DRA1 och DP uteslöts på grund av avsaknad av relevanta kliniska posten) i jämförelse med de motsvarande allelerna av sin mottagare. I slutet, totalt 202 peptider enlisted för att göra matrisen (peptid sekvenser i ett kalkylblad i figur 5 och en matris illustration i figur 6) specifikt för avsökning på PTN nr 4 efter transplantation serum, och jämfört resultaten med de som erhållits från en efterföljande reprobing av hans före transplantationen serum (figur 7). Av de 202 peptiderna, sammanlagt 10 visade antikropp signaler är associerad med efter transplantationen preparatet som givare-specifika resthalter (mismatched från mottagaren) E87, I306, W243 och K197 av HLA-B * 52:01, -B * 52:01, -C * 03:04 och -DQA1 * 05:01 tycktes vara involverade i anstiftan antikropp reaktivitet (rester betecknas med röda bokstäver i figur 7).

Dessutom är en av de viktigaste fördelarna med metoden array jämfört med traditionella SAB testet att epitop information lätt kan erhållas, som visas i figur 7. Vi jämförde den antikropp-reaktivt epitoper på HLA-DQA1 och -DQB1 från alla fem patienter (från separat array resulterar i Liu et al. 17) genom att ha dem alla modellerade till en samtidig kristallstrukturen av DQA1 och DQB1 heterodimer (figur 8). Uppmuntrande är är ett framstående segment av den struktur som kallas β1 strand en ”hotspot” som hade en mycket högre chans (3/5 av patienter 2,3,5) riktas av alloantikroppar bland ämnena som transplantation i 5 fall kohorten.

Figure 1
Figur 1 . Den allmänna systematiken i HLA-baserade antigen array metoden för att påvisa anti givare HLA alloantikroppar i organ mottagaren. (Anpassad och modifierad från Liu et al. 17) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Data repository webbplats
För att hämta HLA sekvenser, finns på följande webbplats: http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html
Klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Flera protein sekvenser anpassningen av givare vs mottagarens HLA-DQB1 alleler med Clustal Omega webbaserat verktyg.
Kopiera och klistra in sekvenser av patientens #4(PTN#4) 's DQB1 * 0201 och 03:01, och av givarens DQB1 * 04:02 och 05:01 i FASTA format till http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (för illustration, DQB1 * 05:01 av PTN nr 4 och DQB1 * 03:01 givarens visas i inmatningsrutan) . Välj alternativet ”Clustal w / siffror” i ”steg 2” för output format och kör justering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Jämförelse avgivare vs patienten/mottagare HLA-DQB1 och urval av mallen sekvenser för peptidsyntesen.
Givarens sekvenser är fet, med givare-specifika skillnader i rött typsnitt och också markeras med svarta lådor. Mall-sekvenser (understruken) för att få fram peptider innehålla dessa givare-specifika rester. (Denna siffra var anpassat och modifierad från Liuet al. 17) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Ett belysande exempel på huvudkalkylbladet i ett kalkylblad med givare HLA peptider.
Peptid positionen på matrisen indikeras av rad vs. kolumn koordinater. Peptid sekvenser används för att programmera syntes med robotic SPOT synthesizer. Givare-specifika rester (mismatched från mottagarens motsvarande alleler) är markerade med fetstil och understruken. De start- och slutpositionerna av peptiden motsvarar full längd HLA-DQB1 sekvenser indikeras också. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 . Bilden av en array avsnitt fläckade Ponceau S
Observera skillnaden i färgintensitet på grund av skillnaden i aminosyra sammansättning bland peptider, medan peptid koncentrationer bland alla spot områden är desamma. (Bilden är ett belysande exempel, inte en från faktiska studien.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 . Givare-specifika HLA-A, B, C, DQ, DR array studie av inkompatibla epitoper i PTN #4.
Seriell peptider härleddes från givarens sekvenser att täcka inkompatibla rester (ett exempel på DQB1 i figur 4). Matrisen användes sond efter transplantation serum (lägre blot: post-TX) och därefter före transplantationen serum (övre blot: pre-TX) från samma patient. De fyra uppsättningarna av stark fläckar från efter transplantation sondering är markerade med röda linjer (i lägre blot), medan två medelintensiv fläckar som var bara associerade med före transplantation serum är markerade med blå linjer (i övre blot). Tabellen längst ned visar motsvarande peptid sekvenserna och deras reaktivitet till efter transplantation serum. Givare-specifika (avvikande) rester E87, I306, W243 och K197 av deras respektive alleler i röda bokstäver och peptider som visar stark antikropp reaktivitet är i fetstil. Denna siffra var anpassat och modifierad från Liu et al. 17. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8 . Strukturella platser för HLA-DQ epitoper.
Samtidig kristallstrukturen av HLA-DQ8 användes som mall. Strukturen består av en DQA1 och en DQB1 subenheter tillsammans med en antigen peptid (A). Sekundära proteinstrukturer av α-spiraler och β-strands visas i panelen (B). DQA1 och DQB1 peptider som reagerat med antingen en av fem serum var belägna på samtidig kristallstrukturen (i A och i B: skuggad i blått). Tre β-trådar, β1, β6 och β12 (mörkblå i B), var och en representeras av flera peptider (korta röda linjer motsvarar DQA1 linjär aa positioner), reagerade med flera patienternas prover (ursprungliga resultat i Liu et al. 17). alla sex DQB1 peptider (i fetstil) reaktiva antikroppar hos patienter #2, #3, #5 finns till β1 ”hotspot” segmentet ( b: som den röda pilen pekar). Denna siffra var anpassad från Liu et al. 17. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Utformningen av matrisen plats som beskrivs här är för experimentell studie av alloantikropp specificitet vid transplantation mot organdonators HLA antigener. I motsats till den befintliga SAB-analysen i stort sett används i kliniken, har antigen array metoden en stor fördel i sin flexibla design som rymmer de Sant HLA sekvenserna av enskilda givare. Den nya plattformen utnyttjar potentialen av de snabbt framryckande DNA sekvensering teknik som snart kommer att kunna producera korrekta HLA alleliska sekvens avläsningar utan tvetydighet16,27 och potentialen hos utsedda databaser för förrådet sekvenser HLA15 i den globala populationen. Vår nuvarande array-screening-protokollet har utvecklats baserat på framgången med flera pilotstudier av transplantation sera. Här bör vi understryka att vår prototyp matriser i detta skede är konstruerade endast för forskningsändamål, inte för diagnostik program i klinisk praxis.

En anmärkningsvärd skillnad mellan SAB och våra antigen array är att den senare har en högre upplösning att skilja potentiella antigen epitoper inom segmenten 15 aa i HLA sekvenser, som kan ge värdefull information om alloantigenicity18 . Dock till skillnad från SAB som presenterar hela proteinantigener för att anpassa sina vikta strukturer, omfattar antigen arrayen endast kort peptider, vilket utesluter information om konfirmerande vikning. Därför arrayer kan inte upptäcka antikroppar som känner endast igen konfirmerande epitoper, som vissa tror utgör en majoritet av alla funktionella epitoper relevanta antikropp medierad avvisande28,29. Fortfarande, i andra sammanhang, antikropp åtgärder mot linjär epitoper, såsom de i kort peptiderna, utnyttjas i virusantigen svaren och i vaccin design30,31. Vi bör också notera att i det begränsade antalet patientprover testas, upptäckt känslighet utförandet av vårt utbud överstigit antalet SAB och tillåtna detektion av givare-specifika antikroppar förr17 under den kliniska utvecklingen av antikroppsmedierad avstötning. Detta beror på den höga molära koncentrationen av lokala antigen peptider på matrisen jämfört med SAB. Den här funktionen är särskilt användbart i fall när SAB upptäckte ingen reaktivitet medan kliniska och patologiska bevis för antikroppsmedierad avstötning var uppenbar, som vi visade tidigare17. Det är dock viktigt att påpeka att detta personligt test är mer tidskrävande än SAB standardtestet. Array testet kräver att erhålla orgeln givarens och (föreslagen) mottagarens HLA sekvenser innan du påbörjar utformningen av antigen peptider. Det tar sedan flera dagar att producera matrisen och ytterligare 7-8 timmar att få antikropp resultat. Det långa förfarandet är därför inte lämplig för transplantation med avliden donator, såvida inte huvudsyftet med antikroppstest är för att bestämma uppkomsten av givare-specifika antikroppar efter transplantation, i stället för före transplantationen utvärderingen av befintliga antikroppar.

Metoden array hade en stor förbättring från det befintliga SAB testet att upptäcka antigen epitoper. Dessutom gjorde vi ett försök att mappa reaktiva epitoper i fem transplanterade patienter till en mall strukturen av HLA-DQ, som vi noterat minst en framstående ”hotspot” epitop i dess β1-strand som inträffade under tre av de fem patienter17. Spännande, finns β1 delarna av HLA-DQA1 och -DQB1 på spåret på den antigen-presentation konkava (figur 8), en plats känd att vara antigen i samband med transplantation avslag32. Därför räknar vi med att framtida utforskning av vår personliga antigen array metoden i utökade transplantation kohortstudier kommer att ge värdefulla insikter om antigena hotspots i HLA-molekyler. En katalog över dessa identifierade hotspots, när jämförda med noggranna DNA sekvensering typning av HLA-gener mellan potentiella givare och mottagare, hjälper slutligen före transplantationen beslut genom acceptabel mismatch program 33, syftar till att mer effektivt undvika vissa oförenligheter i närhet till katalogiserade hotspots.

I sammanfattning var vår ursprungliga studie17 att utforska en antigen matris för påvisande av specifika anti-HLA alloantikroppar personlig design först i sitt slag. Undersökningens fokus låg på genomförbarheten av array utformning och genomförande, som tjänade som en prototyp för potentiella framtida teknik. Vår pilotstudie inte bara genererat uppmuntrande resultat från kliniska prover, men också tillät oss att uppskatta den totala kostnaden och hastighet av testet. Produktionskostnaden för en personlig array i vår nuvarande laboratoriemiljö är under $1000 USD, vilket är en engångskostnad eftersom matrisen kan sedan användas över tiden i upp till 20 rundor av reprobing cykler utan en förlust av prestanda. Det är möjligt att ytterligare testning av protokollet matris med en bredare patientkohorten transplantation ytterligare kommer att effektivisera metoden som kan en dag användas i klinisk praxis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter förklarade.

Acknowledgments

Vi tackar Drs. Shawn Li och Xing Li of Western University i Kanada för deras hjälp med SPOT array produktion. Vi är tacksamma att anställda på Histocompatibility kärnan och på det omfattande Transplant Center av Northwestern universitetet för att tillhandahålla urval tjänster. Detta arbete har stötts delvis genom den extra styrelse av Northwestern Memorial Hospital och en fakultet start fond från Northwestern University till J.J..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptide array INTAVIS Bioanalytical Instruments
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
Non-fat milk Bio Rad Laboratories 1706404
TBST Santa Cruz Biotechnology 10711454001
Goat anti-human IgG–HRP  ThermoFisher Scientific A18811
Clarity Western ECL Substrate Bio Rad Laboratories 1705061
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientifics 21059
ChemiDoc gel imaging system Bio Rad Laboratories 1708265 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. (2017).
  2. Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD--the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
  3. Tait, B. D. Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 21, (5), 573-577 (2009).
  4. Tait, B. D. Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients - Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay. Front Immunol. 7, 570 (2016).
  5. Gebel, H. M., Bray, R. A. HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great? Am J Transplant. 14, (9), 1964-1975 (2014).
  6. Horton, R., et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 5, (12), 889-899 (2004).
  7. Duquesnoy, R. J. HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm. Hum Immunol. 63, (5), 339-352 (2002).
  8. Duquesnoy, R. J., Marrari, M. HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies. Curr Opin Organ Transplant. 14, (4), 403-409 (2009).
  9. Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. Chronic allograft rejection: a fresh look. Curr Opin Organ Transplant. 20, (1), 13-20 (2015).
  10. Rostaing, L. P., Malvezzi, P. HLA-Incompatible Kidney Transplantation--Worth the Risk? N Engl J Med. 374, (10), 982-984 (2016).
  11. Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant. 3, (12), 1488-1500 (2003).
  12. Haas, M. An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts. Curr Opin Organ Transplant. 19, (3), 315-322 (2014).
  13. Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem? Am J Transplant. 15, (4), 855-856 (2015).
  14. Tambur, A. R., Claas, F. H. HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about? Am J Transplant. 15, (5), 1148-1154 (2015).
  15. Robinson, J., et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).
  16. Gabriel, C., et al. HLA typing by next-generation sequencing - getting closer to reality. Tissue Antigens. 83, (2), 65-75 (2014).
  17. Liu, P., et al. A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays. Transplant Direct. 2, (11), (2016).
  18. Frank, R., Overwin, H. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).
  19. Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267, (1), 13-26 (2002).
  20. Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays. J Vis Exp. (93), (2014).
  21. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
  22. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2, (6), 1333-1349 (2007).
  23. McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes. Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).
  24. Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).
  25. Kaczmarek, I., et al. Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant. Exp Clin Transplant. 6, (3), 229-235 (2008).
  26. Claas, F. H. Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies. Curr Opin Organ Transplant. 15, (4), 462-466 (2010).
  27. Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods. Hum Immunol. 77, (4), 313-316 (2016).
  28. Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M. Conformational Biases of Linear Motifs. Journal of Physical Chemistry B. 117, (50), 15943-15957 (2013).
  29. Duquesnoy, R. J. Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity. Curr Opin Organ Transplant. 19, (4), 428-435 (2014).
  30. Lavinder, J. J., et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (6), 2259-2264 (2014).
  31. Kloetzel, P. M. Antigen processing by the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, (3), 179-187 (2001).
  32. Filippone, E. J., Farber, J. L. The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies. J Immunol Res. 2016, 5197396 (2016).
  33. Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome. Transplantation. 78, (2), 190-193 (2004).
Personlig peptid matriser för detektion av HLA alloantikroppar vid organtransplantation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).More

Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter