Avvikelser i humant leukocyt antigen (HLA) sekvenser mellan organdonator och mottagarens par är den största orsaken för antikroppsmedierad avstötning vid organtransplantation. Här presenterar vi användningen av anpassade antigen matriser som baseras på individuella givarnas HLA sekvenser sond mot givaren HLA alloantikroppar i organ mottagaren.
Vid organtransplantation beroende funktion och livslängd av graften kritiskt av framgången för kontroll av immunologisk avstötning reaktivitet mot humant leukocyt antigen (HLA). Histocompatibility riktlinjerna baseras på laboratorietester av anti-HLA immunitet, som presenterar antingen som befintlig eller de novo genereras HLA antikroppar som utgör en större transplantation barriär. Nuvarande tester är byggda på en singel-antigen pärlor (SAB) plattform med en fast uppsättning ~ 100 förvalda rekombinant HLA antigener sond transplantation sera. Hos människor finns det dock en mycket större mängd HLA-typer, med inga två individer än identiska tvillingar som kan dela samma kombination av HLA sekvenser. Även avancerad teknik för HLA-typning och sekvensering kan just fånga eventuella skillnader i DNA-sekvensen mellan en givarens och mottagarens HLA, SAB analysen, på grund av dess begränsade utbud i sekvens representation, är inte exakt upptäcka alloantikroppar mot just de givaren felmatchade HLA. Vi försökt att utveckla en kompletterande metod som använder en annan teknik att upptäcka och karaktärisera anti givare HLA antikroppar på personlig grund. Verktyget screening är en anpassad peptid rad givare HLA-derived sekvenser för avsökning efter transplantation sera hos organ mottagaren att bedöma risken för antikroppsmedierad avstötning. På en matris för en givare-mottagare par, görs upp till 600 unika peptider baserat på givarens HLA proteinsekvenser, varje peptid som medför minst en omaka rester i en 15-amino acid sekvens. I vår pilot experiment att jämföra antigen mönster för före och efter transplantation sera på dessa matriser, kunde vi upptäcka anti-HLA signaler med den resolution som också tillät oss att lokalisera den immun epitoper som är inblandade. Dessa personliga antigen matriser tillåter högupplösta detektering av givare-specifika HLA epitoper vid organtransplantation.
Orgel substitutionsterapi som utförs rutinmässigt över hela världen har räddat miljontals liv. Solida organtransplantationer sker i cirka 100 patienter per miljon invånare i USA årligen, medan ett större antal är fortfarande på väntelistor ta emot donerade organ på grund av svår brist (enligt uppgifter från orgeln Upphandling och Transplantation nätverk – OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Organtransplantation är hårt reglerad för att minska orgel avfall och rädda liv, men de vetenskapliga verktyg som används för att informera dessa förordningar är begränsade i effektivitet. Exempelvis det vetenskapliga samfundet erkänner fullt starkt polymorfa påstår av HLA-molekyler och exakt genetiska tester av DNA använder högupplösta maskinskrivning och sekvens-baserade skriva (SBT) har utvecklats på senare år1, 2. dock alloantikropp testmetoder har ännu inte kunnat producera en stor mängd enskilda HLA sekvenser som antigen sonder. Standardtestet numera använder en oföränderlig panel ~ 100 alleliska antigener som består av vanliga varianter av HLA, A, B, C, DQ, DP och DR sekvenser i mänskliga populationer3,4,5,6. Faktiska givarens HLA sekvenser ingår ofta inte testet på panelen tvingar transplantation läkare och kirurger för att härleda givare-specifika reaktivitet baserat på delade likheter mellan donatorns faktiska sekvenser och motsvarande ”standarder” i den testa set7,8. Följaktligen är det ibland svårt att göra en tillförlitlig uppskattning av avvisande riskbaserad antikropp test resultat9,10,11,12. Nya personligen anpassningsbara tester för alloantikroppar är därför brådskande13,14.
De HLA-generna kodar de stora histocompatibility komplexa (MHC)-receptorer som har en nyckelfunktion i immunsvar6. HLA-gener är kända för att vara de mest polymorfa generna av det mänskliga genom6. På grund av de snabba framstegen inom DNA sekvensering strategier för HLA generna, nya alleliska varianter (eller helt enkelt kallas alleler) upptäcks på en explosiv hastighet15,16. Av mars 2017, 16,755 validerade alleler hade deponerats i IMGT/HLA-databasen (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), av vilka 12 351 var av klass jag och 4.404 var av klass II grupper. I skarp kontrast representeras bara lite över 100 olika alleler i standard single-antigen pärlor (SAB) analysen, som rutinmässigt används för att upptäcka alloantikroppar vid organtransplantation. SAB metoden bygger på en Luminex plattform med hjälp av flödescytometri. Eftersom analysen använder en oföränderlig uppsättning antigener, bortsett från smärre tillverkningssatserna variabilitet i produktionen, kan testet antiserum vara standardiserade kraftfullt mellan individer och mellan laboratorier5. Detta test är dock inte att fånga alla alloantikroppar utvecklat specifikt mot de givaren allelerna, särskilt när givaren sekvenser är frånvarande från SAB set. Även egen produktion av givarnas antigener baserad på sann sekvenser är önskvärt, återstår det tekniska utmaningar i effektivisering nödvändiga produktionen och testförfaranden.
Vi har nyligen beskrivit en alternativ metod i en genomförbarhetsstudie av njurtransplanterade patienter17. Metoden används peptid antigener i formatet array för avsökning före och efter transplantation sera hos enskilda försökspersoner. Varje matris var specialbyggda använder fläck syntes metod18,19,20,21,22,23 som producerar peptid antigener, varje 15 aminosyror i längd, helt baserad på respektive organ givarens HLA-alleler av A, B, C, DQA1, DQB1 och DRB1. SPOT syntes drivs på ett cellulosa membran med standard Fmoc-kemi22 och kan producera hundratals anpassade peptider parallellt med en helautomatisk robotsystem19,21. Arrayen membranet tål flera rundor av strippar och reprobing cykler. I vår retrospektiv studie17upptäckte vi ändringar i antigen mönster med lagrade transplantation antisera samlas i en tidsserie (dvs. före och efter transplantation). Häri beskriver vi det tekniska protokollet för arbetsflödet inklusive array design, tillverkning, antiserum sondering och resultatet analys. Metoden är avsedd för påvisande av alloantikroppar mot specifika linjär epitoper på transplantation givarnas HLA-molekyler.
Utformningen av matrisen plats som beskrivs här är för experimentell studie av alloantikropp specificitet vid transplantation mot organdonators HLA antigener. I motsats till den befintliga SAB-analysen i stort sett används i kliniken, har antigen array metoden en stor fördel i sin flexibla design som rymmer de Sant HLA sekvenserna av enskilda givare. Den nya plattformen utnyttjar potentialen av de snabbt framryckande DNA sekvensering teknik som snart kommer att kunna producera korrekta HLA alleliska sekvens avläsni…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Drs. Shawn Li och Xing Li of Western University i Kanada för deras hjälp med SPOT array produktion. Vi är tacksamma att anställda på Histocompatibility kärnan och på det omfattande Transplant Center av Northwestern universitetet för att tillhandahålla urval tjänster. Detta arbete har stötts delvis genom den extra styrelse av Northwestern Memorial Hospital och en fakultet start fond från Northwestern University till J.J..
Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
Non-fat milk | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
Goat anti-human IgG–HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
ChemiDoc gel imaging system | Bio Rad Laboratories | 1708265 |