Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Personlig peptid Arrays for påvisning af HLA Alloantibodies i organtransplantation

doi: 10.3791/56278 Published: September 6, 2017

Summary

Uoverensstemmelser i human leukocyt antigen (HLA) sekvenser mellem organdonor og modtagende par er den største årsag til antistof-medieret afvisning i organtransplantation. Her præsenterer vi brugen af brugerdefinerede antigen arrays, der er baseret på individuelle donorer HLA sekvenser at sonde anti-donor HLA alloantibodies i orgel modtagere.

Abstract

I organtransplantation stole funktion og lang levetid af graften kritisk på succesen af kontrollerende immunologiske afvisning reaktivitet mod menneskets leukocyt antigen (HLA). Histocompatibility retningslinjer er baseret på laboratorieundersøgelser af anti-HLA immunitet, der præsenterer enten som præ-eksisterende eller de novo genereret HLA antistoffer, der udgør en større transplantation barriere. Aktuelle prøver er bygget på en single-antigen perler (SAB) platform ved hjælp af et fast sæt af ~ 100 forudvalgt rekombinant HLA antigener for at afprøve transplant sera. Men, hos mennesker der findes en langt større vifte af HLA typer, med ingen to personer identiske tvillinger, der kan dele den samme kombination af HLA sekvenser. Mens avancerede teknologier til HLA skrivning og direkte sekvensering kan netop fange eventuelle uoverensstemmelser i DNA sekvens mellem en donor og modtagerens HLA, SAB assay, på grund af dens begrænsede udvalg i sekvens repræsentation, ikke er i stand til at præcist registrere alloantibodies specielt mod donor HLA uoverensstemmelser. Vi forsøgte at udvikle en supplerende metode bruger en anden teknologi til at opdage og karakterisere anti-donor HLA antistoffer på personlig basis. Værktøjet screening er en brugerdefineret peptid vifte af donor HLA-afledte sekvenser for sondering efter transplantation sera af orgel modtageren til at vurdere risikoen for antistof-medieret afvisning. På en enkelt array for et giver / modtager par, er op til 600 unikke peptider foretaget på grundlag af donors HLA protein sekvenser, hver peptid transporterer mindst én uoverensstemmende rester i en 15-amino syre sekvens. I vores pilotforsøg at sammenligne antigen mønstre for før og efter hårtransplantation sera på disse arrays, var vi i stand til at opdage anti-HLA signaler med den beslutning, som også tilladt os at lokalisere den immun epitoper, der er involveret. Disse personlige antigen arrays tillade høj opløsning påvisning af donor-specifikke HLA epitoper i organtransplantation.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Orgel substitutionsbehandling, der rutinemæssigt gennemføres i hele verden har reddet millioner af menneskeliv. Solid organtransplantation forekommer i ca. 100 patienter pr. million indbyggere i USA hvert år, mens et større antal stadig er på ventelister til at modtage donor organer på grund af alvorlige forsyningsmangel (ifølge oplysninger fra orglet Udtagning og Transplantation netværket - OPTN/Uno: optn.transplant.hrsa.gov). Organtransplantation er stærkt reguleret for at reducere orgel affald og redde liv, men de videnskabelige værktøjer bruges til at informere disse forordninger er begrænset i effektivitet. For eksempel er det videnskabelige samfund anerkender fuldt ud de meget polymorfe stater af molekyler, HLA og nøjagtige genetiske tests af DNA ved hjælp af høj opløsning maskinskrivning og sekvens-baseret skrive (SBT) er blevet udviklet i de seneste år1, 2., alloantibody testmetoder har endnu ikke stand til at producere de mange forskellige individuelle HLA sekvenser som antigen sonder. Den standard test i dag bruger en uforanderlig panel af ~ 100 allel antigener, der er sammensat af almindelige varianter af HLA, A, B, C, DQ, DP og DR sekvenser i befolkningsgrupper3,4,5,6. Ofte, den faktiske donor HLA sekvenser er ikke inkluderet i panelet test, tvinger transplantation læger og kirurger til at udlede donor-specifikke reaktivitet baseret på delte ligheder mellem donor's faktiske sekvenser og tilsvarende "standarder" i den test sæt7,8. Det er derfor, nogle gange udfordrende at foretage et pålideligt skøn over afvisning risikobaseret antistof test resultater9,10,11,12. Nye personligt tilpasselig tests for alloantibodies er derfor tvingende nødvendige13,14.

HLA-gener indkode store histocompatibility complex (MHC) receptorer, der har en nøglefunktion i immunrespons6. HLA gener kendt for at være de mest polymorfe gener af det menneskelige genom6. På grund af de hurtige fremskridt i DNA sekventering strategier for HLA-gener, nye allel varianter (eller blot benævnt alleler) bliver opdaget på en eksplosiv hastighed15,16. I marts 2017, 16,755 validerede alleler havde deponeret til IMGT/HLA-databasen (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), af hvilke 12,351 blev af klasse og 4,404 var af klasse II grupper. I skarp kontrast, er kun lidt over 100 forskellige alleler repræsenteret i standard enkelt-antigen perler (SAB) assay, der rutinemæssigt anvendes til at registrere alloantibodies i organtransplantation. Metoden SAB er bygget på en Luminex platform ved hjælp af flowcytometri. Eftersom analysen udnytter et ufravigeligt sæt af antigener, bortset fra mindre batch til batch variabilitet i produktion, kan antiserum test standardiseret håndfast, på tværs af individer og laboratorier5. Denne test er imidlertid ikke i stand til at fange alle alloantibodies udviklet specifikt mod donor alleler, især når donor sekvenser er fraværende fra SAB sæt. Selv om brugerdefinerede produktion af donorernes antigener baseret på sande sekvenser er ønskelig, fortsat der tekniske udfordringer i strømline den nødvendige produktion og testprocedurer.

Vi beskrev for nylig en alternativ metode i en gennemførlighedsundersøgelse af renal transplantation fag17. Metoden anvendes peptid antigener i en array format til sondering før og efter transplantationen sera af enkelte fag. Hver matrix var brugerdefineret bygget ved hjælp af SPOT syntese metode18,19,20,21,22,23 , producerer peptid antigener, hver 15 aminosyrer i længden, udelukkende baseret på de respektive organdonor HLA alleler af A, B, C, DQA1, DQB1 og DRB1. SPOT syntese drives på en cellulose membran ved hjælp af standard Fmoc-kemi22 og kan producere hundredvis af brugerdefinerede peptider parallelt med en fuldt automatiseret robotsystem19,21. Matrixen membran kan modstå flere runder af stripning og reprobing cykler. I vores retrospektiv undersøgelse17registreret vi ændringer i antigen mønstre med lagrede transplantation antisera indsamlet i en tidsserie (dvs. før og efter transplantation). Heri beskriver vi de teknisk protokol for den arbejdsproces, herunder array design, fremstilling, antiserum sondering og resultat analyse. Metoden er beregnet til påvisning af alloantibodies mod specifikke lineære epitoper på transplantation donorernes HLA molekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt ved Northwestern University institutionelle Review Board (IRB protokol #: STU00104680). En overordnet arbejdsproces i protokollen er illustreret i figur 1.

1. Bioinformatic analyse af Donor og Recipient HLA sekvenser

  1. hente sekvenser fra IMGT/HLA database 15.
    1. Få HLA skrive rapporter organdonor og hans/hendes recipients.
      Bemærk: Sikre passende procedurer til at beskytte fortrolige lægejournaler udnyttes. Typisk, en institutionel Review Board (IRB) godkendelse af undersøgelse protokol eller de eksperimentelle test kræves pr. institutionelle IRB retningslinjer. Hvis HLA rapporter fra PCR-baserede at skrive (af enten høj eller lav opløsning) eller sekventering-baseret skrive (SBT), gå direkte til trin 1.1.3. Hvis sekvenser blev indhentet fra genomisk/HLA sekventering, og hvis de er komplet, direkte brug af disse sekvenser i stedet. Lejlighedsvis, når kun ufuldstændig maskinskrivning eller sekventering resultater er tilgængelige, Følg de ekstra trin 1.1.2. tildele de " mangler " alleler via værktøjet beskrevet taktfast 1.1.2.
    2. Åbn den tvetydige allel-kombinationer efter web link - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html, og søge ved hjælp af den “ tvetydige allel kombinationer søgeværktøj ” funktion til at hente de hypotetiske alleler. Derefter fortsætte til trin 1.1.3. at indtaste navnet allel.
    3. Åbne formen IMGT/HLA-allel forespørgsel på følgende web-link - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html og input emne ’ s allel navne (hver enkeltvis, som vist i figur 2) i den “ søgning for ” boks. Klik på den “ søgen efter alleler nu ” knappen. HLA allel navne skal bruge standard navngivning systemer (dvs., A *, A * 01, A * 01:01:01:01, og eventuelle tidligere betegnelser som A * 01010101).
    4. Finde matchende allel navnet vises på skærmen. Klik på knappen allel.
    5. Kopi af " Protein sekvens ", og indsætte det i et tekstdokument nedenunder en overskriftslinje af " > allel navn ". Effektivt, tekstdokument er i en FASTA (FAST-All) format af allel navn og sekvens.
  2. Udføre gen-baserede flere tilpasninger af donor og recipient/patienten alleler.
    1. 1-genet (dvs. DQB1 * 03:01:01:01) ad gangen, kopiere og indsætte alle fire alleler af donor og patient FASTA-sekvenser (to fra donor) og to fra patienten i et kombineret tekstdokument. På dette tidspunkt, er det vigtigt at varierende betegne donor allel navne fra patient allel navne (indstillinger omfatter differentieret brug af øvre vs lavere tilfælde; eller oprette en karakteristiske præfiks eller suffiks udvidelse til hver allel navn til separat markering donor vs. patient alleler). Input rækkefølgen af sekvenser er ikke vigtigt, fordi efter justering ordren vil være blandes efter niveauer af ligheden mellem et par sekvenser.
    2. Kopiere og indsætte sekvenser i FASTA format (som det ses i figur 3) fra oven i den “ indtaste dit input sekvenser ” boks på webstedet klynge Omega: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
    3. Klik på " sende din opgave " ved hjælp af standard indstillinger af parametre: såsom " PROTEINŔ og " Clustal m / tal ". Udføre justering ved at klikke på " Send ". En tilpasning af de fire sekvenser vises på skærmen ( figur 4).
  3. Mark donor-specifikke mismatchproblemer.
    Bemærk: Specielt bemærkes at allel sekvenser givet her var baseret på resultaterne af HLA at skrive, ikke sekvensering. Derfor er der en risiko for at relevante sekvens variation i den særlige donor-modtager par kan blive savnet. Dette potentielle problem vil blive mildnet som mere og mere transplantation Centre vedtage nøjagtige høj opløsning at skrive og direkte DNA-sekventering.
    1. Afskrift og opklæbe justering teksten i et tekstdokument og oprette et nyt dokument. Hvis formatet af filen justeret forstyrres, lave format ved at ændre skrifttype og størrelse: Brug altid " Courier New " skrifttype i små type størrelse til at passe rækkerne. Gem dokumentet efter de formatering problemer er løst.
    2. Inspicere manuelt justeret sekvenser for at identificere alle uoverensstemmende rester, der hører entydigt til donoren. Markere hver af disse donor-specifikke restkoncentrationer ved hjælp af et kodenummer skriftfarve.
    3. Fremhæve alle bogstaverne i donor ' s sekvenser at udvide 14 restkoncentrationer både op - og nedstrøms for de markerede donor-specifikke mismatchproblemer (beregnes som 15 aminosyre peptid minus 1 rester af misforholdet).
  4. Udlede 15-mer peptid sekvenser i en overlappende serien.
    Bemærk: Årsagen til at vælge 15-mer peptider var baseret på den generelle viden om typiske epitoper bliver 4-9 aminosyrer i længden. Derfor, når vi har anvendt en " bevægelige vindue " procedure med et trin størrelse af 4 aminosyrer ( figur 1), vores udvalg af 15 aminosyre længde forlod en 15-4 = 11 aminosyre overlapning mellem alle tilstødende peptider i en serie. I teorien, denne 11 aminosyre overlapning er tilstrækkelig til at dække alle immun epitoper af op til 9 aminosyrer i længden, så at ingen epitop bliver uforvarende " opdelt " i halvdelen med kun delvise sekvenser på arrayet.
    1. Bruger de understregede sekvenser, så skabeloner til sekventielt udlede kort 15 aminosyre-sekvenser i en serie, der overlapper af 4 restkoncentrationer mellem de to umiddelbart tilstødende sekvenser i serien.
    2. Kopiere og indsætte disse 15 aminosyresekvenser ind i et regneark ( figur 5) i kolonneformat ledsaget af notation kolonner, der omfatter de tilsvarende navne på donor alleler. En ekstra kolonne til også at omfatte aa rester holdninger kan være nyttige.
  5. Gentag trin fra 1.1.3. til 1.3. for hver HLA allel (dvs., A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 og DP) af donor og recipient parret at udlede de 15 aa korte sekvenser af donor.
  6. Kopiere og indsætte alle kolonner i en master regneark til at skabe en lang kontinuerlig kolonne i alle de 15 aa sekvenser fra alle alleler af donor. Nedskrive det samlede antal rækker (for peptid sekvenser) i dokumentet.

2. Design af Custom Array Layout og produktion

  1. Generer et regneark med peptid sekvenser med tilsvarende allel kaldelser. Matrixen har 20 rækker og 30 kolonner og kan rumme op til 20 x 30 = 600 steder for peptider. Afhængigt af det samlede antal peptider registreres i trin 1,5 fra én bestemt donor, og baseret vores tidligere erfaringer med to eksempler, at vi havde forsøgt i Liu mfl. 17, 600 spot array kan holde alle de sekvenser, der er genereret fra ~ 2 separate transplantation tilfælde.
    1. Rationelt planlægge de mest efficient måde at passe sæt af peptider inden for 600-spot format af matrixen.
    2. Hvis mere end ét emne kan passe ind i en hel vifte, indsætte tomme rækker efter den første donor ' s sekvenser til at matche det samlede antal rækker, der kan være opdelt på 30 (antallet af Steder i træk på arrayet).
    3. Umiddelbart efter den sidste tomme række for det første sæt af sekvenser, indsætte i hele kolonnen sekvens indhold fra den anden transplantation sag.
    4. Gentage disse trin indtil array er fyldt og ingen flere tilfælde kan tilføjes uden at overskride de 600 steder. Hvis hele tomme rækker er overladt til at fylde forneden, " flytte " den tomme række skal placeres mellem to donor-sæt. Denne brede plads tilbage mellem tilfælde gør skæring af membran efter afslutningen af syntesen lettere - efter trin 3.2. nedenfor.
  2. Program peptid sekvenser i forbindelse med array layout. Programmet for SPOT synthesizeren tager et tekstformat sekvenser (én række et peptid sekvens), der direkte kan opnås ved at gemme den resulterende regneark fra trin 2.1.4 som en simpel tekstdokument (uden de ekstra kolonner til allel navne, aa positioner etc.).
  3. Kør automatiseret peptid array syntese via SPOT synthesizer. Hele operationen af syntesen er detaljeret i Kudithipudi et al., 21. Bemærk at Fmoc syntese af to matrixer tager ~ 4-5 dage.

3. Sonden og Reprobe Antisera fra en tidsserie af en individuel Transplant modtageren.

Bemærk: 600-spot membran matrix har dimensioner ~ 7 cm x 13 cm. Efter syntese, kan arrays opbevares ved stuetemperatur som tør membraner i mindst to år, når skærmet mod direkte lys. Undgå overdreven foldning af membran til at bevare sine levetid til gentagen brug.

  1. Rehydrere membran array med ethanol og visualisere peptid steder farvet med Ponceau S.
    1. Rehydrere membranen array transporterer peptider efter en trinvis procedure optimeret i Li et al. 24.
      1. fordybe array membran i 20 mL 100% ethanol.
      2. Tilføj 20 mL destilleret vand for at fortynde løsningen til 50% ethanol og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.
      3. Ændre fordybelse løsning til 40 mL 100% vand tre gange og Inkuber 15 min hver time.
      4. Vask i en korrekt fungerende buffer, fx 20 mL af TBST (Tris-bufferet saltvand med 0,1%), tre gange i 5 min.
    2. Ponceau S farvning af matrixen til at visualisere syntetiske peptider
      1. tilsættes 20 mL færdigformulerede Ponceau S direkte til matrixen hydreret og Inkuber i ~ 30 s med rysten.
      2. Køre destilleret vand kontinuerligt over membran til at fjerne pletten baggrund Ponceau S farve. Under processen, peptid pletter af rød farve kan synliggøres.
      3. Separate dele af array for hver donor ved at forsigtigt skære mellem afsnittene i matrixen for enkeltsager. Markere retningen for hver matrix.
  2. Før blok array.
    1. Blok membran i 20 mL 5% fedtfrit mælk opløst i TBST buffer. Denne mælk-baseret løsning vil yderligere de pletter Ponceau S farve. Erstatte mælk buffer flere gange for at opnå de klareste peptid billeder.
    2. Henblik på registrering, tage et foto af Ponceau S billede af matrixen ved hjælp af en håndholdt kamera (eksemplet i figur 6).
    3. Fortsæt blokering af membranen i 5% fedtfrit mælk ved 4 ° C natten over eller ved stuetemperatur for 2 h med vuggende.
  3. Incubate array med transplantation antiserum.
    Bemærk: Det bør bemærkes, at et fænomen kendt som prozone eller krog effekt kan skyldes komplement-afhængig indblanding i serum antistof analyse. For at omgå dette problem, kan en valgfri serum forbehandling trin betragtes med enten EDTA eller varme inaktivering af serumprøver.
    1. Fjerner blokerende buffer og vaske membran med 20 mL af TBST tre gange den næste dag i 5 min hver time.
    2. Tilføje 20 µL af den rå serum af modtageren til 20 mL 2,5% mælk i TBST buffer og inkuberes med membran i 2-3 timer ved stuetemperatur. Bemærk, at i denne første runde af sondering, anbefales det at sidste efter transplantation serum (eller sandsynligvis mest overfølsomme over serum) i tidsserierne bruges først. Dette er baseret på den antagelse, at tidligere enheder i serien, især fra en forudgående tid point, har mindre udvalg af alloantibodies, der har tendens til at udvikle sig over tid. Denne måde, enhver mulighed for signal interferens fra " fremførsel " mellem sondering runder kan være let kendelige fra virkelig udviklede alloantibody reaktivitet på grund af immunrespons mod graften.
  4. Vaske matrixen ved hjælp af 20 mL af TBST og inkuberes med sekundær antistof.
    1. Vaske membran tre gange i 10 min hver time.
    2. Incubate med gede-anti-humant IgG-HRP (peberrodsperoxidase) sekundær antistof ved 1:10,000 fortynding i TBST buffer suppleret med 1% mælk til en anden 2 h.
  5. Vask og udvikle skamplet.
    1. Vaske membran tre gange med TBST i 10 min hver time.
    2. Udføre forbedret kemiluminescens (ECL) med 5 mL af luminol løsning frisk blandet med 5 mL af peroxid løsning at udvikle membran (til 1 min).
    3. Visualisere ECL signaler ved hjælp af en egnet imager (dvs. ChemiDoc Imaging Systems eller Azure C600).
  6. Scan og kvantificere skamplet.
    1. Gemme de udviklede billeder ( figur 7, nederste billede) og udføre kvantificering af spot intensitet.

4. Sammenlign Antiserum reaktivitet på tværs af en klinisk tidsserie.

  1. Strip array.
    1. På dette punkt, holde membranen våd på alle tidspunkter.
    2. Strip membranen af inkubere med 20 mL af kommercielle stripping buffer ved 37 ° C i 20 min., og derefter vaske membran med TBST tre gange i 10 min. Gentag derefter blokerende (trin 4.2) og dybdeborende (skridt 4.3) foranstaltninger ved hjælp af en anden serum patientens taget på et andet tidspunkt.
  2. Blok strippet membran.
    Bemærk: Efter stripning, membranen kan genbruges til en anden runde af sondering af en anden serum fra den samme patient i en tidsserie.
    1. Blokere membranen bruger 5% mælk buffer som før (Se trin 3.2).
  3. Reprobe en anden antiserum fra samme tidsserien (Gentag trin fra 3,3-3,6; eksempel på figur 7, øverste billede).
    Bemærk: De afisolerede array kan derefter bruges til at reprobe en anden serum modellen. Da peptider er kovalent konjugeret til understøttende matrix af membranen, viste vi at arrayet kan genbruges til op til 20 runder af stripning og reprobing cykler uden at miste sin performance.
  4. Langtidsopbevaring af arrays.
    1. Butik membran i TBS buffer suppleret med 0,02% w/w natriumazid som konserveringsmiddel. Bruge en forseglet plasticpose til langtidsopbevaring. Ved 4 ° C under beskyttelse mod direkte lys, våde membranen kan opbevares i mindst 2 år.

5. Dataopsamling og analyse

  1. manuelt anmærke positiv antigen peptider.
    1. Find steder viser positive antistof signaler og bestemme hver af deres grid positioner.
    2. Fremhæve de tilsvarende rækker i hovedregnearket for de positive peptider.
  2. Hente peptid sekvenser i hovedregnearket ( figur 7, nederste liste). Ifølge design princippet skitseret i trin 1.4.1., nærliggende seriel steder dele betydeligt overlappende sekvenser (15-4 = 11), derfor reaktiv epitoper kan deles af peptider i en fortløbende serie.
    1. Fremhæve enhver positiv steder forekommer i arvesagen.
  3. Bestemme minimum epitop længde for hver peptid i en serie.
    1. Highlight ethvert potentielt delte epitop sekvenser baseret på overlappende segmenter af reaktive peptider.
  4. Strukturelt model antigen epitoper.
    1. Få prototype HLA krystal strukturer fra Protein Data Bank fundet på følgende web-link: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
    2. Display prototype HLA struktur i Pymol (download fra www.pymol.org).
    3. Kort " eller model opdagede anti-donor epitoper prototype HLA molekyler 3D strukturer ved at fremhæve de reaktive peptid sekvenser ( figur 8). Klik på " skærm ", derefter " baggrund ", og vælg " hvid ". Hvis du vil gemme billedet, gå til " fil " og " Gem billede som " og vælg filformatet " png ".
  5. Rapportere resultater og tildele de tilsvarende alleler reaktive epitoper.
  6. Sammenlign array resultater til single-antigen perler (SAB) resultaterne, hvis tilgængelig.
    Bemærk: SAB test ved hjælp af enkelt allel antigener måler antistof reaktivitet mod et fast panel af HLA proteiner. Enkelte peptider, der viser antistof reaktivitet tilhører visse HLA alleler, der, hvis også inkluderet i panelet SAB tillade direkte sammenligning mellem array og SAB resultater. Vores tidligere undersøgelse 17 viste en høj grad af korrelation mellem resultaterne, hvilket tyder på at peptid epitoper bidrage væsentligt til den samlede reaktivitet af SAB. Derudover afsløre array resultater også aminosyre-niveauer af specificitet.
    1. Hent SAB resultater fra en HLA lab, som indeholder oplysninger om, hvorvidt og hvilke donor alleler er reaktiv at efter transplantationen sera af patienten. Resultater fra trin 5.5. baseret på matrixen analyse giver også oplysninger om tilsvarende donor alleler positiv for alloantibody reaktivitet.
    2. Sammenligne SAB og array resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I den oprindelige undersøgelse ved hjælp af matrixen screening metode17, indskrevet vi ialt 5 nyrer transplant emner. Vi opnåede HLA at skrive resultatet af vores kohorte og deres respektive donorer. Deres sygehistorie og allel antistof titers fra SAB tests var også tilgængelige for os. I vores pilot-undersøgelse af disse 5 patienter, vi udtænkt to forskellige metoder: en standard array, består af et fast panel af peptider og personlig arrays, der var skik lavet for hvert tabelpar, donor og recipient. Mens den første metode havde tilladt os at teknisk validere udførelsen af array platform for at opnå høj grad af specificitet i individuelle transplantationer, er personlig protokollen for sidstnævnte metode beskrevet i denne artikel og video bestemt for omfattende screening af donor-specifikke antistoffer (DSA), som ofte korrelerer med dårlig graft resultater5,25,26.

De personlige arrays blev anvendt til to af de fem tilfælde17, og til at illustrere den overordnede arbejdsgang af metoden, vi fokusere her på en af disse to patienter (nemlig PTN #4). Den centrale teknologi til at gøre brugerdefinerede peptid array indebærer SPOT synthesizer. Det er en fuldt automatiseret robot system, der gør peptider ved hjælp af Fmoc syntese direkte på et specielt afledte cellulære matrix på en membran (figur 1). Vi udnytter fleksibiliteten af synthesizer til at samle store sæt af peptider afledt af individuelle organdonorer HLA sekvenser. For at få tilstrækkelig dækning til at undgå en situation, når en kontinuerlig epitop er at "split" og mister antistof reaktivitet, fulgte vi en "walking" design af serielle peptider har 15-4 = 11 rester af overlapning mellem enhver umiddelbart tilstødende peptider, så at serien altid er tilstrækkelig til at dække den typiske længde af antistof epitoper skønnes for at være 4-9 aa i længde (figur 1).

Skabelon HLA sekvenser var direkte hentet fra lageret databasen vedligeholdes på EMBL-EBI (det europæiske Bioinformatik Institut). Som et eksempel, PTN #4 donor's HLA-DQB1 * 03:01:01:01 allel var søgte efter (webside illustration i figur 2). Sammen, vi separat hentede sekvenser for donors anden HLA-DQB1 allel af * 02: 01:01, samt de af PTN #4 selv, HLA-DQB1 * 04:02 og * 05:01. Flere sekvens justering blev derefter udført ved hjælp af Clustal Omega web funktioner (figur 3). Den deraf følgende tilpasning fil blev opnået (figur 4), fra som alle uoverensstemmende aminosyrerester blev identificeret (donor's rester er fremhævet). Næste, vi markerede skabelon sekvenser (understreget) af den donor, der var tilstrækkelig lang til at dække alle hans forkerte restkoncentrationer. Baseret på disse skabelon sekvenser og følge en "walking" design som beskrevet ovenfor, tre serier af peptider hver 15 aa i længden blev udledt for HLA-DQB1. Denne proces blev gentaget til resten af donorens alleler af HLA-A, B, C, DQA1 og DRB1 (DRA1 og DP blev udelukket på grund af utilgængelighed på den relevante kliniske post) i forhold til de tilsvarende alleler af sin modtager. I slutningen, 202 peptider alt var hyret til at lave array (peptid sekvenser i et regneark i figur 5 og en array illustration i figur 6) specielt til sondering PTN #4 efter transplantation serum, og sammenlignet resultaterne med dem, der opnås fra en efterfølgende reprobing af hans forudgående serum (figur 7). Ud af de 202 peptider, ialt 10 viste antistof signaler tilknyttet efter transplantation modellen som donor-specifikke restkoncentrationer (uoverensstemmende fra modtageren) E87, I306, W243 og K197 af HLA-B * 52:01, -B * 52:01, -C * 03:04 og -DQA1 * 05:01 syntes at være involveret i ansporer antistof reaktivitet (rester angivet i røde bogstaver i figur 7).

Derudover er en af de vigtigste fordele ved metoden array i forhold til den traditionelle SAB test at epitop oplysninger kan indhentes let, som vist i figur 7. Vi sammenlignede den antistof-reaktiv epitoper på HLA-DQA1 og -DQB1 fra alle fem patienter (fra separat array resulterer i Liu et al. 17) ved at have dem alle modelleret til en co krystalstruktur af DQA1 og DQB1 heterodimer (figur 8). Det er opmuntrende, er en fremtrædende segment i strukturen kendt som B1 strand et "hotspot", der havde en langt større chance (3/5 i patienter 2,3,5) at blive ramt af alloantibodies blandt transplantation emnerne i de 5 sag kohorte.

Figure 1
Figur 1 . Den samlede ordning af HLA-baserede antigen array metode til påvisning af anti-donor HLA alloantibodies i orgel modtagere. (Tilpasset og ændret fra Liu et al. 17) venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Data repository hjemmeside
For at hente HLA sekvenser, gå til følgende websted: http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html
Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Flere protein sekvenser justering af donor vs modtageren HLA-DQB1 alleler benytter Clustal Omega web-baseret værktøj.
Kopier og Indsæt sekvenser af patient #4(PTN#4) DQB1 * 0201 og 03:01, og donor's DQB1 * 04:02 og 05:01 i FASTA format til http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (For illustration, DQB1 * 05:01 af PTN #4 og DQB1 * 03:01 af donoren er vist i input-feltet) . Vælg indstillingen "Clustal m / tal" i "Trin 2" for output-format og køre justering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Sammenligning afdonor vs patienten/modtageren HLA DQB1 og valg af skabelon sekvenser for peptidsyntese.
Donorens sekvenser er i fed, med donor-specifikke uoverensstemmelser i rød skrift, og også fremhævet med sorte bokse. Skabelon sekvenser (understreget) for der følger peptider indeholder disse donor-specifikke restkoncentrationer. (Dette tal blev tilpasset og ændret fra Liuet al. 17) venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Et illustrerende eksempel på hovedregnearket i et regneark med donor HLA peptider.
Peptid position på matrixen angives ved hjælp af række vs kolonne koordinater. Peptid sekvenser er bruges til at programmere syntese ved hjælp af robot SPOT synthesizer. Donor-specifikke restkoncentrationer (uoverensstemmende fra modtagerens tilsvarende alleler) er fremhævet med fed og understreget. Start- og slutpositioner af peptid svarende til fuld længde HLA-DQB1 sekvenser er også angivet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 . Billede af en array afsnit farvet med Ponceau S
Bemærk forskellen i farveintensiteten på grund af forskellen i aminosyresammensætning blandt peptider, mens peptid koncentrationer blandt alle spot områder er de samme. (Billedet er et illustrerende eksempel, ikke den ene fra denne faktiske undersøgelse.) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 . Donor-specifikke HLA-A, B, C, DQ, DR array undersøgelse af uoverensstemmende epitoper i PTN #4.
Seriel peptider var afledt af donorens sekvenser til at dække uoverensstemmende restkoncentrationer (et eksempel på DQB1 i figur 4). Matrixen blev brugt til at probe efter transplantation serum (lavere skamplet: post-TX) og efterfølgende en forudgående serum (øvre skamplet: pre-TX) fra den samme patient. De fire sæt af stærk steder fra efter transplantation sondering er markeret med røde streger (i den nedre skamplet), mens to medium intensitet steder, som var kun knyttet til før transplantationen serum er markeret med blå linjer (i den øverste skamplet). Den nederste tabel viser de tilsvarende peptid sekvenser og deres reaktivitet til efter transplantation serum. Donor-specifikke (forkerte) restkoncentrationer E87, I306, W243 og K197 af deres respektive alleler er med røde bogstaver og peptider viser stærk antistof reaktivitet er i fed skrifttyper. Dette tal blev tilpasset og ændret fra Liu et al. 17. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8 . Strukturelle placeringer af HLA-DQ epitoper.
Co krystalstruktur af HLA-DQ8 blev brugt som en skabelon. Strukturen bestod af en DQA1 og en DQB1 subunits sammen med en antigen peptid (A). Sekundære proteinstrukturer af α-helices og β-tråde er vist i panelet (B). DQA1 og DQB1 peptider, der reagerede med enten en af de fem serum blev placeret på fælles krystalstruktur (i A og i B: skygge i blå). Tre β-tråde, B1, β6 og β12 (mørk blå i B), hver repræsenteret ved flere peptider (korte røde linjer svarer til de lineære aa positioner i DQA1), reagerede med flere patienter prøver (oprindelige resultater i Liu et al. 17). alle seks DQB1 peptider (i fed skrift) reaktiv til antistoffer hos patienter #2 #3 #5 er placeret til B1 "hotspot" segment ( b: pegede på den røde pil). Dette tal blev tilpasset fra Liu et al. 17. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Design af matrixen SPOT beskrevet her er for eksperimentel undersøgelse af alloantibody specificitet i transplantation mod en organdonor HLA antigener. I modsætning til den eksisterende SAB assay bredt brugt i klinikken, har antigen array metode en stor fordel i sin fleksible design, der kan rumme de sande HLA sekvenser af den enkelte donor. Den nye platform udnytter potentialerne af den hastige teknologiske DNA-sekventering teknologi, der vil snart være i stand til at producere præcise HLA allel sekvens aflæsninger uden tvetydighed16,27 og potentialet i udpegede databaser for repository sekvenser HLA15 i den globale befolkning. Vores nuværende array-screening protokol blev udviklet baseret på succesen med flere pilotundersøgelser af transplantation sera. Her bør vi understrege, at vores prototype arrays på dette stadium, er konstrueret til forskning brug, ikke for diagnostiske programmer i klinisk praksis.

En anden bemærkelsesværdig forskel SAB og vores antigen array er, at sidstnævnte har en højere opløsning til at skelne mellem potentielle antigen epitoper inden for de 15 aa segmenter af HLA sekvenser, som kunne give værdifulde oplysninger om alloantigenicity18 . Men i modsætning til SAB, der præsenterer hele protein antigener for at tilpasse deres foldede strukturer, matrixen antigen kun inkorporerer kort peptider, som udelukker oplysninger om konformationel foldning. Derfor arrays kan ikke påvise antistoffer, der kun genkende konformationelle epitoper, som nogle mener udgør et flertal af alle funktionelle epitoper, der er relevante for antistof medieret afvisning28,29. Stadig, i andre sammenhænge, antistof aktioner mod lineær epitoper, som dem i korte peptider, bliver udnyttet i virusantigen svar og i vaccine design30,31. Vi bør også bemærke, at i det begrænsede antal patientprøver testet, følsomhed detektionsegenskaberne af vores array oversteg SAB og tilladt registrering af donor-specifikke antistoffer før17 under klinisk progression af antistof-medieret afvisning. Dette er på grund af den høje molære koncentration af lokale antigen peptider på matrix i forhold til SAB. Denne funktion var især nyttigt i tilfælde hvor SAB opdaget ingen reaktivitet mens kliniske og patologiske beviser af antistof-medieret afvisning var tilsyneladende, som vi viste tidligere17. Det er dog vigtigt at påpege, at denne personlige test er mere tidskrævende end den standard SAB test. Array-test kræver, at få orglet donorens og (foreslåede) modtagerens HLA sekvenser inden du starter designet af antigen peptider. Derefter tager det flere dage at producere array og en anden 7-8 timer at opnå antistof resultater. Den langvarige procedure er derfor ikke egnet til afdød donor transplantation, medmindre Hovedformålet med antistof-test er til bestemmelse af fremkomsten af donor-specifikke antistoffer efter transplantation i stedet for en forudgående evaluering af eksisterende antistoffer.

Metoden array havde en væsentlig forbedring af den eksisterende SAB test i opsporing af antigen epitoper. Desuden, vi gjorde et forsøg på at knytte reaktive epitoper i fem transplantationspatienter til en skabelon struktur af HLA-DQ, hvor vi bemærket mindst én fremtrædende "hotspot" epitop i sin B1 strand, der fandt sted i tre ud af fem patienter17. Intriguingly, er B1-grene af HLA-DQA1 og -DQB1 placeret i rillen af antigen-præsentation konkave (figur 8), en placering, der er kendt for at være antigene i forbindelse med transplantation afvisning32. Vi forventer derfor, at fremtidige udforskning af vores personlige antigen array metode i udvidet transplantation kohorter vil give værdifuld indsigt på antigene hotspots i HLA molekyler. Et katalog af disse identificerede hotspots, når sammenholdes med meget præcise DNA sekventering typning af HLA-gener mellem potentielle donorer og modtagere, vil i sidste ende hjælpe en forudgående beslutninger gennem acceptable uoverensstemmelse programmer 33, beregnet til mere effektivt undgå visse uoverensstemmelser i nærhed til katalogiserede hotspots.

I Resumé var vores oprindelige undersøgelse17 i at udforske den personlige design af et antigen array til påvisning af specifikke anti-HLA alloantibodies først af sin art. Undersøgelsens fokus var på gennemførligheden af array udformning og gennemførelse, som fungerede som en prototype for potentielle fremtidige teknologi. Vores pilotundersøgelse ikke kun genereret opmuntrende resultater fra kliniske prøver, men også tilladt os at vurdere de samlede omkostninger og hastigheden af testen. Produktionsomkostningerne i forbindelse med en personlig array i vores aktuelle laboratorium indstilling er under $1.000 USD, hvilket er en engangs-omkostninger, da arrayet kan derefter bruges over tid i op til 20 runder af reprobing cykler uden tab af ydeevne. Det er muligt, at yderligere afprøvning af array protokol med en bredere kohorte af transplantation fag yderligere vil strømline den metode, der kunne en dag anvendes i klinisk praksis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi takker Drs. Shawn Li og Xing Li fra Western University i Canada for deres venlige assistance med SPOT array-produktion. Vi er taknemmelige for ansatte i kernen Histocompatibility og på den omfattende hårtransplantation Center af Northwestern University prøve tjenesteydelser. Dette arbejde er blevet delvist støttet af hjælpeansatte bestyrelsen af det nordvestlige Memorial Hospital, og et fakultet start fond fra Northwestern University til J.J..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptide array INTAVIS Bioanalytical Instruments
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
Non-fat milk Bio Rad Laboratories 1706404
TBST Santa Cruz Biotechnology 10711454001
Goat anti-human IgG–HRP  ThermoFisher Scientific A18811
Clarity Western ECL Substrate Bio Rad Laboratories 1705061
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientifics 21059
ChemiDoc gel imaging system Bio Rad Laboratories 1708265 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. (2017).
  2. Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD--the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
  3. Tait, B. D. Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 21, (5), 573-577 (2009).
  4. Tait, B. D. Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients - Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay. Front Immunol. 7, 570 (2016).
  5. Gebel, H. M., Bray, R. A. HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great? Am J Transplant. 14, (9), 1964-1975 (2014).
  6. Horton, R., et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 5, (12), 889-899 (2004).
  7. Duquesnoy, R. J. HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm. Hum Immunol. 63, (5), 339-352 (2002).
  8. Duquesnoy, R. J., Marrari, M. HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies. Curr Opin Organ Transplant. 14, (4), 403-409 (2009).
  9. Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. Chronic allograft rejection: a fresh look. Curr Opin Organ Transplant. 20, (1), 13-20 (2015).
  10. Rostaing, L. P., Malvezzi, P. HLA-Incompatible Kidney Transplantation--Worth the Risk? N Engl J Med. 374, (10), 982-984 (2016).
  11. Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant. 3, (12), 1488-1500 (2003).
  12. Haas, M. An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts. Curr Opin Organ Transplant. 19, (3), 315-322 (2014).
  13. Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem? Am J Transplant. 15, (4), 855-856 (2015).
  14. Tambur, A. R., Claas, F. H. HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about? Am J Transplant. 15, (5), 1148-1154 (2015).
  15. Robinson, J., et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).
  16. Gabriel, C., et al. HLA typing by next-generation sequencing - getting closer to reality. Tissue Antigens. 83, (2), 65-75 (2014).
  17. Liu, P., et al. A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays. Transplant Direct. 2, (11), (2016).
  18. Frank, R., Overwin, H. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).
  19. Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267, (1), 13-26 (2002).
  20. Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays. J Vis Exp. (93), (2014).
  21. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
  22. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2, (6), 1333-1349 (2007).
  23. McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes. Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).
  24. Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).
  25. Kaczmarek, I., et al. Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant. Exp Clin Transplant. 6, (3), 229-235 (2008).
  26. Claas, F. H. Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies. Curr Opin Organ Transplant. 15, (4), 462-466 (2010).
  27. Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods. Hum Immunol. 77, (4), 313-316 (2016).
  28. Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M. Conformational Biases of Linear Motifs. Journal of Physical Chemistry B. 117, (50), 15943-15957 (2013).
  29. Duquesnoy, R. J. Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity. Curr Opin Organ Transplant. 19, (4), 428-435 (2014).
  30. Lavinder, J. J., et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (6), 2259-2264 (2014).
  31. Kloetzel, P. M. Antigen processing by the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, (3), 179-187 (2001).
  32. Filippone, E. J., Farber, J. L. The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies. J Immunol Res. 2016, 5197396 (2016).
  33. Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome. Transplantation. 78, (2), 190-193 (2004).
Personlig peptid Arrays for påvisning af HLA Alloantibodies i organtransplantation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).More

Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter